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Artículo de método

Construcción de vectores adenovirales utilizando tecnología de ensamblaje de ADN

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DOI:

10.3791/64033

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16 de junio de 2022

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1NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 2Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, National Center for Children’s Health, 3Henan Chemical Technician College, 4Research Unit of Critical Infection in Childre, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Chinese Academy of Sciences Joint Research Center for Emerging Infectious Diseases and Biosafety, Chinese Center for Disease Control and Prevention-Wuhan Institute of Virology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este estudio, se construyó un clon infeccioso de adenovirus humano tipo 7 (HAdV-7) y se estableció un sistema de vectores HAdV-7 con deleción E3 modificando el clon infeccioso. Esta estrategia utilizada aquí se puede generalizar para crear vectores de transferencia de genes de otros adenovirus de tipo salvaje.

Resumen

Los vectores adenovirales se han utilizado como herramienta de transferencia de genes en la terapia génica durante más de tres décadas. Aquí, presentamos un protocolo para construir un vector adenoviral mediante la manipulación del ADN genómico de HAdV-7 de tipo salvaje mediante el uso de un método de ensamblaje de ADN. En primer lugar, se generó un clon infeccioso de HAdV-7, pKan-Ad7, mediante la fusión del ADN genómico viral con un producto de PCR a partir de la columna vertebral del plásmido, que comprende el gen resistente a la kanamicina y el origen de la replicación (Kan-Ori), a través del ensamblaje del ADN. Esto se hizo mediante el diseño de un par de cebadores de PCR, que contenían ~ 25 nucleótidos de la secuencia terminal de la repetición terminal invertida (ITR) de HAdV-7 en el extremo 5', un sitio de enzima de restricción no cortador para el genoma de HAdV-7 en el medio y una secuencia específica de plantilla para el cebado de PCR en el extremo 3'. En segundo lugar, se empleó una estrategia intermedia basada en plásmidos para reemplazar la región E3 con elementos que expresan transgenes en el clon infeccioso para generar un vector adenoviral. Brevemente, pKan-Ad7 se digirió con la enzima de restricción Hpa I de doble corte, y el fragmento que contiene la región E3 se ligó a otro producto de PCR de la columna vertebral del plásmido mediante el ensamblaje de Gibson para construir un plásmido intermedio pKan-Ad7HpaI. Para mayor comodidad, se utilizó el ensamblaje de restricción para designar el método de clonación de plásmidos de digestión y ensamblaje de restricción combinados. Usando el ensamblaje de restricción, los genes E3 en pKan-Ad7HpaI se reemplazaron con un casete de expresión de proteína fluorescente verde (GFP), y la región E3 modificada se liberó del plásmido intermedio y se restauró al clon infeccioso para generar un plásmido adenoviral pKAd7-E3GFP. Finalmente, pKAd7-E3GFP se linealizó por digestión de Pme I y se utilizó para transfectar celdas de empaquetamiento HEK293 para rescatar el virus HAdV-7 recombinante. Para concluir, aquí se introdujo una estrategia basada en el ensamblaje de ADN para construir vectores adenovirales en laboratorios generales de biología molecular sin la necesidad de materiales e instrumentos especializados.

Introducción

En las últimas tres décadas, los vectores adenovirales recombinantes se han utilizado ampliamente en el desarrollo de vacunas y la terapia génica 1,2,3,4, así como en la investigación básica debido a sus excelentes propiedades biológicas, como la alta eficiencia de la transducción de genes, la no integración con el genoma del huésped, el genoma viral manipulador y la facilidad de producción a gran escala.

En la actualidad, los vectores adenovirales más utilizados se construyen a partir del adenovirus humano 5 (HAdV-5)5,6. Aunque la transducción mediada por vectores HAdV-5 proporciona resultados alentadores, las aplicaciones preclínicas y clínicas han revelado varias desventajas (por ejemplo, alta inmunidad antivectorial preexistente dentro de la población humana y baja eficiencia de transducción en células que carecen del virus coxsackie y el receptor de adenovirus (CAR)). Para sortear estos problemas, ha habido un gran interés en construir vectores basados en otros tipos de adenovirus humanos o mamíferos 3,7,8.

Hasta ahora, el método más popular para construir un vector adenoviral es la recombinación homóloga en bacterias5. Estas cepas bacterianas deben expresar recombinasas, lo que puede afectar a la estabilidad o amplificación de los plásmidos que portan. Algunas cepas incluso no están disponibles comercialmente. Recientemente, se han empleado métodos basados en otros principios, como los cromosomas artificiales bacterianos, la clonación directa o el ensamblaje directo de ADN, para generar clones infecciosos de adenovirus o vectores adenovirales recombinantes 9,10,11,12. Sin embargo, estos métodos son algo hostiles para los investigadores con poca experiencia en este campo.

En 2018, el proceso de construcción de un clon infeccioso de adenovirus se simplificó en el laboratorio mediante la ligadura directa del genoma del virus con un producto de PCR que transporta la columna vertebral del plásmido a través del ensamblaje de Gibson13. Después de eso, los métodos de digestión de restricción y ensamblaje de Gibson se combinan para cargar transgenes a plásmidos adenovirales existentes 14,15,16,17,18. En aras de la comodidad, el ensamblaje de restricción se utiliza en lo sucesivo para referirse al método de digestión combinada de enzimas de restricción y ensamblaje de Gibson. Se desarrollaron estrategias para construir vectores adenovirales a partir de clones infecciosos mediante el uso de ensamblaje de restricción19. La esencia del ensamblaje de restricción es incluir fragmentos extirpados de plásmidos tanto como sea posible en una reacción de ensamblaje de ADN, mientras que los productos cortos de PCR sirven como enlazadores o parches para la modificación de plásmidos. Al mismo tiempo, el número de fragmentos incluidos se mantiene lo más bajo posible. Tales esfuerzos reflejan la recompensa; se puede minimizar la posibilidad de mutaciones no deseadas causadas por PCR o ensamblaje de ADN, y se puede mejorar la tasa de éxito. De manera concluyente, se ha establecido en el laboratorio una tubería desde un adenovirus de tipo salvaje hasta un vector adenoviral 13,14,15,16,17,18,19.

Aquí, intentamos presentar estos métodos proporcionando ejemplos de construcción de un clon infeccioso HAdV-7 y un vector HAdV-7 competente para la replicación con deleción E3.

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Protocolo

NOTA: Los adenovirus se clasifican como Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2); Todos los pasos para utilizar los virus se llevaron a cabo en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad. El HAdV-7 de tipo salvaje se aisló en 2017 a partir de la muestra de aspirado nasofaríngeo de un bebé de 10 meses que fue hospitalizado con infección aguda del tracto respiratorio en el Hospital Infantil de Beijing20. Las existencias de virus se almacenaron a -80 °C.

1. Extracción de ADN genómico HAdV-7

  1. Siembre 2,0 x 106 células HEK293 en un matraz T-25 que contenga 5 mL de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) más un 10% de suero fetal bovino (FBS) y cultivo a 37 °C en una atmósfera humidificada suplementada con 5% de CO2. Las células deben tener un 80%-90% de confluencia y estar listas para la infección en 18-24 h.
  2. Inocular las células con HAdV-7 de tipo salvaje durante 2 h. Retire el medio que contiene el virus por aspiración y agregue 5 mL de DMEM fresco que contenga 2% de FBS a las células.
  3. Extraiga el ADN genómico viral con el método de Hirt modificado21
    1. En 2 o 3 días después de la infección, cuando se observe efecto citopático (CPE) en el 50%-90% de las células, deseche el sobrenadante del cultivo y enjuague las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      NOTA: El efecto citopático (CPE) se define como un fenómeno en el que las células infectadas por el virus se agrupan, se hinchan y se adhieren o separan libremente del matraz de cultivo en racimos similares a uvas22.
    2. Lisar las células del matraz en 1,0 mL de tampón de lisis que contiene 25 mM de Tris-HCl, 0,5 mM de EDTA, 50 μg/mL de proteasa K y 0,8% de SDS (pH7,6) durante 5 min en hielo. Transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e incube el tubo en un baño de agua a 50 °C durante 30 min.
    3. Añadir 120 μL de tampón de precipitación al tubo. Coloque el tubo en hielo durante otros 30 minutos después de mezclar suavemente.
      NOTA: El tampón de precipitación está compuesto por 3 M de CsCl, 1 M de acetato de potasio y 0,67 M de ácido acético. Ayudará a precipitar los desechos celulares y el ADN de los cromosomas celulares después de la centrifugación, mientras mantiene el genoma del virus en el sobrenadante.
    4. Centrifugar el tubo durante 25 min a 15.000 x g a 4 °C y, a continuación, transferir el sobrenadante (aproximadamente 1,1 mL) a un tubo de polipropileno de 15 mL.
    5. Agregue 2,2 ml de etanol absoluto helado al tubo. Mezcle suavemente y deje reposar el tubo sobre hielo durante 15 minutos. Centrifugar durante 5 min a 2000 x g a temperatura ambiente.
    6. Aspirar el sobrenadante con cuidado y lavar el precipitado (ADN genómico del virus) una vez con 800 μL de etanol al 70%. Centrifugar el tubo durante 6 min a 15.000 x g a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y seque al aire la bolita de ADN en la parte inferior. No seque demasiado la bolita de ADN, ya que puede causar dificultades para volver a disolverse.
    7. Disuelva el pellet en 200 μL de tampón TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM de EDTA), añada 1 μL de RNasa A (10 mg/mL) e incube el tubo a 37 °C durante 15 min. Purifique el ADN disuelto mediante el uso de un kit comercial de limpieza y concentrador de ADN genómico (consulte la tabla de materiales).
      NOTA: Cuantifique el ADN genómico viral con el método comúnmente utilizado en el laboratorio. Generalmente, se pueden obtener de 1 a 5 μg de ADN genómico en un matraz T-25 de células HEK293 infectadas con adenovirus.

2. Construcción de un clon infeccioso de HAdV-7 por ensamblaje de ADN

  1. Diseñar cebadores de PCR para amplificar la columna vertebral del plásmido (Figura 1). Agregue las secuencias superpuestas que se necesitan para el ensamblaje del ADN a los extremos 5' de los cebadores de PCR. Además, incluya sitios de restricción que no sean de corte (por ejemplo, sitio Pme I) en ambos extremos del genoma HAdV-7 para ayudar a liberar el genoma viral del clon infeccioso.
    NOTA: La columna vertebral del plásmido que contiene el gen resistente a los antibióticos y el origen de replicación se amplifica mediante PCR y se fusiona con el genoma HAdV-7. Los adenovirus pueden ser rescatados de las células de empaquetamiento con mayor eficiencia cuando se utiliza un genoma de virus linealizado en lugar de un plásmido adenoviral circular. Después de considerar los factores mencionados anteriormente, los cebadores se diseñan como se muestra en la Figura 1.
  2. Realice PCR para amplificar un fragmento (Kan-Ori) que contiene el gen de resistencia a kanamicina (Kan) y el origen de pBR322 (Ori) utilizando pShuttle-CMV como plantilla con cebadores de Ad7KanF1 y Ad7KanR1 (Tabla S1). Ajuste la reacción PCR de la siguiente manera: un ciclo a 98 °C durante 30 s, luego cinco ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 8 s, recocido a 68 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 90 s y, finalmente, 25 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 8 s, recocido y extensión a 72 °C durante 2 min.
  3. Ejecute el producto de PCR en un gel de agarosa al 1% por electroforesis y purifique el fragmento utilizando un kit comercial de recuperación de gel de ADN.
  4. Agregue el Kan-Ori recuperado y el ADN genómico viral de HAdV-7 a la mezcla maestra comercial de ensamblaje de ADN. Configure la reacción de ensamblaje en un volumen total de 20 μL y una relación molar de ADN genómico vectorial a viral de 1:2. Incubar a 50 °C durante 1 h.
    NOTA: Establezca la reacción en un volumen total de 20 μL con 1-3 μL de vector, 7-9 μL de ADN genómico viral y 10 μL de mezcla maestra de ensamblaje de ADN.
  5. Transforme las células TOP10 de la cepa de E. coli químicamente competentes con 10 μL del producto de ensamblaje mediante choque térmico. Extienda la mezcla de transformación en placas Luria-Bertani (LB-Kan) que contengan kanamicina (50 μg/mL). Incubar las placas a 37 °C durante al menos 12 h.
  6. Inocular al menos tres clones cada uno en 5 mL de medio LB-Kan a 37 °C durante 12 h con agitación suave (200-250 rpm). Extraiga el ADN plásmido utilizando un kit comercial de minipreparación de plásmidos.
  7. Digiera el plásmido usando endonucleasa de restricción y luego verifique el tamaño de los fragmentos de ADN con electroforesis en gel de agarosa (Figura 2A). Además, confirme los sitios de fusión por secuenciación. El plásmido de ensamblaje correcto se denomina pKan-Ad7.
  8. Cultive un cultivo de bacterias de 100 ml a partir del clon correcto. Extraiga una preparación de maxiplásmido utilizando un kit comercial de plásmido Maxprep.

3. Construcción in silico y modificación de un plásmido intermedio

NOTA: Generalmente, se debe construir un plásmido intermedio, y cómo construir un plásmido intermedio ideal es el paso clave. Para el diseño de un plásmido intermedio se necesita un software de análisis de ADN con un módulo de enzima de restricción, como pDRAW32 (un software gratuito, disponible en www.acaclone.com).

  1. Importe la secuencia de ADN de pKan-Ad7 a pDRAW32 para dibujar un mapa de plásmidos. Anote las regiones de interés en el mapa. Para pKan-Ad7, se anotaron las regiones E1, E3 y la columna vertebral del plásmido (Kan-Ori).
  2. Opere el programa pDRAW32. En primer lugar, haga clic en Configuración > Selección de enzimas y, a continuación, haga clic en Cortes mínimos/máximos. Introduzca 1 en la casilla Min y 2 en la casilla Max, y marque la casilla anterior en toda la secuencia. Por último, haga clic en Aceptar para mostrar los sitios de enzimas de restricción de cortador únicos y dobles en el mapa.
    NOTA: Generalmente, solo se seleccionan las enzimas de restricción que reconocen una secuencia de 6 pb o más. Como se muestra en la Figura 3A, 17 enzimas coinciden con los criterios de selección de enzimas.
  3. Considere el primer sitio de restricción que flanquea la región E3 desde que se planea modificar el E3. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I y Spe I cumplieron con el requisito.
    NOTA: Para este experimento, se selecciona Hpa I porque la digestión de pKan-Ad7 con él generaría el fragmento más corto que lleva la región E3, y un plásmido intermedio más pequeño facilitaría la modificación futura. La selección de sitios Sal I también tiene ventajas: un plásmido intermedio de este tipo es adecuado para la modificación de las regiones E1 y E3 (Figura S1).
  4. Cree un archivo de secuencia final que muestre ambas hebras de ADN del plásmido intermedio pKan-Ad7HpaI. Esta secuencia virtual se puede utilizar como plantilla para diseñar imprimaciones superpuestas.
    1. Copie la secuencia entre los dos sitios de restricción Hpa I, incluida la región E3. Para el montaje posterior, es necesario copiar cada secuencia de ~20 pb (Tm igual o superior a 48°C) fuera del sitio de restricción de Hpa I (Figura 3C, superposición-Final 1 y superposición-Final2).
    2. Agregue la secuencia de reconocimiento de Pme I (Figura 3C, gtttaaac) en ambos extremos de la secuencia anterior.
    3. Agregue la secuencia del plásmido de la columna vertebral que contiene el gen resistente a los antibióticos y el origen de la replicación (Figura 3C, Kan-Ori) fuera del sitio de restricción Pme I.
    4. Importe la secuencia final a pDRAW32 para dibujar un mapa de plásmidos. Anote la región E3 en el mapa.
    5. Opere el programa pDRAW32. En primer lugar, haga clic en Configuración > Selección de enzimas y, a continuación, haga clic en Cortes mínimos/máximos. Introduzca 1 en la casilla Min y Max, y marque la casilla antes en toda la secuencia. Por último, haga clic en Aceptar para mostrar los sitios únicos de enzimas de restricción en el mapa. Se puede ver que hay muchos cortadores únicos disponibles para la modificación E3.
      NOTA: Para este experimento, se seleccionan BstZ17 I y Mlu I para el reemplazo de E3 parcial. Un cortador doble también puede ser útil. Por ejemplo, se puede seleccionar el cortador doble Ssp I junto con el cortador único BssH II para el reemplazo de toda la región E3 mediante el uso de PCR de extensión de superposición.
  5. Diseñe cebadores utilizando la secuencia virtual como plantilla para la construcción de plásmidos intermedios (Figura 3C).
    NOTA: Para acortar la longitud de cada cebador, se diseñaron cuatro imprimaciones. El producto de PCR, que se amplifica con cebadores de Ad7HpaIF1 y Ad7HpaIR1, se utilizaría como plantilla para obtener el fragmento final de PCR con cebadores de Ad7HpaIF2 y Ad7HpaIR2 (Figura 3C).

4. Rescate de adenovirus recombinante infeccioso en células HEK293

NOTA: Los tres adenovirus generados en este artículo se rescatan de acuerdo con el siguiente protocolo.

  1. Digiera 10 μg de plásmido adenoviral recombinante con 2 μL de Pme I durante 5 h a 37 °C en un volumen total de 100 μL para linealizar el plásmido. Compruebe 1 μL del ADN digerido en un gel de agarosa al 0,8%. La digestión debería producir un fragmento de ~34 kb del genoma adenoviral y una columna vertebral de plásmido de ~2,5 kb de Kan-Ori.
  2. Purifique el plásmido adenoviral lineal remanente utilizando el kit de limpieza y concentrador de ADN genómico.
  3. Cultivo de células HEK293 en DMEM más 10% de FBS. Siembre las células HEK293 (2 x 106 células ) en un matraz T-25 1 día antes de la transfección para que alcancen una confluencia del 70%-80% al día siguiente. Utilice 5 μg de plásmido adenoviral digerido Pme I para transfectar células HEK293 mediante el uso de reactivos de transfección disponibles en el mercado.
    NOTA: El medio de las células transfectadas debe reemplazarse cada 3 días.
  4. Revise las células todos los días, recoja las células y el medio de cultivo en un tubo de polipropileno de 15 mL cuando se formen los focos de cometa (Figura 2B, que indica la replicación del virus).
  5. Lise las células a través de tres ciclos de congelación y descongelación. Después de la centrifugación durante 12 min a 1200 x g a temperatura ambiente, recoja el sobrenadante y guárdelo a -80 °C para su posterior propagación del virus.
    NOTA: Cuando el adenovirus recombinante expresa GFP u otras proteínas fluorescentes, es más fácil identificar si el virus se rescata con éxito, ya que los focos formados por las células fluorescentes positivas para proteínas podrían observarse bajo un microscopio de fluorescencia de forma intuitiva.

5. Construcción de un plásmido del genoma HAdV-7 con deleción E3

NOTA: El genoma de HAdV-7 tiene una longitud de 35.239 pb, y la región E3 se encuentra entre 27.354 pb y 31.057 pb del genoma. Para construir un plásmido intermedio, encuentre una endonucleasa con dos sitios de corte en el plásmido clon infeccioso, o dos endonucleasas con un solo sitio de corte en el plásmido. Hay Hpa I, Sal I o Avr II y Mlu I disponibles. La secuencia entre BstZ17 I (28.312 pb) y Mlu I (30.757 pb) debe eliminarse y sustituirse por el casete CMV-GFP-PA o el casete CMV-mCherry-PA.

  1. Digiera 600 ng de pKan-Ad7 con Hpa I. Purifique el fragmento grande pKAd7-HpaI-FL (~30 kb) y el fragmento pequeño pKAd7-HpaI-FS (~7 kb) respectivamente, utilizando un kit de recuperación de gel de ADN después de la electroforesis en gel. Guarde el pKAd7-HpaI-FL a -20 °C.
  2. Amplificar el fragmento que contiene Kan y Ori utilizando pShuttle-CMV como plantilla con cebadores de Ad7HpaIF1 y Ad7HpaIR1 (Tabla S1) por PCR. Recuperar y diluir el producto de PCR (2541 pb) para utilizarlo como plantilla para la segunda ronda de reacción de PCR para amplificar Kan-Ori2 con cebadores de Ad7HpaIF2 y Ad7HpaIR2.
    1. Purificar el producto de PCR (2584 pb) después de disolverlo en un gel de agarosa al 1% por electroforesis. Ajuste la reacción de PCR de la siguiente manera: un ciclo a 98 °C durante 30 s, luego 30 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 8 s, recocido y extensión a 72 °C durante 2 min.
      NOTA: La parte central de Kan-Ori2 es el fragmento que contiene Kan y Ori, seguido de las secuencias de una endonucleasa de restricción única que no existe en el fragmento pequeño pKAd7-HpaI-FS (por ejemplo, Pme I), y la región superpuesta con el fragmento grande pKAd7-HpaI-FL; la secuencia más externa es la región superpuesta con el fragmento pequeño pKAd7-HpaI-FS.
  3. Agregue el producto de PCR Kan-Ori2 y el pKAd7-HpaI-FS recuperado en el paso 5.1 a la mezcla maestra de ensamblaje de ADN. Incubar a 50 °C durante 1 h. Siga los pasos 2.4 y 2.6. El plásmido correcto se llama pKan-Ad7HpaI (~10 kb).
  4. Amplifique el fragmento CMV-GFP-PA (~1,7 kb) que contiene el promotor de CMV, GFP CDS y la señal (PA) SV40 polyA utilizando pShuttle-GFP23 como plantilla con cebadores de Ad7E3GFPF1 y Ad7E3GFPR1 (Tabla S1). Purificar el producto de PCR (1650 pb) después de disolverlo en un gel de agarosa al 1% por electroforesis.
    NOTA: Las regiones superpuestas que se pueden ensamblar con BstZ17 I y Mlu I digerido pKan-Ad7HpaI deben incluirse en los cebadores, y se debe agregar un sitio de restricción único (por ejemplo, Sbf I) que no existe en el plásmido pKan-Ad7 en los cebadores para un mayor ensamblaje de restricción.
  5. Digerir 300 ng de pKan-Ad7HpaI con BstZ17 I y Mlu I. Purificar el fragmento de 7,3 kb (se eliminan la mayoría de las regiones E3) después de disolverlo en un gel de agarosa al 1% por electroforesis. Agregue el fragmento de 7.3 kb recuperado y el fragmento de CMV-GFP-PA recuperado (~1.6 kb) a la mezcla maestra de ensamblaje de ADN. Siga los pasos 2.4-2.6. El plásmido correcto se denomina pKAd7-E3GFP (~9 kb).
    NOTA: Todas las secuencias entre BstZ17 I y Mlu I pertenecen a la región E3.
  6. Digiera 300 ng de pKAd7-HE3GFP con Pme I. Purifique el fragmento grande (~6,4 kb) utilizando un kit de recuperación de gel de ADN después de la electroforesis en gel. Agregue el fragmento purificado y el pKAd7-HpaI-FL recuperado en el paso 5.1 a la mezcla maestra de ensamblaje de ADN. Incubar a 50 °C durante 1 h. Siga los pasos 2.4 y 2.6. El plásmido correcto se denomina pKAd7-E3GFP.
  7. Transfecte células HEK293 con pKAd7-E3GFP linealizado Pme I, como se describe en la sección 3. El adenovirus rescatado se denomina Ad7-E3GFP.
  8. Amplifique el fragmento CMV-mCherry-PA (~1,6 kb) que contiene el promotor de CMV, mCherry CDS y la señal SV40 polyA utilizando pKFAV4-CX19A como plantilla con los cebadores de Ad7E3CHEF1 y Ad7E3CHER1. Purificar el producto de PCR después de disolverlo en un gel de agarosa al 1% por electroforesis.
  9. Digiera 600 ng de pKAd7-E3GFP con Sbf I y purifique el fragmento de ~35 kb. Agregue el fragmento de 35 kb y el fragmento CMV-mCherry-PA recuperado a la mezcla maestra de ensamblaje de ADN. Incubar a 50 °C durante 1 h. Siga los pasos 2.4-2.6. El plásmido correcto se denomina pKAd7-E3CHE.
  10. Transfecte las células HEK293 con pKAd7-E3CHE linealizado por Pme I, como se describe en la sección 3. El adenovirus rescatado se denomina Ad7-E3CHE.

6. Amplificación y purificación del adenovirus recombinante en células HEK293

  1. Inocular una monocapa confluente al 80%-90% de células HEK293 cultivadas en ocho placas de cultivo tratadas con TC de 150 mm de diámetro con adenovirus. Incubar a 37 °C durante 2 h con agitación suave. Sustituya el sobrenadante por 25 mL de DMEM que contenga un 2% de FBS.
  2. Incubar las células a 37 °C durante 2-3 días.
    1. Desechar la mayor parte del sobrenadante de las ocho placas de 150 mm de diámetro cuando un CPE afecte a la mayoría de las células. Recoja las células infectadas utilizando elevadores de células con un volumen de elución final de ~6,0 mL en tubos de polipropileno de 15 mL.
    2. Interrumpe las células en tres ciclos de congelación y descongelación para liberar el virus. Aclarar el lisado por centrifugación durante 12 min a 1200 x g a temperatura ambiente. Recoja el sobrenadante que contiene el virus.
  3. Añadir MgCl2 (0,1 mM) y benzonasa nucleasa (50 U/mL) al sobrenadante. Vórtice suavemente durante 40 minutos a 37 °C. Añadir NaCl (600 mM) al sobrenadante y agitar suavemente durante otros 40 min a 37 °C. Centrifugar durante 12 min a 1200 x g a temperatura ambiente. Recoja el sobrenadante que contiene el virus para su purificación.
  4. Prepare cloruro de cesio (CsCl) con diferentes concentraciones de 1,35 g/mL, 1,30 g/mL y 1,25 g/mL con 10 mM de Tris-HCl.
    1. Agregue 0,8 mL de solución de CsCl de 1,35 g/mL en el fondo de un tubo ultratransparente de 5,1 mL con una pipeta, y luego agregue lentamente 0,8 mL de solución de CsCl de 1,30 g/mL y 0,8 mL de solución de CsCl de 1,25 g/mL encima de la primera solución secuencialmente.
    2. Por último, superponga cuidadosamente ~2,5 mL del sobrenadante recogido en el paso 6.3 en la parte superior de la solución de CsCl de 1,25 g/mL, y llene el tubo hasta 2-3 mm desde la parte superior con 10 mM de Tris-HCl.
  5. Centrífuga durante 2 h a 200.000 x g y 8 °C en un rotor de cuba oscilante con aceleración y desaceleración lentas para separar las partículas virales intactas de las partículas virales defectuosas.
    NOTA: Después de la centrifugación, se pueden ver claramente varias bandas blancas en la solución de CsCl.
  6. Retire con cuidado las bandas de las partículas vacías y la capa de restos celulares con la pipeta, y recoja la banda más baja que contenga el virus maduro con una jeringa de 2 ml.
  7. Transfiera la suspensión del virus recolectada a un casete de diálisis MWCO de 20 K y dialice en un tampón de diálisis que contenga 10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2 y 2% de glicerol (pH 8,0) durante la noche a 4 °C.
    1. Cambie el tampón de diálisis que contiene 10 mM de Tris-Cl, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2 y 5% de glicerol (pH 8,0) al día siguiente y dialice 5 h a 4 °C.
    2. Recoja las partículas del virus dializadas con una jeringa de 2 ml. Prepare varias alícuotas de los pequeños volúmenes deseados (20-200 μL) y almacene el virus purificado a -80 °C.
      NOTA: El título de partículas del virus purificado se puede determinar midiendo el contenido de ADN genómico, y el título de infectividad se puede determinar en células HEK293 contando las células GFP positivas con el ensayo de dilución limitante.

7. Identificación del genoma de adenovirus recombinante mediante digestión enzimática de restricción

  1. Infectar una monocapa confluente del 80%-90% de células HEK293 cultivadas en un matraz T-25 con adenovirus recombinante. Incubar durante 2 h a 37 °C. Reemplace el medio de cultivo con DMEM fresco que contenga 2% de FBS.
  2. Extraer el sobrenadante del cultivo y extraer el ADN genómico viral con el método de Hirt modificado descrito en el paso 1.3 cuando se produzca CPE en un plazo de 2-3 días.
  3. Digerir el ADN genómico del adenovirus recombinante con las enzimas indicadas y analizar en electroforesis en gel de agarosa. El plásmido adenoviral recombinante sirvió como control.

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Resultados

La estrategia para la construcción de un clon infeccioso de HAdV-7 se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. Se seleccionaron aleatoriamente dos plásmidos clonales infecciosos y se identificaron mediante BstZ17 I, BamH I y EcoR V, respectivamente. Los resultados mostraron que los fragmentos fueron consistentes con el tamaño esperado (Figura 2A), lo que indica que los plásmidos fueron construidos correctamente. Se pudieron ver focos d...

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Discusión

Los diferentes adenovirus tienen varios tropismos tisulares, y la prevalencia de la inmunidad preexistente del huésped contra diferentes adenovirus puede fluctuar intensamente en los seres humanos24, lo que atrae el interés en la construcción de nuevos vectores adenovirales para la terapia génica o el desarrollo de vacunas. Sin embargo, el establecimiento de un nuevo sistema de vectores adenovirales sigue siendo engorroso para los laboratorios genéricos de biologí...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7204258), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82161138001, 82072266), el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026), y la investigación y aplicación sobre el rastreo molecular de patógenos respiratorios esenciales en Beijing, por el Capital Health Development and Research of Special (2021-1G-3012).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mLAxygenMCT-150-CAlmacenamiento de virus Tubos de
centrífuga de polipropileno de 15 mLCorning430790Almacenamiento de virus Placas de
cultivo tratadas con TC de 150 mmCorning430599 Crecimiento de células HEK29E
Casete de diálisis MWCO de 20 KThermoFisher Scientific66005Diálisis de virus
Ácido acéticoAmresco714Extracción de ADN
Afl IINEBR0520Digestión
AgarosaTakara5260Electroforesis
Age INEBR0552Digestión
Asc INEBR0558Digestión
BamH INEBR0136Digestión
Benzonasa NucleasaSigmaE8263-25KUPurificación de virus
BsrG INEBR0575Digestión
Elevadorde células Corning3008Raspar las células 
CsClSigmaC3032Kit de recuperación de gel de ADN de purificación de virus
ZymoD4045Recuperación de ADN
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 células medio
E.coli TOP10 células competentesTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Transformación del producto de montaje
EcoR VNEBR3195Digestión
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extracción de ADN
Suero fetal bovino (FBS)CytivaSV30208.02Cultivo de células HEK293
ADN genómico Kit de limpieza y concentraciónZymoD4065Purificación de ADN
GlicerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Diálisis de células del virus
HEK293ATCCCRL-1573Amplificación del virus
polimerasa de alta fidelidadNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestión
Sulfato de kanamicinaAmresco408Selección de plásmido
Kpn INEBR3142Digestión
Lambda/HindIII Marcador de ADNTakara3403Electroforesis
Caldo LBBD240230LB placa para bacterias
LB medioSolarbio Life ScienceL1010Medio para bacterias
MgCl2Sigma63068Diálisis de virus
MicrocentrífugaThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtracción de ADN
NaClSigmaS5886Diálisis del virus
NdeI NEBR0111Digestión
NEBuilder HiFi Ensamblaje de ADN Master MixNEBE2621Ensamblaje de ADN
NheI NEBR0131Digestión
Fosfato tamponado solución salinaCytiva SH30256.01Lavado de células
PipetaThermo Fisher ScientificMatrixAspirate el medio
Plasmid Maxprep Kit VigorousBiotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extracción de
plásmido de ADN Miniprep KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD.DP103Extracción de ADN
Pme INEBR0560
Digestión Acetato de potasioAmresco698Extracción de ADN
proteasa KThermo Fisher ScientificAM2542Extracción de ADN
pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
RNasaBeyotimeD7089Extracción de ADN
Sal INEBR0138Digestión
Sbf INEBR3642Digestión
SDSAmresco227Extracción de ADN
Rotor de cubo oscilanteHITACHIS52STPurificación de
virus Matraz de células T-25Corning430639Crecimiento de células HEK29E
Matraz de células T-75Corning 430641Crecimiento de células HEK29E
Reactivo de transfecciónPolyplus-transfection114-15Transfección
Microscopio electrónico de transmisiónFEITECNAI 12Objetación del virus
Tris-HClAmresco234Diálisis del virus
UltracentrífugaHITACHIHimac CS120GXIIPurificación del virus
ADN

Referencias

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