Síntesis de nanogeles sensibles a estímulos mediante reticulación acuosa en un solo paso y co-nanopolimerización

Resumen

Los nanogeles son una plataforma de nanopartículas excelente y versátil para la administración de productos biológicos. Los nanogeles poliméricos basados en poli(etilenglicol) que responden a los estímulos, capaces de encapsular cargas útiles basadas en proteínas, se sintetizaron utilizando una estrategia de conanopolimerización reticulada de un solo paso en condiciones acuosas. Aquí se presenta la fabricación y caracterización óptimas de estas nuevas nanopartículas.

Resumen

Los nanogeles que consisten en nanopartículas poliméricas reticuladas se han desarrollado para la administración de numerosas terapias químicas y biológicas, debido a su versátil síntesis ascendente y biocompatibilidad. Si bien hasta la fecha se han empleado varios métodos para la síntesis de nanogeles, muy pocos lo han logrado sin el uso de solventes orgánicos agresivos o altas temperaturas que pueden dañar la integridad de la carga biológica. Por el contrario, la metodología presentada aquí logra la síntesis de nanogeles cargados de proteínas de tamaño inferior a 100 nm utilizando condiciones de reacción suaves. Aquí, presentamos un método para la encapsulación no covalente de cargas útiles basadas en proteínas dentro de nano-geles que se sintetizaron utilizando una técnica de copolimerización reticulante de un solo paso de base acuosa. En esta técnica, inicialmente unimos electrostáticamente una carga útil basada en proteínas a un monómero catiónico de amonio cuaternario y, simultáneamente, la reticulamos y copolimerizamos utilizando persulfato de amonio y N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina para formar nanogeles que atrapan la carga útil de proteínas. El tamaño y el índice de polidispersidad de los nanogeles se determinan mediante dispersión dinámica de luz (DLS), mientras que la morfología de la superficie se evalúa mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). La masa de proteína atrapada dentro de los nanogeles se determina calculando la eficiencia de encapsulación. Además, la capacidad de liberación controlada de los nanogeles a través de la degradación gradual de los elementos estructurales redox también se evalúa en ensayos de biorreducción. Proporcionamos ejemplos de datos de optimización de nanopartículas para demostrar todas las advertencias de la síntesis y caracterización de nanogeles utilizando esta técnica. En general, se obtuvieron nanogeles de tamaño uniforme con un tamaño promedio de 57 nm y un valor de índice de polidispersidad de 0,093. Se logró una alta eficiencia de encapsulación del 76%. Además, los nanogeles mostraron una liberación controlada de hasta el 86% de la proteína encapsulada mediante la degradación gradual de nuevos componentes sensibles a redox en presencia de glutatión durante 48 h.

Introducción

Los nanogeles son hidrogeles tridimensionales de tamaño submicrónico con estructuras de red de polímeros reticulados que pueden contener grandes cantidades de fluidos dentro de su capa central sin afectar su integridad morfológica^. En general, los nanogeles se sintetizan por polimerización de monómeros funcionales mediante reticulación física o química en sistemas coloidales heterogéneos, como las microemulsiones inversas de agua en aceite ^2,3. Los copolímeros anfifílicos pueden autoensamblarse en estructuras a nanoescala en entornos acuosos. Sin embargo, deben estabilizarse utilizando estrategias de reticulación química que involucren disulfuros o acoplamiento basado en amidas, química de clic, o pueden ser inducidos físicamente (estrategias hidrofóbicas, electrostáticas o de enlace de hidrógeno) o fotoinducidos⁴. Entre estas estrategias, se ha descrito el autoensamblaje físico de polímeros seguido de reticulación química como una técnica exitosa de fabricación de nanogeles⁵. Si bien históricamente, el primer nanogel fue introducido en la década de 1990 por Vingradov et ^al.6, Akiyoshi et ^al.7 y Lemieux et ^al.8, últimamente se han desarrollado y explorado una variedad de nanogeles inteligentes compuestos por polímeros naturales y sintéticos para diversas aplicaciones biomédicas⁹.

Los nanogeles poseen una amplia capacidad de retención de carga, una gran superficie, estabilidad in vivo, así como propiedades químicas y mecánicas personalizables¹⁰. La síntesis de nanogeles también es escalable y puede ser acuosa. Además, el mayor contenido de agua de los nanogeles los convierte en portadores eficaces de cargas biológicas sensibles¹¹. Además, la gran superficie puede satisfacer múltiples necesidades de bioconjugación, lo que permite la fijación de modalidades de focalización para permitir la focalización activa. En particular, la versatilidad del diseño de nanogeles permite el uso de una amplia gama de monómeros que responden a estímulos y que permiten un control preciso de sus propiedades fisicoquímicas⁹. Esta ingeniería única permite la mejora racional del diseño de nanogeles, que es difícil de lograr con liposomas, micelas o polimerosomas utilizados convencionalmente ^12,13. Al incorporar fracciones que responden a estímulos dentro de monómeros específicamente diseñados, los nanogeles pueden diseñarse para desencadenar la liberación controlada de su carga útil en respuesta a diversos estímulos fisiológicamente relevantes, como el pH, las condiciones redox, las enzimas, ^etc.9,14. Estos nanogeles inteligentes son más útiles que los nanogeles convencionales, ya que poseen una estabilidad superior para una circulación sanguínea prolongada y pueden soportar condiciones fisiológicas para mantener la integridad de su carga y mediar su liberación controlada en los sitios objetivo deseados¹⁵. De hecho, debido a su naturaleza versátil, los nanogeles han ganado terreno en el ámbito biomédico, con avances notables en el desarrollo de nanogeles que responden a estímulos para numerosas aplicaciones teranósticas y diagnósticas ^2,16,17.

Los productos biológicos pueden representar una categoría de productos farmacéuticos que consisten en proteínas, péptidos y/o ácidos nucleicos y han revolucionado el panorama terapéutico debido a su notable selectividad, convirtiéndose así en la clase terapéutica de más rápido crecimiento¹⁸. De hecho, el creciente mercado de este tipo de terapias es evidente en el fuerte aumento de su aprobación por parte de la Asociación Federal de Medicamentos de EE. UU. (FDA), donde los productos biológicos representaron ~40% del total de aprobaciones de medicamentos, en 2023¹⁹. Además de su especificidad y potencia, los rápidos descubrimientos de nuevas dianas farmacológicas, procesos de bioingeniería más eficientes y un mayor conocimiento del destino in vivo de estas terapias han llevado a un mayor uso de estas terapias²⁰. Los productos biológicos tradicionales incluyen ARN interferente, proteínas de reemplazo, citocinas y hormonas que generalmente se generan utilizando la tecnología de ADN recombinante²¹. Desde la aprobación de la insulina recombinante humana en 1982, se han desarrollado productos biológicos para muchas afecciones, como el cáncer (p. ej., trastuzumab, avelumab), la enfermedad inflamatoria intestinal (p. ej., adalimumab, certolizumab) y enfermedades genéticas raras (p. ej., mipomersan, myozyme, aldurazyme, fabrazyme)²¹. Si bien la alta especificidad de las interacciones de los productos biológicos con sus dianas debería, en teoría, compensar cualquier efecto fuera de la diana, han surgido varias preocupaciones clínicas con su uso en relación con los efectos secundarios no deseados²². Estos efectos secundarios se pueden agrupar en dos categorías, que incluyen farmacología exagerada (sobreestimulación de los objetivos) e inmunogenicidad. Además, su corta vida media, su limitada biodisponibilidad, su daño a la proteasa, su corta vida útil y sus costosos procesos de producción limitan sus beneficios terapéuticos²¹. Los métodos convencionales para mitigar estos problemas implican la modificación covalente de estos productos biológicos que pueden comprometer su función y, por lo tanto, su eficacia²³. Por otra parte, el enfoque de la nanomedicina para encapsular cargas terapéuticas puede conferir numerosas ventajas a las propiedades farmacológicas, la más importante, la orientación pasiva al sitio inflamado a través del efecto de permeación y retención mejoradas (EPR)²⁴. Otros beneficios asociados a las nanopartículas pueden incluir tiempos de circulación mejorados, tasa de aclaramiento reducida, mayor flexibilidad de la formulación, mejor permeabilidad de la vasculatura y absorción celular²⁵. Si bien actualmente se está investigando una gran variedad de formulaciones de nanopartículas para la entrega de cargas biológicas, pocas pueden emular la multifuncionalidad de los nanogeles. De hecho, los nanogeles superan las capacidades de carga alcanzadas por las nanopartículas basadas en liposomas y micelas, y exhiben una mayor estabilidad coloidal que la mayoría de las nanopartículas inorgánicas. Como tales, los nanogeles presentan una valiosa plataforma para la administración de diversas terapias biológicas.

Anteriormente, hemos entregado con éxito una enzima antioxidante dentro de nuevos nanogeles poliméricos reticulados que responden a la metaloproteinasa de la matriz, donde la estrategia de encapsulación suave utilizada mantuvo la bioactividad de la proteína al liberarse²⁶. En este trabajo, demostramos la síntesis optimizada de nanogeles redox para la entrega de cargas útiles basadas en proteínas. En particular, la metodología sintética permite la síntesis de nanogeles en condiciones suaves para encapsular la carga útil deseada, sin el uso de disolventes orgánicos agresivos ni altas temperaturas. Explotamos la homeostasis redox dentro del entorno intracelular para regular la liberación de la carga útil encapsulada^27,28. Típicamente, el antioxidante naturalmente abundante glutatión (GSH) controla los potenciales redox extracelulares e intracelulares, donde su concentración oscila entre 2-20 μM y 1-10 mM, respectivamente^29,30. Hasta la fecha, se han descrito numerosas nanopartículas sensibles a redox, lo que la convierte en una estrategia probada y fiable para permitir la liberación controlada de fármacos in vivo^27,28. De hecho, los enlaces disulfuro se han instalado dentro de nanomateriales poliméricos mediante el uso de reticulantes que contienen disulfuro^31,32, el autoensamblaje de polímeros biodegradables a partir de monómeros que contienen disulfuro³³ y profármacos poliméricos sensibles a redox o conjugados fármaco/polímero^34,35. Por lo tanto, este estudio investiga la incorporación de un reticulante de disulfuro único y altamente sensible a GSH dentro de las nanopartículas poliméricas, lo que permite la liberación controlada de una carga útil de proteína encapsulada.

En este estudio, el diseño de nanogeles se centró en los siguientes criterios para abordar la especificidad y la entrega de la carga útil: tamaño pequeño (~100 nm) y una distribución de tamaño uniforme (índice de polidispersidad (PI)<0,3) para garantizar una penetración eficiente del endotelio y estabilidad in vivo ²⁷; encapsulación eficiente de la carga útil de proteínas y liberación controlada de la carga útil en respuesta a GSH. Informamos de la síntesis de nanogeles reticulados sensibles a GSH, que demostraron nanopartículas homogéneas de tamaño inferior a 100 nm, con una eficiencia de encapsulación del 76% de la carga proteica deseada.

Protocolo

1. Síntesis de un reticulante redox sensible

1. Añadir clorhidrato de 2-aminoetilmetacrilato (44,79 mg, 0,270 mmol) y 0,063 mL de trietilamina a 3 mL de diclorometano anhidro y dejar mezclar durante 20 min bajo un gas N₂ inerte en un matraz de fondo redondo de 25 mL.
2. Disolver el éster di-N-succinimidilo del ácido di-N-succinimidilo (100 mg, 0,045 mmol) en 1 mL de diclorometano anhidro y añadirlo al matraz.
3. Añadir 4 mL de diclorometano anhidro al matraz. Envuelva el matraz de reacción en papel de aluminio y déjelo remover a temperatura ambiente.
4. Confirme la formación del producto mediante cromatografía en capa fina. Asegúrese de que las referencias sean correctas para el material de partida al tiempo que confirma la formación del producto por este método.
   1. La cromatografía en capa fina es un método basado en la afinidad que se utiliza para separar los compuestos deseados de la mezcla de reacción. Aquí, utilice la placa de sílice altamente polar y adsorbente como fase estacionaria. Coloque la muestra de material de partida y la muestra de mezcla de reacción en un extremo de la placa de sílice y colóquela verticalmente en un vaso de precipitados de vidrio cerrado con el eluyente (fase móvil: metanol al 5%: diclorometano).
   2. Por acción capilar, la fase móvil se desplaza hacia arriba por la placa de sílice y los compuestos de la muestra migran distancias variables dependiendo de sus afinidades por las fases estacionaria y móvil. Cuando el^{frente del} disolvente haya cruzado 3/4 de la placa, retire la placa y séquela. Los compuestos separados aparecen como manchas en la placa. Cuantifique el factor de retención (R_f) del compuesto deseado como la distancia recorrida por el compuesto/distancia recorrida por el disolvente. En este caso, el R_f del producto fue de 0,35. Se puede utilizar luz ultravioleta o tinción para visualizar las manchas (permanganato de potasio).
5. Concentrar la mezcla al vacío y purificar mediante cromatografía en columna flash (mezcla isocrática de metanol al 5%: diclorometano)³⁶. Introducir la mezcla de reacción en la parte superior de una columna de vidrio rellena de sílice (fase estacionaria) y luego eluir con el sistema de disolvente (fase móvil)³⁶. Recoja todas las fracciones y ensaye usando TLC para distinguir las fracciones del producto usando el valor R_f determinado previamente.
6. Concentre las fracciones purificadas evaporando el disolvente con un evaporador rotativo (temperatura: 40 °C), ajuste la presión de vacío a la presión atmosférica para eliminar primero el diclorometano de menor punto de ebullición. Cuando el nivel del solvente deje de disminuir, ajuste la presión de vacío a 337 mbar para eliminar el metanol y obtener un aceite de color amarillo pálido, que luego se someterá a una caracterización adicional para confirmar la formación del producto³⁷.
7. Realice análisis infrarrojos por transformada de Fourier (FT-IR)³⁸, ^{RMN de 1}H (en dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d ₆)⁾³⁹, RMN³⁹ de ¹³C y análisis de tiempo de vuelo de desorción/ionización por láser asistido por matriz (MALDI-ToF)⁴⁰ para confirmar la formación del producto antes de realizar los siguientes pasos.
   1. Para el análisis FT-IR, cargue 1 mg de aceite en el instrumento para obtener los espectros.
   2. Para los análisis de RMN, vuelva a disolver 10 mg del producto en 0,75 ml del disolvente de RMN correspondiente, transfiéralo a un tubo de RMN y selle herméticamente para evitar fugas. Cargue la muestra en el instrumento de RMN, después de lo cual se obtienen los espectros³⁹.
   3. Para el análisis de espectrometría de masas, selle 1 mg del producto en un vial, disuélvalo en DMSO y cárguelo en el instrumento.
      NOTA: El análisis infrarrojo proporciona información sobre los grupos funcionales clave en el producto deseado, a saber, los tramos de carbonilo (C = O) identificados por el pico agudo a 1650 ^cm-1 indican la formación del enlace amida, destacando así la formación del producto. La RMN ¹H y la ¹³C proporcionan información sobre los entornos químicos y, por lo tanto, se pueden utilizar para determinar la composición química del producto deseado mediante la identificación de los entornos químicos presentes en el compuesto. Finalmente, el uso de la espectrometría de masas puede verificar la masa exacta del producto deseado.

2. Pruebe la escisión del reticulante de disulfuro con glutatión

1. Incubar el reticulante de disulfuro (hasta una concentración final de 4,55 mg/mL) con el agente reductor glutatión (final [GSH]: 10 mM), hasta un volumen final de 1 mL, durante 24 h en un vial de vidrio de 1,5 mL.
2. Para confirmar la escisión del enlazador de disulfuros, envíe el vial para el análisis MALDI-ToF^26,40.

3. Síntesis de nanogeles sensibles a redox

1. Asegúrese de que toda la cristalería que se utilizará para la reacción esté libre de polvo lavándola con agua desionizada filtrada (0,20 μm) y secándola posteriormente con aire comprimido al que se pueda acceder a través de la utilidad de aire comprimido en el lateral de la campana extractora. Coloque una boquilla segura en la salida de aire comprimido para facilitar el acceso. Sujete el vial de forma segura y coloque la boquilla en él. Active el aire comprimido, liberando un chorro controlado en el vial. Observe el proceso para garantizar un secado eficaz, comprobando si quedan contaminantes o humedad.
2. Prepare un vial de vidrio de 10 ml llenándolo con agua desionizada y selle el matraz con un tabique de goma. Desoxigena el agua burbujeando N₂ a través de ella durante al menos 30 minutos antes de comenzar la reacción. Para hacer esto, llene un globo con gas N₂ y coloque una aguja en el globo; colóquelo en el tabique y use la aguja para perforar el tabique de goma y permitir el flujo de N₂ . Coloque una aguja de salida en el matraz para asegurar un flujo constante de N₂.
3. Disuelva la albúmina sérica bovina (BSA; 2 mg, 30 nmol) o BSA marcada con Cy7 (2 mg, 30 nmol) en 1 mL de agua desoxigenada desionizada y agréguela a otro vial de vidrio limpio de 10 mL.
4. Añada la solución de [2-(acriloiloxi)etil]trimetilamonio (AETC) (12,00 mg/10,86 μL, 0,060 mmol) al matraz y séllelo con otro tabique de goma. Asegúrese de que la mezcla de reacción se mantenga bajo un flujo constante de gas N₂ y revuelva durante 30 minutos.
5. Disuelva la acrilamida (9,21 mg, 0,13 mmol) en 1 ml de agua desoxigenada desionizada y añádala a la mezcla en el vial.
6. Disuelva el reticulante de disulfuro (4,44 mg, 0,004 mmol) en 1 mL de agua desionizada y añádalo a la mezcla en el vial. Enjuague la mezcla con gas N₂ durante 20 min.
7. Disuelva el dodecil sulfato de sodio (2 mg, 0,007 mmol) en 1 mL de agua desoxigenada desionizada y agregue a la mezcla a través de una jeringa enjuagada con gas N₂ y revuelva la mezcla durante 30 min.
   NOTA: Al enjuagar la jeringa con N₂ , minimizamos la exposición de la mezcla de reacción al oxígeno en la atmósfera, lo que puede inhibir la reacción de polimerización radical.
8. Agregue N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (1,5 μL, 0,010 mmol) y deje que la mezcla de reacción se desoxigene durante 3 min bajo gas N₂ .
9. Disuelva el persulfato de amonio (1 mg, 0,004 mmol) en 1 mL de agua desoxigenada desionizada y agréguelo a la mezcla de reacción. Asegúrese de que el gas N₂ burbujee a través de la mezcla de reacción durante 10 minutos.
   NOTA: Si se omite el paso de adición de N₂ , es probable que se formen partículas blancas en el matraz de reacción. Se trata de partículas y/o agregados de mayor tamaño y pueden confundir cualquier caracterización posterior.
10. Sellar el matraz bajo una atmósfera N₂ y dejar remover durante 3 h y 30 min a temperatura ambiente.
11. Para finalizar la reacción, retire el sello del matraz y deje que la mezcla de reacción revuelva durante al menos 10 minutos. Esto expondría la mezcla de reacción a niveles atmosféricos de gas_O2 , que luego apagaría los radicales restantes en la mezcla de reacción. La reacción termina cuando la mezcla asume una apariencia opalescente azul claro.
12. Para purificar los nanogeles, agregue la mezcla de reacción a una unidad de filtro centrífugo de 15 mL (100 kDa MWCO) y agregue agua desionizada para llenar la unidad centrífuga. Centrifugar la mezcla de reacción a 1000 x g durante 10 min. Esto eliminará cualquier producto químico no reaccionado (o carga útil no encapsulada) que sea inferior a 100 kDa y concentrará la muestra de nanogel.
13. Una vez que disminuya el nivel de agua en la unidad centrífuga, agregue 2 mL de agua desionizada para diluir la muestra de nanogel y centrifugar para concentrar el producto. Repita este paso 3 veces.
14. Almacene la muestra a 2-8 °C para evitar la degradación de la proteína encapsulada.
15. Realizar análisis de FT-IR y RMN ^{de 1}H (en dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d ₆)) para confirmar la polimerización^39,41. Para preparar la muestra, liofilice 1 mL de la solución de nanogel en un vial de 1,5 mL. El proceso de liofilización consiste en congelar la muestra y luego aplicar un vacío para eliminar el solvente congelado a través de la sublimación, dejando un residuo en polvo. Después de la liofilización, vuelva a disolver la muestra en el disolvente de RMN correspondiente, transfiéralo a un tubo de RMN y séllelo herméticamente. Cargue la muestra en la máquina de RMN, como se describió anteriormente³⁹. Para el análisis FT-IR, se debe cargar 1 mg del polvo seco en el instrumento para obtener los espectros.

4. Caracterización morfológica de nanogeles

1. Dispersión dinámica de la luz (DLS)
   NOTA: El diámetro hidrodinámico (nm), el índice de polidispersidad (PI) y el potencial zeta se midieron a 25 °C, 632,8 nm de longitud de onda láser y detector de señal de 173° utilizando una máquina DLS. Cada ejecución midió 25 ciclos de subescaneo.
   1. Medición del tamaño hidrodinámico (nm)
      1. Prepare una cubeta o una celda capilar plegada desechable limpiándola con agua desionizada filtrada. Sople aire comprimido en la cubeta (adecuado para mediciones de potencial DLS y zeta) para asegurarse de que esté libre de partículas de polvo grandes.
      2. Llene la cubeta con al menos 50-100 μL de la muestra y diluya en 750-1000 μL de agua desionizada filtrada. Mientras usa una cubeta de potencial zeta, asegúrese de que la cubeta se haya llenado con muestra sin formación de burbujas, lo que puede perturbar las mediciones.
      3. Coloque la cubeta dentro del instrumento DLS, asegurándose de que se haya insertado correctamente. Para ello, abra la tapa del compartimento de muestras del instrumento DLS. Sujete la cubeta por los bordes superiores para evitar huellas dactilares en las ventanas ópticas. Asegúrese de que la cubeta esté correctamente asentada en el soporte de la cubeta, asegurándose de que esté nivelada y alineada con la trayectoria óptica del instrumento. Cierre el compartimento de muestras para evitar interferencias con la luz ambiental.
         NOTA: El medio de dilución se filtra con un filtro de jeringa de 0,45 μm de tamaño de poro.
      4. Haga clic para iniciar la medición del tamaño de partícula en el software de la máquina DLS correspondiente.
      5. Seleccione los resultados correspondientes a la muestra para obtener el promedio z (tamaño de partícula promedio), PI promedio, kilo-recuentos por segundo (kcps), potencial zeta y gráficos relevantes. Asegúrese de que la función de correlación exhiba una curva sigmoidal suave, ya que esto sugiere una muestra uniforme.
      6. Una vez completado el análisis, retire la cubeta del DLS.
2. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
   1. Prepare las muestras colocando 10 μL de la solución de nanopartículas (0,077 mg/mL) en rejillas de cobre recubiertas de carbono. Secar al aire a temperatura ambiente durante 1 h.
   2. Lavar las rejillas con agua desionizada filtrada y teñir con 5 μL de acetato de uranilo filtrado al 1% en agua durante 2 min.
   3. Después de remojar el exceso de agente manchante con papel de filtro, seque las rejillas durante la noche a temperatura ambiente. Captura imágenes TEM al día siguiente con un aumento de 45.000x con una cámara de campo claro.
   4. Utilice el software proporcionado para el procesamiento de imágenes (resolución: 2048 x 2048 píxeles).

5. Cuantificación de la proteína (BSA) encapsulada en los nanogeles mediante un ensayo de ácido microbicinconínico (BCA)

1. De acuerdo con el protocolo de ensayo microBCA (proporcionado en el sitio web del fabricante), genere una curva estándar basada en una concentración de proteína predefinida⁴².
2. Después de su síntesis, purifique los nanogeles encapsulantes de proteínas utilizando unidades de filtro centrífugo de 15 mL con MWCO de 100 kDa (1000 x g, 10 min) como se describe en los pasos 3.12-3.14.
3. Recoja el filtrado y analice utilizando el ensayo microBCA (protocolo disponible en el sitio web del fabricante). Mida la absorbancia a 562 nm con un lector de placas. Como esta medición se correlaciona con la concentración de proteína no encapsulada, determine la masa de la proteína encapsulada. Para calcular la eficiencia de encapsulación (EE) %, utilice la siguiente ecuación:
   

6. Cuantificación de la liberación de proteínas de nanogeles en presencia de glutatión

1. Incubar 200 μL de 5 mg/mL de nanogeles cargados con Cy7BSA con 200 μL de 10 mM de glutatión (GSH) en las unidades de filtro centrífugo de 0,5 mL (100 kDa MWCO). Coloque las unidades de filtro en un baño de agua para mantener la temperatura a 37 °C.
2. Centrifugar a 1000 x g durante 3 minutos cada 10 minutos durante al menos 1 h y luego cada 2-8 h.
3. Recoja el filtrado y utilícelo para su posterior análisis. Mantenga el volumen del filtrado dentro de las unidades de filtro centrífugo a 500 μL agregando más agua desionizada o PBS.
4. Mida la cantidad de proteína en los filtrados consultando una curva estándar para nanogeles cargados con Cy7BSA, donde la absorbancia de la proteína fluorescente se midió utilizando un instrumento de nanogotas a 750 nm.
   NOTA: Esta curva estándar se puede calcular preparando diluciones seriadas de Cy7BSA dentro del rango de 0 mg/mL a 2 mg/mL. Los valores obtenidos de la nanogota se pueden interpolar con esta curva de calibración para determinar la eficiencia de encapsulación.

Resultados

Síntesis y caracterización de diacrilato de poli(etilenglicol) (PEG) diacrilato El reticulante sensible a redox se sintetizó mediante la sustitución nucleofílica de un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) por el metacrilato de 2-aminoetilo mediante la formación de un enlace amida (Figura 1). La síntesis del producto requerido se validó principalmente por RMN ¹H (Figura Suplementaria 1), que se llevó a cabo disolviendo la muestra del produc...

Discusión

La creciente demanda de productos biológicos específicos en la industria biofarmacéutica ha impulsado la necesidad de tecnologías que puedan mejorar sus perfiles farmacológicos in vivo, evitando al mismo tiempo su rápida degradación fisiológica y compensando cualquier efecto secundario no deseado. Con esto en mente, se describe un procedimiento sencillo para la síntesis de nanogeles cargados de proteínas. Como se indica en el protocolo, el reticulante sensible a redox debe sinte...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
químicos
2-( acriloiloxi)etil]solución de cloruro de trimetilamonio	Sigma Aldrich	496146
2-aminoetilato de metacrilato clorhidrato	Sigma Aldrich	516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41, 44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontanedioico ácido di-N-succinimidil éster	Sigma Aldrich	671630
Acrilamida	Sigma Aldrich	23701
Persulfato de amonio	Sigma Aldrich	248614
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	B6917
Albúmina sérica bovina marcada con Cy7	Nanocs	BS1-S7-1
Dimetilsulfóxido deuterado	Sigma Aldrich	547239
Diclorometano	Sigma Aldrich 270997	(anhidro) y D65100
Glutatión	Sigma Aldrich	G4251
Metanol	Sigma Aldrich	34860
N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina	Sigma Aldrich	411019
solución salina tamponada con fosfato	ThermoFisher	10010023
Dodecil sulfato de sodio	Sigma Aldrich	436143
Trietilamina	Sigma Aldrich	471283
Agar Acetato de Uranilo	Scientific	AGR1260A
Equipos necesarios para la síntesis y caracterización >de nanogeles filtro centrífugo Amicon
Ultra-15 (100kDa MWCO)	Cámara Merck Millipore	C7715
Olympus		Veleta
Rejillas de cobre recubiertas de carbono	Agar Scientific	AGS160
Tubo de diálisis (100kDa MWCO)	Laboratorios de espectro	11405949
dispersión dinámica de la luz	Malvern	Zetasizer Nano Ultra Liofilizador
	Labconco	WZ-03336-01
Espectroscopía infrarroja	Agilent	Cary 630 FTIR
iTEM software	Olympus
Espectrometría de masas	Waters	Micromass MALDI microMX MALDI Q-ToF
Filtro de membrana MF-MilliporeTM (0.45/0.2μ m tamaño de poro)	Merck Millipore, Reino Unido	HAWP04700, GSWP04700
Kit de ensayo de proteínas Micro BCA	ThermoFisher	23235
Lector de placas	Beckman	Coulter-PARADIGM
Datos de resonancia magnética nuclear de protones y carbono-13			400MHz AV-400
NMR Evaporador rotativo	Buchi	R-114 Rotary Vap System
Agujas de un solo uso	Sterican	4665643
Suba-Seal  septos	Sigma Aldrich	Z124575
Microscopía electrónica de transmisión	Phillips	CM 100 TEM
espectrofotómetro UV-vis	Nanodrop	Nanodrop One/One C microvolumen