Detección y cuantificación de nanotubos de túnel utilizando imágenes de vista de volumen 3D

Resumen

Los nanotubos de túnel (TNT) son principalmente nanotubos de membrana de actina F abiertos que conectan las células vecinas, facilitando la comunicación intercelular. La característica notable que distingue a los TNT de otras protuberancias celulares es la naturaleza flotante de los nanotubos entre las células. Aquí, caracterizamos los TNT mediante la construcción de una vista de volumen 3D de imágenes confocales de pila z.

Resumen

Descubrimientos recientes han revelado que las células realizan una transferencia intercelular directa y de largo alcance a través de conductos de membrana de actina a nanoescala, a saber, "nanotubos de túnel" (TNT). Los TNT se definen como extensiones de membrana abiertas rodeadas de bicapa lipídica que median la continuidad entre células vecinas de diámetros que oscilan entre 50 nm y 1 μm. Los TNT se demostraron inicialmente en células neuronales, pero estudios sucesivos han revelado la existencia de TNT en varios tipos de células y enfermedades, como enfermedades neurodegenerativas, infecciones virales y cáncer. Varios estudios se han referido a nanoestructuras de membrana cerradas y acopladas eléctricamente entre células vecinas como TNT o estructuras similares a TNT.

La elucidación de la ultraestructura en términos de continuidad de la membrana en el punto final es técnicamente desafiante. Además, los estudios sobre la comunicación célula-célula son desafiantes en términos de la caracterización de TNT utilizando métodos convencionales debido a la falta de marcadores específicos. Los TNT se definen principalmente como protuberancias de membrana abiertas basadas en actina F. Sin embargo, una limitación importante es que la actina F está presente en todos los tipos de protuberancias, lo que dificulta la diferenciación de los TNT de otras protuberancias. Una de las características notables de los TNT basados en actina F es que estas estructuras flotan entre dos células sin tocar el sustrato. Por lo tanto, los distintos TNT teñidos con actina F se pueden distinguir convenientemente de otras protuberancias como los filopodios y las neuritas en función de su flotación entre las células.

Recientemente hemos demostrado que la internalización de la β amiloide oligomérica 1-42 (oAβ) a través de endocitosis dependiente de actina estimula la quinasa-1 activada por p21 activada (PAK1), que media la formación de TNT que contienen actina F coexpresados con fosfo-PAK1 entre las células neuronales_SH-SY5Y. Este protocolo describe un método de análisis de volumen 3D para identificar y caracterizar TNT a partir de las imágenes capturadas de la pila z de protuberancias de membrana inmunoteñidas con actina F y fosfo-PAK1 en células neuronales tratadas con oAβ. Además, los TNT se distinguen del desarrollo de neuritas y excrecencias neuronales basadas en conductos de membrana inmunoteñidos con tubulina F-actina y β-III.

Introducción

Los nanotubos de túnel (TNT) son conductos de membrana basados principalmente en actina F, principalmente abiertos, y desempeñan un papel vital en la transferencia intercelular de carga y orgánulos¹. La característica única de los TNT es que conectan las células vecinas sin ningún contacto con el sustrato; Tienen más de 10-300 μm de longitud y sus diámetros varían entre 50 nm a 1 μm ^2,3. Los TNT son estructuras transitorias, y su vida dura entre unos pocos minutos y varias horas. Los TNT se demostraron por primera vez en células neuronales PC12¹; Posteriormente, ....

Protocolo

NOTA: Las células SH-SY5Y cultivadas en medios DMEM/F-12 se diferenciaron con ácido retinoico 10 μM durante 7 días y se trataron con oligómeros oAβ de 1 μM durante 2 h a 37 °C (5% de_CO2). Después del tratamiento, las células se fijaron con la solución fijadora de Karnovsky y se inmunotiñeron dos veces con el anticuerpo fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) y faloidina de unión a actina F. Más tarde, se tomaron imágenes confocales de la pila z utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Los TNT se cuantificaron mediante conteo manual y se distinguieron de otras protuberancias neuritas / células mediante la construcción de imágenes de vista de volumen ....

Resultados

Aquí, identificamos y caracterizamos TNT inducidos por oAβ en células neuronales SH-SY5Y mediante la construcción de vistas de volumen 3D a partir de imágenes confocales de pila z (Figura 1). Las células fueron doblemente inmunoteñidas con actina F y fosfo-PAK1. Se analizaron imágenes confocales de pila z de células inmunoteñidas para identificar TNT (Figura 2). Además, se analizaron imágenes DIC para verificar que las estructuras de TNT teñidas con F-actina y f.......

Discusión

Varios investigadores en las últimas 2 décadas han estado tratando de entender y caracterizar la estructura de TNTs¹⁸. La falta de marcadores específicos dificulta el progreso, y existe una creciente demanda de un método conveniente y estandarizado que se pueda utilizar para identificar, caracterizar y cuantificar los TNT. Los TNT se definen como conductos de membrana basados en actina F que flotan entre dos células. Los estudios han demostrado que las neuritas en desarrollo β positivas para la tu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plato de 35 mm con tamaño de pocillo de 14 mm hecho de cubreobjetos #1.5	Cellvis	D35-14-1.5-N Plato de	imagen utilizado para sembrar células para experimentos de tinción
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligómeros de beta amiloide para tratar las células Harina de
Alexa 488 Cabra Anti-conejo IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Anticuerpo secundario para fosfo-PAK1
Cabina de seguridad biológica	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Proporcionar condiciones específicas durante el cultivo
CO2 Incubadora	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	Para el crecimiento de células a temperatura corporal o cerca
Microscopio de barrido láser confocal	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Capaz de generar imágenes tridimensionales de muestras grandes a superresolución
DABCO [1,4-Diazobiciclo-(2,2,2) octano]	Merck	8034560100	Reactivo antiblanqueador
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear tinción
DMEM media	Gibco	11965092	Utilizado para la preparación de 100uM de Aβ (1-42)
DMEM/F12 (mezcla 1:1 de DMEM y Jamón) s F12)	Gibco	12500062	medios de cultivo para SH-SY5Y
DMSO (sulfuro de dimetilo) Grado de cultivo celular	Cryopur	CP-100 Grado de	cultivo celular utilizado como agente de disolución para el ácido retinoico
DMSO (sulfuro de dimetilo) Grado molecular	Himedia	MB058	Utilizado como uno de los agentes disolventes para el A y beta liofilizado; (1-42)
Suero Fetal Bovino	Gibco	16000044	Suplemento principal para medios de cultivo (origen en EE. UU.)
Fijador de formalina (10% tamponado neutro)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Componente en la solución fijadora de Karnovsky
Glutaraldehído (Grado I, 25% en H2O)	Sigma	G5882	Componente en la solución fijadora de Karnovsky
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)	solución TCI	H024	Se utiliza para disolver A y beta; (1-42)
Software de procesamiento/análisis de imágenes de 1 mg: FIJI (ImageJ)	Instituto Nacional de Salud (NIH)		Se utiliza para procesar/analizar las imágenes y diferenciar los TNT de las neuritas utilizando su complemento llamado "visor de volumen".
Liofilizador	Cristo, Alfa	2,4 LDmás	0,05 mg alícuotas de Aβ (1-42) se puede almacenar en -20 ° C solo después de la liofilización
Mezcla de penicilina-estreptomicina-neomicina	Thermo fisher Scientific 15640055		Mezcla de antibióticos
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	Tinción de unión a F-actina
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Conejo]	CST	#2601	Anticuerpo primario
Anticuerpo policlonal contra Tubulina Beta 3 (TUBb3)	Clon de	la nubePAE711Hu01	Anticuerpo primario
Ácido retinoico	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Reactivo diferenciador
Saponina	Merck	8047-15-2	Detergente utilizado en el Tampón de incubación en inmunotinción
Sonicador de baño de agua (Quart, Válvula de drenaje Calentador)	Limpiador ultrasónico	3.0 L/3.2	Sonicador utilizado para disolver A y beta; (1-42) caldo, después de agregarle DMSO durante la preparación de 100 µ M A y beta; (1-42)
Software de microscopía	ZEN ZEISS (Carl Zeiss)		Software de adquisición de imágenes para la adquisición de imágenes de microscopía confocal con automatización inteligente

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