Medición de la rigidez hepática mediante microscopía de fuerza atómica junto con microscopía de polarización

Resumen

Presentamos un protocolo para medir los módulos elásticos de áreas ricas en colágeno en hígado normal y enfermo utilizando microscopía de fuerza atómica. El uso simultáneo de microscopía de polarización proporciona una alta precisión espacial para localizar áreas ricas en colágeno en las secciones hepáticas.

Resumen

El endurecimiento de la matriz ha sido reconocido como uno de los principales impulsores de la progresión de la fibrosis hepática. Tiene efectos profundos en varios aspectos del comportamiento celular, como la función celular, la diferenciación y la motilidad. Sin embargo, como estos procesos no son homogéneos en todo el órgano, se ha vuelto cada vez más importante comprender los cambios en las propiedades mecánicas de los tejidos a nivel celular.

Para poder monitorear el endurecimiento de las áreas ricas en colágeno dentro de los lóbulos hepáticos, este artículo presenta un protocolo para medir los módulos elásticos del tejido hepático con alta precisión espacial mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). AFM es un método sensible con el potencial de caracterizar propiedades mecánicas locales, calculadas como módulo de Young (también conocido como elástico). La AFM junto con la microscopía de polarización se puede utilizar para localizar específicamente las áreas de desarrollo de la fibrosis en función de la birrefringencia de las fibras de colágeno en los tejidos. Usando el protocolo presentado, caracterizamos la rigidez de las áreas ricas en colágeno de hígados fibróticos de ratones y las áreas correspondientes en los hígados de ratones control.

Se observó un aumento prominente en la rigidez de las áreas positivas de colágeno con el desarrollo de fibrosis. El protocolo presentado permite un método altamente reproducible de medición de AFM, debido al uso de tejido hepático ligeramente fijo, que se puede utilizar para mejorar la comprensión de los cambios iniciados por la enfermedad en las propiedades mecánicas locales del tejido y su efecto sobre el destino de las células vecinas.

Introducción

El hígado es un órgano vital para mantener la homeostasis en los organismos ^1,2. Las enfermedades hepáticas crónicas representan ~ 2 millones de muertes en todo el mundo anualmente³. Se originan más comúnmente como infecciones virales, trastornos autoinmunes, síndromes metabólicos o enfermedades relacionadas con el abuso de alcohol y se acompañan de fibrosis hepática progresiva. La lesión hepática provoca una respuesta inflamatoria, que conduce a la activación de las células que depositan la matriz extracelular (MEC) en una respuesta de curación de heridas. Sin embargo, en presencia de un insulto crónico, el exceso de ECM forma tejido cicatricial no resuelto dentro del hígado, lo que lleva al desarrollo de fibrosis hepática, cirrosis, carcinoma hepático y, en última instancia, a insuficiencia hepática⁴.

La lesión de hepatocitos resulta inmediatamente en un aumento de la rigidez hepática ^5,6. Esto afecta directamente la función de los hepatocitos, activa las células estrelladas hepáticas (HSC) y los fibroblastos portales, y resulta en su transdiferenciación a miofibroblastos depositadores de colágeno ^7,8. La deposición de ECM fibrosa aumenta aún más la rigidez hepática, creando un bucle de retroalimentación autoamplificante de rigidez hepática y activación celular productora de matriz.

La rigidez hepática se ha convertido, por lo tanto, en un parámetro importante en el pronóstico de la enfermedad hepática. El cambio en las propiedades biomecánicas del tejido se puede detectar antes de que la fibrosis se pueda diagnosticar mediante análisis histológico. Por lo tanto, se han desarrollado varias técnicas para la medición de la rigidez hepática tanto en investigación como en aplicaciones clínicas. En entornos clínicos, la elastografía transitoria (ET)9,10,11,12,13 y la elastografía por resonancia magnética (ERM)^{14,15,16,17,18} han sido empleadas para diagnosticar de forma no invasiva estadios precocedores del daño hepático mediante el examen de la rigidez hepática macroscópica ¹⁹.

En la ET, las ondas de ultrasonido de amplitud leve y baja frecuencia (50 Hz) se propagan a través del hígado, y se mide su velocidad, que luego se utiliza para calcular el módulo elástico^{tisular 13}. Sin embargo, esta técnica no es útil para pacientes con ascitis, obesidad o espacios intercostales inferiores debido a la transmisión inadecuada de las ondas de ultrasonido a través de los tejidos que rodean el hígado⁹.

MRE se basa en la modalidad de resonancia magnética y utiliza ondas de corte mecánico de 20-200 Hz para apuntar al hígado. Luego se utiliza una secuencia específica de imágenes de resonancia magnética para rastrear las ondas dentro del tejido y calcular la rigidez del tejido¹⁶. Los valores de rigidez reportados con las técnicas TE y MRE se correlacionan bien con el grado de fibrosis hepática obtenido de biopsias de muestras de hígado humano clasificadas utilizando puntuaciones histológicas METAVIR²⁰ (Tabla 1). TE y MRE también han sido adaptados para la medición de la rigidez hepática en modelos de roedores con fines de investigación^21,22,23. Sin embargo, como ambos métodos derivan los valores de rigidez de la respuesta del tejido a las ondas de cizallamiento que se propagan, los valores obtenidos podrían no reflejar la rigidez mecánica absoluta del tejido.

Para una caracterización mecánica directa de hígados de roedores, Barnes et al. desarrollaron un ensayo modelo-gel-tejido (ensayo MGT) que involucra la incrustación de tejido hepático en gel de poliacrilamida²⁴. Este gel está comprimido por una fuerza uniforme pulsada a partir de la cual se puede calcular el módulo de Young. El ensayo de MGT muestra una buena correlación con un ensayo de indentación adaptado tanto para hígados normales como fibróticos²⁴ (Tabla 1).

Tabla 1: Valores de rigidez hepática a nivel de volumen. TE y MRE comparadas con mediciones mecánicas directas ex vivo de módulos elásticos hepáticos utilizando indentación y ensayos MGT para hígados de diferentes fuentes. La relación entre E y G viene dada por E = 2G (1 + v), donde v es la relación de Poisson de la muestra; F0 a F4 representan la puntuación de fibrosis en el sistema de puntuación METAVIR, con F0 denotando fibrosis baja o nula e hígados cirróticos F4. Abreviaturas: TE = elastografía transitoria; ERM = elastografía por resonancia magnética; MGT = modelo-gel-tejido; E = módulo elástico (de Young); G = módulo de corte. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Uno de los principales inconvenientes de las mediciones genéricas de rigidez hepática es que no proporcionan una resolución a nivel celular de la heterogeneidad de rigidez en el hígado. Durante la progresión de la fibrosis, las áreas ricas en colágeno muestran mayor rigidez en comparación con el parénquima circundante^25,26. Este gradiente de rigidez influye localmente en las células residentes y juega un papel importante en la conducción de la heterogeneidad de HSC²⁷. Por lo tanto, los cambios en las propiedades mecánicas locales durante el desarrollo de la enfermedad hepática deben caracterizarse a nivel microscópico para comprender mejor la progresión de la fibrosis.

AFM permite medir las propiedades mecánicas del tejido con alta resolución y alta sensibilidad de fuerza. AFM utiliza la punta de un voladizo para indentar la superficie de una muestra con fuerzas tan bajas como varios piconewtons, induciendo una deformación a nivel microscópico o nanoscópico basado en la geometría y el tamaño de la punta empleada. La respuesta de fuerza de la muestra a la deformación aplicada se mide entonces como la deflexión en el voladizo²⁸. Las curvas de fuerza-desplazamiento se recogen de la aproximación y retracción del voladizo, que puede equiparse con modelos mecánicos de contacto apropiados para evaluar la rigidez local de la muestra²⁹.

Además de medir la rigidez de un área determinada, AFM también puede proporcionar información topográfica sobre características específicas de la muestra, como la estructura de las fibras de colágeno^30,31,32. Múltiples estudios han descrito la aplicación de AFM para medir la rigidez de varios tejidos sanos y enfermos, como la piel 32,33, pulmón 34,35, cerebro³⁶, mamario^37,38,39, cartílago 40 o corazón^41,42,43,44 de muestras de pacientes y modelos de ratón. Además, la AFM también se ha utilizado in vitro para determinar la rigidez de células y andamios de proteínas extracelulares^45,46,47.

La medición de las propiedades mecánicas de las muestras biológicas utilizando AFM no es trivial debido a su suavidad y fragilidad. Por lo tanto, varios estudios han estandarizado diferentes condiciones y entornos, que producen valores ampliamente fluctuantes de los módulos de Young (revisado por Mckee et ^al.48). Al igual que en otros tejidos blandos, los valores del módulo de Young hepático en diferentes grados de fibrosis hepática también muestran una amplia variación (Tabla 2). Las diferencias en los valores del módulo de Young surgen de diferencias en el modo de operación de AFM, punta en voladizo, método de preparación de muestras, grosor de la muestra, profundidad y fuerzas de indentación, entorno del tejido hepático durante la medición y método de análisis (Tabla 2).

Tabla 2: Valores de rigidez hepática a nivel celular. Los valores de rigidez hepática obtenidos mediante AFM describen las propiedades mecánicas del hígado a nivel celular. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; E = módulo elástico (de Young); PFA = paraformaldehído; PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Este artículo describe un protocolo para la medición reproducible de los módulos de Young de áreas fibróticas ricas en colágeno en tejido hepático mediante AFM con una localización precisa proporcionada por el uso de microscopía de polarización. Administramos tetracloruro de carbono (CCl₄) para inducir la deposición de colágeno de manera centrilobular⁴⁹ en un modelo de ratón, imitando de manera confiable aspectos cruciales de la fibrosis hepática humana⁵⁰. Las imágenes microscópicas polarizadas permiten la visualización del colágeno en el hígado debido a la birrefringencia de las fibras de colágeno⁵¹, lo que permite el posicionamiento preciso de la punta en voladizo sobre el área de interés deseada dentro del lóbulo hepático⁵².

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo animal aprobado por el Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Genética Molecular y de acuerdo con la Directiva de la UE 2010/63 / UE para experimentos con animales. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático general del protocolo presentado.

Figura 1: Esquema general de la evaluación de AFM del módulo de Young de hígados de ratón. (A) Aislamiento del hígado de ratones control o tratados seguido de seccionamiento y almacenamiento a -80 °C (almacenamiento máximo, 2 semanas). (B) Fijación del cordón esférico al voladizo con posterior curado del pegamento durante la noche (izquierda). Calibración en voladizo seguida de montaje de muestra (derecha). (C) Alineación del polarizador y el analizador para visualizar estructuras de colágeno brillante seguido de una superposición de la imagen en la cámara con el campo de medición debajo del voladizo AFM. (D) Adquisición de mapas de rigidez y análisis. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; PBS = solución salina tamponada con fosfato; OCT = compuesto de temperatura de corte óptima; CCl₄ = tetracloruro de carbono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación de la muestra I

1. Extirpar el hígado del abdomen abierto de un ratón sacrificado por luxación cervical bajo anestesia. Aísle el lóbulo lateral izquierdo e incruste la mitad lateral del lóbulo en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) mediante congelación rápida en hielo seco. Conservar el tejido incrustado en la OCT a -80 °C.
   NOTA: Estudios previos han demostrado que los valores de rigidez son similares entre los tejidos congelados y frescos^25,26.
2. Sección de hígado de 30 μm de espesor sobre portaobjetos cargados positivamente utilizando un criotomo y almacenar los portaobjetos a -80 °C hasta el día de la medición de la AFM no más de 2 semanas después.

2. Configuración del instrumento

1. Fijación de un talón de 5,7 μm a la punta en voladizo AFM (Figura suplementaria S1, pasos 1-5)
   NOTA: La fijación de la cuenta al voladizo también fue descrita previamente por Norman et ^al.46.
   1. Extienda la suspensión de perlas de resina de melamina de 5,7 μm de diámetro uniformemente en la mitad del área de un portaobjetos de vidrio y seque al aire para evaporar el disolvente (Figura suplementaria S1, paso 1).
   2. En la otra mitad del portaobjetos, utilizando una punta de 10 μL, haga una línea delgada de resina epoxi premezclada con un tiempo de trabajo prolongado (Figura suplementaria S1, paso 1).
   3. Cargue la sonda en voladizo en el cabezal AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   4. Monte la corredera y la cubierta con el cabezal AFM equipado con la sonda en voladizo.
      NOTA: En el estudio se utilizó un voladizo SD-qp-BioT-TL-10.
   5. Lleve el pegamento de resina epoxi premezclado al centro de la diapositiva y acérquese al pegamento con el voladizo con una fuerza baja (establezca un punto de ajuste a 1 V para seguir este protocolo; Figura suplementaria S1, paso 2).
      NOTA: Antes de acercarse a la superficie de la corredera, asegúrese de que el láser esté alineado en el centro de la punta en voladizo, indicado por un voltaje de suma alta, siguiendo los pasos 6-8 en la Sección 2, Parte 3, Calibración de la constante de resorte del voladizo AFM.
   6. Después de que la punta de la sonda en voladizo haga contacto con el pegamento, muévalo justo por encima de la corredera para eliminar el exceso de pegamento.
   7. Ahora, retraiga la punta en voladizo de la diapositiva y mueva la diapositiva para colocar una sola cuenta en el centro (Figura suplementaria S1, paso 3). Acérquese de nuevo al talón con la sonda en voladizo AFM con una fuerza mayor (punto de ajuste 2 V) para fijar el cordón en el centro de la sonda en voladizo y déjelo durante al menos 10 s (Figura suplementaria S1, paso 4).
   8. Extraiga la sonda en voladizo y manténgala durante la noche a temperatura ambiente para endurecer el pegamento o siga las instrucciones para la resina epoxi (Figura suplementaria S1, paso 5).
2. Configuración del polarizador y el analizador
   1. Para localizar las áreas de interés dentro de las secciones hepáticas, configure el microscopio con el polarizador y el analizador. Alinear sus acimuts de vibración en un ángulo entre 0° y 90° entre sí girando uno de ellos con respecto al otro manualmente o de forma automatizada para minimizar la luz transmitida y maximizar los rayos extraordinarios que pasan a través del objetivo. Asegúrese de que las fibras de colágeno aparezcan brillantes sobre un fondo oscuro en la imagen polarizada (Figura 2), que se refleja mediante un desplazamiento en el pico del histograma de la imagen hacia píxeles brillantes.

Figura 2: Las imágenes representativas de microscopía muestran una visualización pronunciada de las fibras de colágeno en microscopía polarizada en comparación con las imágenes de campo claro. Las secciones hepáticas de ratones tratados con CCl₄ durante 3 semanas se sometieron a (A) microscopía de campo claro y (B) microscopía polarizada. Las fibras de colágeno birrefringentes son claramente visibles en blanco en imágenes polarizadas en comparación con las imágenes de campo claro. El cuadro rojo representa el área rica en colágeno utilizada para la medición de AFM. Los recuadros muestran vistas ampliadas del área en el cuadro rojo. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; CCl₄ = tetracloruro de carbono; CV = vena central; PV = vena porta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: Para este protocolo, el cabezal AFM se puede instalar en cualquier microscopio invertido adecuado con la posibilidad de insertar un polarizador y un analizador. El sistema debe colocarse en una unidad de aislamiento para reducir el ruido de fondo.

3. Calibración de la constante de resorte del voladizo AFM
   1. Cargue la sonda en voladizo (preparada de acuerdo con los pasos 1-8 de la Sección 2, Parte 1, Fijación de un cordón de 5,7 μm a la punta en voladizo AFM) en el cabezal AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Limpie el voladizo con etanol al 70% para evitar la contaminación del voladizo durante la medición. Lave extensamente con agua destilada para eliminar el etanol residual de la punta.
   3. Habilite el modo de contacto y seleccione el mapeo de fuerza como método de medición.
   4. Abra todas las ventanas relevantes (motores paso a paso Z, control de escenario motorizado, visor de datos, osciloscopio de mapa de escaneo forzado, alineación láser y ventana de cámara ) en las pestañas del software haciendo clic en los botones correspondientes.
   5. Monte un portaobjetos de vidrio limpio que contenga 1,2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un área de aproximadamente 2 cm x 4 cm delineada con un rotulador hidrófobo. Monte el cabezal AFM en la etapa del microscopio y asegúrese de que el voladizo esté completamente sumergido en PBS.
   6. Enfoca el objetivo en la punta en voladizo. Reduzca la intensidad de la luz transmitida en el microscopio para obtener una mejor visión de la posición del láser en el monitor.
   7. Apunte el láser al extremo translúcido del voladizo (debajo del cual se conecta el cordón esférico) y alinee el espejo usando las perillas en el cabezal AFM para maximizar la intensidad total del rayo láser en el detector (representado por la suma en la ventana Alineación láser ).
   8. Alinee el detector de fotodiodo utilizando las perillas presentes en el cabezal AFM para colocar el láser en su centro.
   9. Deje que el voladizo se estabilice durante 15 minutos antes de proceder con la calibración.
   10. Abra el Administrador de calibración e inserte el tipo de voladizo , las dimensiones del voladizo y las condiciones ambientales. Calibre la constante de resorte y la sensibilidad (también conocida como sensibilidad de palanca óptica inversa, InvOLS) haciendo clic en Calibrar. Confirme la precisión de la constante de resorte obtenida después de la calibración con la declaración del fabricante. Calibre el voladizo en modo sin contacto (la calibración se realiza mediante el software utilizando el teorema térmico derivado por Sader et ^al.58).
       NOTA: La constante de resorte del voladizo representa la rigidez del voladizo y está dada por la fuerza de resistencia del voladizo, ya que se deforma por la longitud de deformación en términos de N / m. La sensibilidad del voladizo representa el valor de la respuesta del fotodiodo (en voltios) en respuesta a la deflexión del voladizo (en nanómetros) y generalmente se presenta en términos de nm / V⁵⁹. En un modo sin contacto, el espectro de ruido térmico se registra y se equipa con la función hidrodinámica⁶⁰ mediante el software de control AFM automáticamente después de la calibración. El accesorio proporciona los parámetros de calibración, a saber, la constante de resorte y el InvOLS. La constante de resorte del voladizo SD-qp-BioT-TL-10 utilizado en este estudio fue de 0.09 N/m, según lo declarado por el fabricante.

3. Preparación de la muestra II

1. Descongele las secciones congeladas (almacenadas a −80 °C, como se describe en la Sección 1, Preparación de la muestra I) a temperatura ambiente durante 2 min.
2. Fijar las secciones con paraformaldehído (PFA) al 4% helado en 1x PBS durante 10 min a 4 °C seguido de un lavado extenso (5x) con 1x PBS. Limpie el PBS residual alrededor de la sección con un pañuelo desechable y marque un límite de aproximadamente 2 cm x 4 cm alrededor de la sección hepática con un rotulador hidrófobo. Cubra la muestra con 1x PBS (asegúrese de que el área demarcada contenga ~1.2 ml de 1x PBS). Utilice la muestra para mediciones de AFM.
   NOTA: Dado que el PFA es un producto químico peligroso, debe manejarse con cuidado para evitar el contacto con la piel o los ojos. Para evitar sus humos tóxicos, todos los procedimientos que involucran PFA deben llevarse a cabo en una campana de humos químicos certificada u otra área ventilada aprobada.

4. Medición

1. Habilite el guardado automático yendo a la pestaña Configuración y marcando Autosave. Especifique el nombre de archivo y el directorio para guardar los archivos de medición yendo a la pestaña Configuración y luego haciendo clic en Configuración de guardado.
2. Cargue la muestra (preparada de acuerdo con la Sección 3, Preparación de la muestra II). Acérquese a la superficie del tejido con el voladizo AFM encendiendo el láser y haciendo clic en la tecla de enfoque . Después de que la punta esté en contacto con la superficie del tejido, retraiga la punta en voladizo de modo que la punta permanezca en el foco del objetivo (haciendo clic en la tecla de retracción, que retrae el voladizo hasta el extremo superior del rango piezoeléctrico). Vuelva a alinear el detector si la posición del láser se aleja de su centro en la ventana Alineación láser .
3. Apague el láser y superponga el campo óptico del microscopio con mapas de medición AFM haciendo clic en la pestaña Accesorios y luego seleccionando Calibración óptica de superposición directa. En la ventana siguiente, haga clic en Siguiente para tomar una serie de imágenes del voladizo escaneando un área específica. Haga clic en Siguiente de nuevo para ir a la siguiente ventana.
4. En la primera imagen, haga clic en el centro de la punta del voladizo manualmente para representar la posición de la punta en el software. El círculo que representa la posición de la punta se puede manipular en tamaño indicando su radio para aumentar la precisión. Haga clic en Calibrar para detectar automáticamente la posición de la punta en voladizo en todas las imágenes. Confirme la precisión de la detección de puntas revisando las imágenes.
5. Haga clic en Siguiente y, a continuación, en Finalizar para finalizar la superposición óptica y guardar la serie de imágenes capturadas durante la calibración óptica.
6. Retraiga aún más el voladizo para evitar su colisión con superficies más altas en la corredera. Mueva el escenario para colocar un área rica en colágeno dentro del cuadro verde visible en la pestaña Visor de datos utilizando la imagen polarizada. Seleccione el área rica en colágeno haciendo un rectángulo a su alrededor con una pulsación prolongada en el botón izquierdo del ratón dentro del cuadro verde especificado. Defina las dimensiones, la orientación y la resolución del área seleccionada en la pestaña Cuadrícula del lado izquierdo. Haga clic en Confirmar nueva región de escaneo para establecer el área seleccionada como área de medición.
7. Mantenga los parámetros IGain y PGain del bucle de retroalimentación en los valores predeterminados, si no se presentan inestabilidades importantes en forma de sobresensibilidad del sistema. Para seguir este protocolo, establezca IGain en 50 Hz y PGain en 0.001.
8. Establezca el punto de consigna en 1 nN.
   NOTA: El punto de ajuste es la fuerza de la interacción punta-superficie durante el estado estacionario. Para la mayoría de las muestras blandas (células, geles y tejidos), los valores de consigna en el rango de 0.5-2.0 nN son apropiados.
9. Seleccione el valor de consigna relativo de acuerdo con las propiedades mecánicas del material estudiado y la rigidez del voladizo. Para este protocolo, establezca el valor en 5 nN.
   NOTA: El punto de ajuste relativo representa la fuerza máxima de interacción, cuando se alcanza el pico de la curva fuerza-distancia y el movimiento de la punta vuelve a la línea de base. Para materiales blandos (1-50 kPa), este parámetro se establece en unidades de nanonewtons (nN). Además, para un voladizo blando (con una constante de resorte de 0,05 N/m a 0,35 N/m), la fuerza máxima que se puede aplicar es de aproximadamente 50 nN. Ajuste el punto de consigna y los valores de consigna relativos en consecuencia.
   1. Asegúrese de que el valor de consigna dado no conduce a una profundidad de indentación mayor que el radio del penetrador esférico, de lo contrario la superficie de sangría no se puede definir correctamente en el cálculo del módulo de Young. Calcular el valor medio de la profundidad de sangría después de la primera ejecución de las sangrías; consulte la Sección 5, Análisis de datos, para aprender a procesar los datos registrados. Ajuste el valor de consigna si es necesario.
10. Establezca Ajustar línea base como 5.
    NOTA: Aquí, la línea base se refiere al grado de polinomio utilizado para ajustar las curvas de aproximación y retracción. Establecer la línea base en 5 ajusta las curvas a alta resolución y, por lo tanto, garantiza la captura del ruido de fondo durante las mediciones.
11. Seleccione la longitud del movimiento en voladizo en el eje Z (longitud Z) de acuerdo con la topografía de la superficie de la muestra. Para seguir este protocolo, establezca la longitud Z en 15 μm.
    NOTA: Un valor alto (por ejemplo, 15 μm) reduce la sensibilidad de medición, pero generalmente se requiere para muestras con una superficie muy irregular, como el tejido hepático fibrótico.
12. Establezca el movimiento Z en Duración constante.
    NOTA: El movimiento Z también se puede establecer en Velocidad constante para ver los datos que se refieren al movimiento Z (Extender velocidad y Extender tiempo) en un modo diferente.
13. Establezca el Extender tiempo en 1 s. Establezca Retraso de extensión y Retraso de retracción como 0.
    NOTA: Utilice velocidades de extensión de >5,0 μm/s para materiales muy blandos⁶¹, ya que las velocidades de indentación más bajas darán como resultado una respuesta más viscosa y menos elástica de las superficies blandas. El retardo de extensión y el retardo de retracción son parámetros que se pueden utilizar para estudiar la interacción específica entre la punta del voladizo y el sustrato (por ejemplo, las interacciones de una proteína inmovilizada en la superficie del voladizo con proteínas inmovilizadas en la superficie del portaobjetos).
14. Establezca la frecuencia de muestreo en 5000 Hz.
    NOTA: La frecuencia de muestreo se refiere a la frecuencia de los puntos que se registran en una curva de aproximación-retracción completa. Establezca esto en un valor alto (por ejemplo, 5000 Hz) para evitar perder ciertas regiones de las curvas debido a su transición extremadamente rápida.
15. Marque el bucle cerrado Z con un tick para habilitar un sistema de bucle de retroalimentación, que garantiza una distancia continua entre la superficie de la muestra y la punta en voladizo.
16. Desacople la etapa motorizada anulando la selección de Activar y haga clic en Enfoque para acercarse a la muestra con el voladizo. Haga clic en Iniciar escaneo para comenzar a recopilar curvas de fuerza-distancia en el área establecida en el paso 6; Sección 4, Medición.

5. Análisis de datos

1. Analice los datos adquiridos utilizando el software de código abierto "AtomicJ" (que se puede descargar desde https://sourceforge.net/projects/jrobust/).
   NOTA: Admite archivos recopilados de microscopios de fuerza atómica de Agilent Technologies, JPK Instruments o Bruker.
2. Cargue las curvas de fuerza en el programa haciendo clic en el icono de curvas y mapas de fuerza de proceso en AtomicJ (Figura suplementaria S2A, x). En el asistente de procesamiento, agregue los mapas a analizar haciendo clic en el botón Agregar (Figura suplementaria S2A, y). Haga clic en Siguiente después de cargar los mapas (Figura suplementaria S2A, z).
3. Especifique la configuración de procesamiento en la siguiente ventana de acuerdo con los pasos descritos a continuación (correspondientes a los pasos de la Figura Suplementaria S2B, pasos 1-11):
   1. Estimar el punto de contacto entre la muestra y el voladizo manualmente mediante cálculo o automáticamente utilizando un conjunto de parámetros de curva de ajuste. Para seguir este protocolo, utilice la estimación automática del punto de contacto.
   2. Determine el punto de contacto entre el voladizo y la muestra mediante el método clásico de cuadrícula enfocada.
   3. Seleccione el método de estimación para obtener la mejor determinación del punto de contacto en función de la calidad de las curvas de fuerza medidas, que debe determinarse empíricamente durante la optimización del análisis de datos. Para seguir este protocolo, utilice el método independiente del modelo.
   4. Ajuste la curva de sangría de fuerza utilizando un modelo clásico (use L2 clásica para el ajuste del modelo para seguir este protocolo).
      NOTA: El ajuste del modelo y el estimador de contacto son parámetros que rigen cómo el software ajusta las curvas y cómo se establece el punto de contacto en la curva ajustada, respectivamente. Para estas mediciones, se utilizó la opción clásica, que utiliza la regresión de mínimos cuadrados. Esto procesa cada punto de baja fuerza en la curva como un punto de contacto de prueba y ajusta un polinomio a la región antes del punto de contacto de prueba. A continuación, ajusta el modelo de contacto apropiado a los datos de sangría de fuerza recopilados. El punto que da la suma más baja de cuadrados se asume como el punto de contacto. Se pueden utilizar otros métodos basados en la calidad de las curvas de fuerza obtenidas^62,63.
   5. Establezca el ajuste del modelo en la curva Retirar .
   6. Establezca la proporción de Poisson en 0.45, como se recomienda para tejidos blandos como el hígado²⁴.
   7. Ajuste la curva utilizando un grado de referencia de 3 y un grado de contacto de 1. Cambiar el grado de ajuste polinómico en función de la escala de desviaciones de las curvas del modelo.
   8. Seleccione el modelo utilizado para ajustar las curvas de retirada. Utilice el modelo de Sneddon , que calcula el módulo de Young basado en la ecuación (1) y la ecuación (2):
      (1)
      δ = (2)
      donde F es la fuerza, E es el módulo de Young, v es la relación de Poisson de la muestra, δ es la profundidad de la hendidura, a es el radio de contacto y R es el radio de la esfera^62,63.
   9. Rellene el radio de la punta esférica en micrómetros (2,9 μm en este protocolo).
   10. Cargue la constante Spring e InvOLS desde los archivos de datos habilitando la lectura (marque las casillas).
   11. Haga clic en Finalizar.
       NOTA: Los datos analizados se presentan en forma de mapas de deflexión vertical, altura, adhesión, fuerza de contacto, deformación, fuerza de adhesión, valores de R² , pendiente, módulo de Young, sangría de transición, fuerza de transición y posición de contacto calculada para cada curva de fuerza (Figura suplementaria S3, arriba a la izquierda). Dos ventanas adicionales muestran curvas de fuerza y valores brutos (Figura suplementaria S3, paneles superior derecho e inferior, respectivamente).
4. Excluya las curvas de fuerza en las que el voladizo se acercó incorrectamente a la superficie de la sección hepática. Para identificarlos, busque curvas con alto ruido, formas aberrantes y / o enfoque incompleto, como se demuestra en la Figura 3 y se discute en detalle en otra parte⁴⁶.

Figura 3: Ejemplos de curvas representativas de fuerza-desplazamiento. (A,B) Curvas de fuerza interpretables representativas para curvas de fuerza más rígidas (A; E = 10,5 kPa) y más suave (B; E = 1,78 kPa) áreas adecuadas para el análisis. (C-F) Gráficos representativos no interpretables que deben excluirse del análisis debido a un enfoque incorrecto (C-E) o (F) mayor ruido. Como se indica en la leyenda proporcionada en (A), las curvas rojas muestran el enfoque del voladizo, y las curvas verdes muestran la retracción del voladizo. Las líneas negras muestran el ajuste de la curva de extracción del voladizo. La pendiente de las líneas negras corresponde al módulo de Young. Los puntos rojo y azul corresponden al punto de contacto y al punto de transición, respectivamente. El punto de contacto es el último punto de contacto entre el voladizo y el sustrato durante la retracción, mientras que el punto de transición describe la transición del voladizo de aproximación a retracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Secciones hepáticas levemente fijas, de 30 μm de espesor obtenidas de ratones control y de ratones con fibrosis leve o avanzada (inducida por inyección de CCl₄ durante 3 semanas o 6 semanas, respectivamente⁴⁹) se probaron con AFM como se describe en este protocolo. Se seleccionaron fibras de colágeno cercanas a las venas centrales para la medición de mapas de rigidez. Las áreas cercanas a las venas centrales, que corresponden a las áreas donde generalmente se forman las fibras de colágeno en animales tratados con CCl₄, se analizaron en hígados control (Figura 4A). La distribución de los módulos de Young fue reproducible a través de diferentes hígados de control y áreas ricas en colágeno dentro de una sola sección hepática (Figura 4B: diagrama de violín izquierdo).

En animales tratados con CCl 4, los mapas de rigidez correspondientes a las áreas pericentrales de los depósitos de colágeno mostraron valores significativamente más altos de los módulos de Young en comparación con las áreas equivalentes en ratones control (Figura 4B: 1.9 kPa vs. 2.6 kPa mediana de los valores del módulo de Young para el control vs. 3 semanas de ratón tratado con CCl 4; p = 0.07; 1.9 kPa vs. 5.1 kPa mediana Valores del módulo de Young para control vs. 6 semanas CCl₄ -ratón tratado; p = 0,02). Además, hubo un aumento significativo en los valores de los módulos de Young con un tratamiento más prolongado con CCl 4 (Figura 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa mediana de los valores del módulo de Young para 3 semanas vs. 6 semanas CCl_4-tratado ratón; p = 0,04). Esto muestra un endurecimiento gradual de los depósitos de colágeno con progresión de la fibrosis y que las mediciones de AFM reflejan la fibrogénesis.

Para evaluar el efecto del almacenamiento prolongado de secciones hepáticas incrustadas en OCT sobre las propiedades mecánicas de las fibras de colágeno, medimos la rigidez de las fibras de colágeno en secciones de ratones tratados con CCl₄, que se almacenaron a -80 ° C durante 2 semanas o 3 meses en el portaobjetos después del corte (Figura 5). Las mediciones de AFM mostraron valores significativamente más bajos de los módulos de Young en áreas ricas en colágeno para secciones almacenadas durante 3 meses en comparación con las obtenidas de secciones medidas dentro de las 2 semanas posteriores a la sección de la muestra (Figura 5; 4.7 kPa vs. 3.6 kPa mediana de los valores del módulo de Young para 2 semanas vs. 3 meses de almacenamiento; p < 0.001). Por lo tanto, es importante medir las propiedades mecánicas del tejido hepático poco después de que las secciones se preparan a partir de los lóbulos hepáticos incrustados en OCT.

Figura 4: Las mediciones de AFM revelan rigidez progresiva de las áreas ricas en colágeno que se correlacionan con el tratamiento prolongado con CCl₄. (A) Se utilizaron secciones hepáticas de ratones control y ratones tratados con CCl₄ durante 3 semanas o 6 semanas para medir las propiedades mecánicas de las áreas ricas en colágeno. Las áreas en caja de las secciones hepáticas que se muestran en las imágenes de microscopía polarizada (izquierda) son áreas de exploración ricas en colágeno (o regiones correspondientes en el hígado de control) seleccionadas para mediciones de AFM (30 μm x 100 μm, 10 píxeles x 36 píxeles). Los mapas del módulo de Young con escalas de color correspondientes a estas áreas en caja se muestran a la derecha, incluidos los histogramas de los valores del módulo de Young de estos mapas; los gráficos de dispersión de inserción muestran valores >10 kPa para cada condición. La rigidez del hígado se visualiza como un desplazamiento gradual hacia la derecha en la distribución del histograma y una mayor frecuencia de puntos en el diagrama de dispersión de recuadro. Barra de escala = 20 μm. (B) Los diagramas de violín muestran la distribución de los módulos elásticos de tres áreas medidas para cada condición (izquierda) y los valores de módulos elásticos resumidos de los tres mapas (derecha). Los diagramas de violín muestran la mediana (línea roja), el percentil 25 y^{el percentil} 75 (líneas negras); Los puntos representan los valores medios de los mapas individuales de las áreas 1-3. Los valores p presentados se calcularon mediante una prueba t de Student realizada en medias. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; CCl₄ = tetracloruro de carbono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: El almacenamiento prolongado de secciones hepáticas conduce a una disminución de la rigidez de las áreas ricas en colágeno. Se utilizaron secciones hepáticas (preparadas a partir de ratones tratados con CCl₄ durante 2 semanas) almacenadas a -80 °C durante 2 semanas o 3 meses para medir el módulo de Young. Imágenes de microscopía polarizada (izquierda) con cuadros que indican las áreas ricas en colágeno utilizadas para la medición de AFM (30 μm x 100 μm, 10 píxeles x 36 píxeles). Mapas de módulo de Young correspondientes con escalas de color (derecha). Los histogramas muestran los valores del módulo de Young recogidos de 4-6 áreas en cada muestra; Los gráficos de dispersión insertados muestran valores >10 kPa para cada condición. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; CCl₄ = tetracloruro de carbono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Método para modificar el voladizo con una microperla de resina de melamina. (A) El esquema dibujado ilustra la fijación de una cuenta esférica a la punta del voladizo. Para obtener una descripción paso a paso, consulte la Sección 2, Parte 1, Fijación de un cordón de 5,7 μm a la punta en voladizo AFM. (B) Imagen microscópica de una cuenta esférica de 5,7 μm unida a la punta en voladizo que se muestra desde la vista superior (izquierda) y lateral (derecha). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; RT = temperatura ambiente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Análisis de datos en AtomicJ. (A) La secuencia de pasos a seguir para abrir mapas de rigidez en AtomicJ. Un solo clic izquierdo en las curvas de fuerza de proceso y los mapas (x) abre el asistente de procesamiento. Los archivos se pueden cargar en el asistente de procesamiento haciendo clic en agregar (y) y seleccionando los archivos requeridos. Haga clic en siguiente (z) para continuar con el siguiente paso. (B) Parámetros para el ajuste de curvas, modelo de mecánica de contacto apropiado y ajustes de AFM utilizados durante la medición. Los pasos 1-11 se refieren a los subpuntos correspondientes detallados en el paso 3 del protocolo, Sección 5, Análisis de datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Esquema de los datos analizados en AtomicJ. La vista previa de los datos analizados muestra mapas de rigidez (ventana superior izquierda), curvas de fuerza (ventana superior derecha) y datos sin procesar (ventana inferior). Abreviatura: AFM = microscopía de fuerza atómica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo presentado proporciona un método reproducible paso a paso para la medición de AFM de tejido hepático de ratón normal y fibrótico. La microscopía de polarización acoplada proporciona una alta precisión espacial y permite la visualización de las fibras de colágeno debido a su birrefringencia. Además, se proporciona una descripción detallada del análisis de las curvas de fuerza obtenidas. La medición de la rigidez de AFM se puede realizar a nivel celular, lo que permite controlar los cambios locales en las propiedades mecánicas del tejido hepático debido al desarrollo de la enfermedad fibrótica. La fibrosis hepática no es un proceso homogéneo que afecta a todo el órgano. Por el contrario, las áreas de septos fibróticos ricos en colágeno se intercalan con áreas de bajos o ningún depósito de colágeno. Por lo tanto, los cambios de rigidez son específicos del microambiente local y solo afectan a las células localmente en contacto con áreas dañadas por una lesión. Esta microescala de heterogeneidad de rigidez también es evidente en los detalles de los mapas de módulo de AFM Young, donde los puntos de alta rigidez bordean las áreas de rigidez casi normal. Esta variación muestra que incluso el área de tejido cicatricial de colágeno no es mecánicamente homogénea y requiere que la medición de AFM se caracterice a nivel celular (Figura 4).

El protocolo presentado permite las mediciones de la rigidez hepática por AFM independientemente de la colección hepática, ya que los lóbulos hepáticos enteros incrustados en OCT pueden almacenarse durante un período prolongado a -80 ° C. Sin embargo, una vez que se secciona el tejido, recomendamos medir las muestras dentro de ~ 2 semanas, ya que hemos observado un ablandamiento gradual de las secciones de tejido almacenadas durante períodos de tiempo más largos (Figura 5).

El AFM equipado con microscopía de polarización permite localizar con precisión el área de interés dentro de la estructura del lóbulo hepático. Sin embargo, también tiene algunas limitaciones que deben considerarse al interpretar los resultados. Los valores de rigidez obtenidos aquí se midieron a temperatura ambiente. Suponemos que los efectos de la temperatura sobre las propiedades mecánicas de los tejidos blandos serán pequeños; Sin embargo, esta podría ser una de las razones de las diferencias entre los valores in vivo informados de las propiedades mecánicas de los tejidos hepáticos y los valores de este estudio.

Además, este protocolo permite el análisis de AFM del tejido hepático durante un máximo de 3 h, lo que requiere una fijación leve del tejido. La fijación leve de las secciones de tejido, así como el ciclo de congelación-descongelación, probablemente afectarán los valores absolutos del módulo de Young. Por lo tanto, los valores reportados de los módulos de Young pueden diferir de los valores in vivo . Se necesitan más estudios para optimizar el protocolo para la medición de los valores absolutos del módulo de Young a partir de secciones hepáticas, lo que puede lograrse mediante un método diferente para la fijación del tejido hepático⁶⁴.

No obstante, observamos un aumento de la rigidez de las áreas ricas en colágeno en los hígados de ratones tratados con CCl₄ durante 3 semanas en comparación con 6 semanas. Tales cambios corresponden a la progresión de la fibrosis durante la lesión prolongada (Figura 4) y muestran que las diferencias relativas pueden ser probadas entre diferentes tratamientos utilizando el protocolo presentado. Esto está de acuerdo con las observaciones de Calò et al., quienes mostraron que las secciones hepáticas ligeramente fijas muestran diferencias similares en los valores de rigidez entre las áreas ricas en colágeno y carentes de colágeno que en el tejido fresco²⁵.

Utilizamos el voladizo SD-qp-BioT-TL-10 (constante de resorte teórica ~0.09 N / m) modificado con una punta esférica de 5.7 μm de diámetro para minimizar la interrupción mecánica del tejido hepático durante las mediciones. Un cordón de 5,7 μm permitió una hendidura suficiente de la muestra para sondear su rigidez preservando su integridad. Se puede usar una cuenta con un diámetro más pequeño, después de varias optimizaciones, para obtener una mayor resolución en los mapas de rigidez, pero podría conducir a una mayor sobreestimación de los valores del módulo de Young (para más detalles, ver Crichton et ^al.65). Usando el conjunto de talón en voladizo especificado, pudimos caracterizar la rigidez de la muestra en un amplio rango, desde decenas de unidades de Pa hasta ~ 100 kPa.

El modelo de Sneddon se utilizó para derivar el módulo de Young a partir de curvas de fuerza, ya que permite el análisis de hendiduras profundas con sondas coloidales⁶². El modelo de Sneddon, a diferencia del modelo de Hertz, no sufre de la restricción de que el radio de contacto debe ser mucho menor que el radio de la esfera. Además, asume que el espesor de la muestra es varias veces mayor que la profundidad de hendidura^30,66. En el presente estudio, la hendidura fue de ~2 μm con un tamaño de perla de 5,7 μm y un espesor de muestra de 30 μm en áreas ricas en colágeno; por lo tanto, el modelo de Sneddon era apropiado. Otros modelos⁶³ considerando la fuerza de adhesión entre la punta y el sustrato pueden ser utilizados para diferentes tipos de tejidos.

El análisis en AtomicJ implementa correcciones para el espesor finito de las muestras para minimizar la contribución de un sustrato mientras deriva el módulo de Young^62,67. En el análisis de las curvas de fuerza obtenidas, utilizamos una única relación de Poisson de 0,45, que ha sido previamente recomendada para órganos de tejidos blandos²⁴. Esta aproximación no tiene un efecto significativo en los valores calculados del módulo de Young, ya que el cambio en el valor de la relación de Poisson de 0,4 a 0,5 resulta sólo en una disminución de 0,893x en los valores del módulo de Young calculados de acuerdo con la ecuación de Sneddon. Dadas las múltiples diferencias en el módulo de Young entre las diferentes duraciones de los tratamientos con CCl₄, los errores producidos al aproximar la relación de Poisson son solo marginales.

Se utilizaron curvas de retirada para calcular los valores de rigidez, ya que estábamos interesados en la respuesta elástica del tejido a la carga proporcionada por el voladizo más que en la respuesta plástica a la hendidura⁶⁸. Debido a la respuesta viscoelástica del tejido blando, el ajuste de curvas de retirada podría sobrestimar el módulo de Young, lo que debe tenerse en cuenta. Además, hemos observado que el análisis de datos con curvas de aproximación arroja tendencias similares en los valores de rigidez entre las áreas fibróticas y control, aunque los valores absolutos son correspondientemente más bajos (datos no mostrados).

Al optimizar el protocolo, identificamos varios pasos críticos para la reproducibilidad de las mediciones. Primero, es importante asegurarse de que la cuenta esté aproximadamente en el centro de la punta translúcida mientras se conecta al voladizo. Esto evita un posible desequilibrio mecánico durante la hendidura. En segundo lugar, durante la fijación hepática con PFA, es necesario seguir estrictamente los límites de tiempo para la descongelación y la fijación. Cambiar el tiempo de este paso podría afectar gravemente las propiedades mecánicas de las secciones de tejido. En tercer lugar, el voladizo debe calibrarse repetidamente con monitoreo continuo e ingreso de valores de temperatura concurrentes para evitar que ocurran artefactos en valores de rigidez debido a fluctuaciones de temperatura. Por último, una sola sección hepática no debe medirse durante más de 3 h desde la preparación, ya que el PBS superpuesto puede evaporarse durante períodos más largos. Los lectores pueden consultar la tabla de resolución de problemas (Tabla 3) para resolver los problemas encontrados durante la medición de AFM, también discutida en detalle en Norman et al.46.

Tabla 3: Guía de solución de problemas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

El protocolo presentado permite el sondeo reproducible de AFM del tejido hepático. Tiene el potencial de revelar información sobre el desarrollo y la eventual regresión de la enfermedad hepática fibrótica a nivel microscópico y puede contribuir al desarrollo de terapias dirigidas a las regiones cicatriciales fibróticas formadas durante la progresión de la enfermedad hepática crónica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cabezal AFM	Bruker	JPK nanowizard 3
Cámaras	Andor	Zyla 5.5 USB (sCMOS, refrigerado por agua)
	The Imagingsource	S/N:12310015
Voladizo	SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensores	S/N:73750F05
Cryotome	Leica	CM1950
Pegamento de resina epoxi (tiempo de trabajo prolongado)	Bison epoxi universal
Perlas de melamina; diámetro, 5,7 mmm	Micropartículas, GmbH	MF-R-5.7
Microscopio	Olympus	IX81
Hydrophobic  marcador de diapositivas	SuperHT	PAP PEN
Software	JPK nanowizard  v6.1.151
	AtomicJ v2.3.1
Correderas Superfrost	Thermoscientific	ref no. J1800AMNZ
Sistema	Ubuntu 14.04.5 LTS Control de aislamiento de
vibraciones unidad	de mesa	AVI-200-S