Fabricación y caracterización de la nanomatriz base Janus capa por capa para promover la regeneración del cartílago

Summary

Este protocolo describe el ensamblaje de un andamio de nanomatriz de base Janus (JBNm) capa por capa agregando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) secuencialmente. El JBNm fue fabricado y caracterizado; Además, mostró una excelente bioactividad, fomentando funciones celulares como la adhesión, proliferación y diferenciación.

Abstract

Se han desarrollado varios andamios de biomateriales para guiar la adhesión y proliferación celular con la esperanza de promover funciones específicas para usos in vitro e in vivo . La adición de factores de crecimiento en estos andamios de biomateriales generalmente se realiza para proporcionar un entorno óptimo de cultivo celular, mediando la diferenciación celular y sus funciones posteriores. Sin embargo, los factores de crecimiento en un andamio de biomaterial convencional generalmente están diseñados para ser liberados después de la implantación, lo que podría provocar efectos secundarios no deseados en el tejido o las células circundantes. Aquí, la nanomatriz base Janus (JBNm) inspirada en el ADN ha logrado con éxito un microambiente altamente localizado con una estructura capa por capa para construcciones autosostenibles de tejido de cartílago. Los JBNms se autoensamblan a partir de nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) a través de la bioafinidad. El JBNm se ensambló en una relación TGF-β1:matrilin-3:JBNt de 1:4:10, ya que esta ha sido la relación determinada en la que podría ocurrir el ensamblaje adecuado en la estructura capa por capa. Primero, se agregó la solución de TGF-β1 a la solución de matrilina-3. Luego, esta mezcla se pipeteó varias veces para garantizar una homogeneidad suficiente antes de la adición de la solución JBNt. Esto formó el JBNm capa por capa, después de pipetear varias veces nuevamente. Se realizaron una variedad de experimentos para caracterizar la estructura JBNm capa por capa, JBNts solo, matrilina-3 sola y TGF-β1 sola. La formación de JBNm se estudió con espectros de absorción UV-Vis, y la estructura del JBNm se observó con microscopía electrónica de transmisión (TEM). A medida que el innovador andamio JBNm capa por capa se forma a escala molecular, se pudo observar el JBNm marcado con colorante fluorescente. El TGF-β1 está confinado dentro de la capa interna del JBNm inyectable, que puede prevenir la liberación de factores de crecimiento a las áreas circundantes, promover la condrogénesis localizada y promover un microambiente antihipertrófico.

Introduction

Los andamios en la ingeniería de tejidos desempeñan un papel vital en la prestación de soporte estructural para la unión celular y el posterior desarrollo de tejidos¹. Por lo general, las construcciones de tejido convencionales sin ningún andamiaje dependen del entorno de cultivo celular y de factores de crecimiento agregados para mediar la diferenciación celular. Además, esta adición de moléculas bioactivas en andamios es a menudo el enfoque preferido para guiar la diferenciación y función celular ^2,3. Algunos andamios pueden imitar el microambiente bioquímico de los tejidos nativos de....

Protocol

1. Síntesis de JBNts

1. Preparar el monómero JBNt utilizando métodos previamente publicados, que involucran la síntesis de una variedad de compuestos¹².
2. Purifique el monómero JBNt crudo después de que se haya sintetizado con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando una columna de fase inversa. Use el solvente A: 100% agua, el solvente B: 100% acetonitrilo y el solvente C: solución de agua HCl con pH = 1. Utilice un caudal de 3 ml/min. Recoger el pico más grande obtenido en el HPLC a los 7,2 min.

2. Fabricación para JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

Results

Siguiendo el protocolo, los JBNts se sintetizaron con éxito y se caracterizaron con absorción UV-Vis y TEM. El JBNm es un andamio sólido inyectable que se somete a un rápido proceso biomimético. Después de agregar JBNts a una mezcla de solución de TGF-β1 / matrilina-3 en un entorno fisiológico, se formó un andamio sólido de malla blanca que indica el ensamblaje exitoso de JBNm, como se ve en la Figura 1. Esto se demostró en los métodos de caracterización.

En condi.......

Discussion

El objetivo de este estudio es desarrollar una plataforma de andamio biomimético, el JBNm, para superar las limitaciones de las construcciones de tejidos convencionales que dependen de entornos de cultivo celular para mediar la diferenciación celular. El JBNm es un andamio de estructura capa por capa para una construcción autosostenible de tejido de cartílago. El diseño innovador se basa en nuevos nanomateriales inspirados en el ADN, los JBNts. El JBNm, compuesto por JBNts³⁰, TGF-β1 y matrilina-3,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 % Suero de Cabra	Normal Thermo Fisher	50062Z	Agente utilizado para bloquear las acciones inespecíficas de unión a anticuerpos durante la tinción.
Placa de 24 pocillos	Corning	07-200-740	Placa de 24 pocillos utilizada para el cultivo celular comparativo.
Placa negra sin tratar de 384 pocillos	Thermo Fisher	262260	Placa de 384 pocillos utilizada para mediciones de absorción.
Cubreobjetos de 8 pocillos	Thermo Fisher	155409PK	Vitrina de 8 pocillos utilizada para el cultivo comparativo de células.
Fondo plano de 96 pocillos	Corning	07-200-91	Placa de 96 pocillos utilizada para el cultivo celular comparativo.
Placa de 96 pocillos Thermo Fisher sin tratar		260895	placa de 96 pocillos utilizada para el cultivo y análisis comparativo de células.
Gel de agarosa	Sigma-Aldrich	A9539	Hidrogel utilizado para el cultivo celular.
Gel de agarosa	Sigma Aldrich	A9539	Hidrogel utilizado como entorno para el cultivo celular.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) y A30007 (555)	Colorante fluorescente utilizado para etiquetar proteínas.
Anticuerpo Anti-Colágeno X	Thermo Fisher	41-9771-82	Anticuerpo utilizado para teñir colágeno-X.
Máquina de PCR Bio-Rad Equipo	Bio-Rad		utilizado para realizar PCR en muestras.
C28/I2 Células de línea			utilizadas para analizar las capacidades proliferativas de varias muestras.
Kit de recuento de células 8	Milipore Sigma	96992	Ensayo de proliferación celular.
Cell Profiler	Broad Institute		Software utilizado para analizar imágenes celulares.
		de criostato	Equipo utilizado para producir segmentos delgados de muestras para su uso en tinción y microscopía.
DAPI	Invitrogen	D1306	Tinción azul fluorescente que se une a las regiones de ADN de adenina-timina.
Cubetas desechables	FISHER Scientific	14-955-128	Contenedor utilizado para espectrofotometría.
Medio de cultivo celular DMEM	Thermo Fisher	10566032	medios utilizados para apoyar el crecimiento celular.
Suero Fetal Bovino	GIBCO A4766801		Suero utilizado en medio de cultivo celular para apoyar el crecimiento celular.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo	Fisher	00-4958-02	Solución utilizada para montar portaobjetos para inmunotinción.
Compuesto de formaldehído	utilizado para fijar muestras antes de
Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) anticuerpo secundario altamente adsorbido	cruzado Thermo Fisher	A16110	Anticuerpo utilizado para la tinción de proteínas.
Células madre mesenquimales humanas	LONZA	PT-2501	Células utilizadas para analizar las capacidades diferenciativas de varias muestras.
Medio condrogénico del tallo mesenquimal humano	LONZA	PT-3003	Medio celular utilizado para promover la diferenciación condrogénica.
ImageJ	National Institutes of Health		Software de análisis de imágenes utilizado junto con la microscopía.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit utilizado para PCR.
Nanotubos con base de Jano (JBNts)			Nanotubo fabricado a partir de nucleobases sintéticas para actuar como herramienta de andamiaje celular.
LaB6 20-120 kV Microscopio Electrónico de Transmisión	Tecnai		Equipo utilizado para realizar microscopía electrónica de transmisión en una muestra.
MATLAB	MathWorks		Software estadístico utilizado para el modelado y el análisis de datos.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Proteína estructural utilizada como sitios de adhesión para condrocitos.
Espectrofotómetro NanoDrop:	Equipo Thermo Fisher		utilizado para medir los valores de absorción de una muestra.
Microscopio confocal espectral Nikon A1R	Nikon	A1R HD25	Microscopio confocal utilizado para analizar muestras.
Número 1.5 Cubreobjetos de cámara	Thermo Fisher	152250	Entorno para el cultivo de células estériles y la obtención de imágenes.
Temperatura óptima de corte Compuesto reactivo			Compuesto utilizado para incrustar células antes de la micrótomo.
Paraformaldehído	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compuesto utilizado para fijar células.
PDC-32G Limpiador de plasma	Harrick Limpiador de plasma		utilizado para preparar rejillas antes de la microscopía electrónica de transmisión.
penicilina-estreptomicina	GIBCO	15-140-148	Agente antibiótico utilizado para desalentar el crecimiento bacteriano durante el cultivo celular.
Solución salina tamponada con fosfato	Thermo Fisher	10010023	utilizada para lavar el medio celular y actuar como tampón durante la experimentación.
Rhodamina-faloidina	Invitrogen	R415	Colorante fluorescente rojo F-actina.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit utilizado para filtrar y homogeneizar muestras durante la extracción de ARN.
Solución			Solución utilizada para procesar muestras antes de la microtomización.
TGF beta-1 Kit de ELISA humano	Invitrogen	BMS249-4	Kit de ensayo utilizado para determinar la presencia de TGF-& beta; 1 en una muestra.
TGF-y beta; 1	PEPROTECH	100-21C	Factor de crecimiento utilizado para la estimulación de la diferenciación y proliferación condrogénica.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compuesto utilizado para lisar células no fijadas durante el proceso de tinción.
Reactivo TRIzol	Thermo Fisher	15596026	Reactivo utilizado para aislar ARN.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Equipo analítico		utilizado para medir los valores de potencial zeta de una muestra.