Construcción de vectores adenovirales utilizando tecnología de ensamblaje de ADN

Xiaohui Zou; Yun Zhu; Chenglong Li; Yali Duan; Linlin Zhang; Xiaojuan Guo; Wenzhe Hou; Zhengde Xie; Zhuozhuang Lu

doi:10.3791/64033

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Artículo de método

Construcción de vectores adenovirales utilizando tecnología de ensamblaje de ADN

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DOI:

10.3791/64033

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16 de junio de 2022

Xiaohui Zou^*¹ , Yun Zhu^*² , Chenglong Li¹^,³ , Yali Duan² , Linlin Zhang² , Xiaojuan Guo¹ , Wenzhe Hou¹ , Zhengde Xie²^,⁴ , Zhuozhuang Lu¹^,⁵

¹NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, ²Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, National Center for Children’s Health, ³Henan Chemical Technician College, ⁴Research Unit of Critical Infection in Childre, Chinese Academy of Medical Sciences, ⁵Chinese Academy of Sciences Joint Research Center for Emerging Infectious Diseases and Biosafety, Chinese Center for Disease Control and Prevention-Wuhan Institute of Virology

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este estudio, se construyó un clon infeccioso de adenovirus humano tipo 7 (HAdV-7) y se estableció un sistema de vectores HAdV-7 con deleción E3 modificando el clon infeccioso. Esta estrategia utilizada aquí se puede generalizar para crear vectores de transferencia de genes de otros adenovirus de tipo salvaje.

Resumen

Los vectores adenovirales se han utilizado como herramienta de transferencia de genes en la terapia génica durante más de tres décadas. Aquí, presentamos un protocolo para construir un vector adenoviral mediante la manipulación del ADN genómico de HAdV-7 de tipo salvaje mediante el uso de un método de ensamblaje de ADN. En primer lugar, se generó un clon infeccioso de HAdV-7, pKan-Ad7, mediante la fusión del ADN genómico viral con un producto de PCR a partir de la columna vertebral del plásmido, que comprende el gen resistente a la kanamicina y el origen de la replicación (Kan-Ori), a través del ensamblaje del ADN. Esto se hizo mediante el diseño de un par de cebadores de PCR, que contenían ~ 25 nucleótidos de la secuencia terminal de la repetición terminal invertida (ITR) de HAdV-7 en el extremo 5', un sitio de enzima de restricción no cortador para el genoma de HAdV-7 en el medio y una secuencia específica de plantilla para el cebado de PCR en el extremo 3'. En segundo lugar, se empleó una estrategia intermedia basada en plásmidos para reemplazar la región E3 con elementos que expresan transgenes en el clon infeccioso para generar un vector adenoviral. Brevemente, pKan-Ad7 se digirió con la enzima de restricción Hpa I de doble corte, y el fragmento que contiene la región E3 se ligó a otro producto de PCR de la columna vertebral del plásmido mediante el ensamblaje de Gibson para construir un plásmido intermedio pKan-Ad7HpaI. Para mayor comodidad, se utilizó el ensamblaje de restricción para designar el método de clonación de plásmidos de digestión y ensamblaje de restricción combinados. Usando el ensamblaje de restricción, los genes E3 en pKan-Ad7HpaI se reemplazaron con un casete de expresión de proteína fluorescente verde (GFP), y la región E3 modificada se liberó del plásmido intermedio y se restauró al clon infeccioso para generar un plásmido adenoviral pKAd7-E3GFP. Finalmente, pKAd7-E3GFP se linealizó por digestión de Pme I y se utilizó para transfectar celdas de empaquetamiento HEK293 para rescatar el virus HAdV-7 recombinante. Para concluir, aquí se introdujo una estrategia basada en el ensamblaje de ADN para construir vectores adenovirales en laboratorios generales de biología molecular sin la necesidad de materiales e instrumentos especializados.

Introducción

En las últimas tres décadas, los vectores adenovirales recombinantes se han utilizado ampliamente en el desarrollo de vacunas y la terapia génica 1,2,3,4, así como en la investigación básica debido a sus excelentes propiedades biológicas, como la alta eficiencia de la transducción de genes, la no integración con el genoma del huésped, el genoma viral manipulador y la facilidad de producción a gran escala.

En la actualidad, los vectores adenovirales más utilizados se construyen a p....