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Artículo de método

Generación de organoides de retina derivados de iPSC en pacientes humanos para modelar la retinosis pigmentaria

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DOI:

10.3791/64045

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16 de junio de 2022

 ,  , 
1Beijing Tongren Hospital, Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory, Beijing Tongren Eye Center, Capital Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este protocolo, se generaron organoides retinianos 3D derivados de células madre pluripotentes (iPSC) inducidos por pacientes con retinosis pigmentaria. Esos organoides recapitularon con éxito algunos fenotipos clínicos de la enfermedad de la retinosis pigmentaria.

Resumen

La retinosis pigmentaria (RP) es una enfermedad degenerativa de la retina rara y hereditaria con una prevalencia de aproximadamente 1/4.000 personas en todo el mundo. La mayoría de los pacientes con RP tienen una degeneración progresiva de los fotorreceptores que conduce a la pérdida de la visión periférica, ceguera nocturna y, finalmente, ceguera total. Hasta la fecha, se han reportado miles de mutaciones en más de 90 genes asociadas con la RP. En la actualidad, hay pocos modelos animales disponibles para todos los genes afectados y los diferentes tipos de mutaciones, lo que dificulta en gran medida el desciframiento de los mecanismos subyacentes a la patología gen/mutación y limita el tratamiento y el desarrollo de fármacos. Los organoides retinianos (RO) derivados de células madre pluripotentes (iPSC) inducidos por el paciente han proporcionado un mejor sistema para modelar la enfermedad de inicio temprano en humanos que las células y los animales. Con el fin de estudiar la RP, se utilizaron los organoides de la retina 3D derivados del paciente para recapitular los fenotipos clínicos de la RP. En las RO derivadas de pacientes con RP, la mala localización de la rodopsina se mostró claramente. En comparación con otros modelos animales, los modelos de organoides retinianos derivados de iPSC de pacientes recapitularon más de cerca las características de RP y representan un enfoque ideal para investigar la patogénesis de la enfermedad y para el desarrollo de fármacos.

Introducción

Las enfermedades de la retina humana, como la retinosis pigmentaria y la degeneración macular asociada a la edad, son poco conocidas debido a la falta de modelos experimentales apropiados 1,2. Aunque la retina del ratón es muy similar a la retina humana y es una poderosa herramienta para estudiar la etiología de la degeneración de la retina, existen enormes diferencias entre las especies de ratones y humanos 3,4. Por ejemplo, la arquitectura nuclear de las células fotorreceptoras en ratones y humanos es diferente, y la retina del ratón no posee una mácula 5,6. La tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) nos permite devolver las células especializadas de los organismos al estado pluripotente inicial a través de los procesos de "reprogramación" mediante combinaciones de factores de transcripción y/o compuestos 7,8,9,10. Esas iPSC tienen una capacidad casi ilimitada de división y proliferación, y podrían convertirse en varios tipos de células. Recientemente, se han desarrollado organoides retinianos 3D derivados de iPSC para modelar los eventos tempranos del desarrollo de la retina humana y para delinear la fisiopatología de las enfermedades de la retina humana 11,12,13,14,15. Los organoides de la retina tienen muchas ventajas: (1) se pueden utilizar para recapitular in vivo el desarrollo de la retina y la patogénesis de la enfermedad; (2) pueden utilizarse para el cribado de fármacos de alto rendimiento y para ensayos preclínicos de terapia génica; y (3) pueden ser utilizados como evaluaciones preclínicas de las opciones de tratamiento para las enfermedades degenerativas de la retina16,17.

Uno de los objetivos de este proyecto fue estudiar la patogenia de la retina pigmentosa (RP), una enfermedad incurable debido a su extrema heterogeneidad18. Hasta la fecha, se han identificado más de 90 genes asociados con la RP19,20. El gen RPGR, que se considera uno de los genes causantes más prevalentes de la RP15, representa aproximadamente el 16% de todas las RP 4,21,22. Las iPSCs portadoras de una mutación de cambio de marco en el gen RPGR se han generado y diferenciado con éxito en organoides retinianos 3D organizados y estratificados14. Al utilizar estos organoides, se observó una morfología anormal de la capa de fotorreceptores y la dislocación de opsinas en los fotorreceptores.

En conjunto, aquí se describe en detalle un protocolo paso a paso y accesible sobre cómo generar organoides retinianos 3D derivados del paciente23,24. Esos organoides recapitularon con éxito algunos fenotipos clínicos de la enfermedad. Esto proporciona un modelo alentador para estudiar el desarrollo de la retina y los mecanismos de la enfermedad, para el cribado terapéutico y para evaluar futuras terapias génicas preclínicas.

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Protocolo

El protocolo sigue las directrices del comité de ética de investigación en seres humanos de Capital Medical University.

1. Cultivo celular y generación de iPSCs

  1. Elija pacientes con RPGR para este estudio. En este caso, se utilizaron tres pacientes, un portador familiar y tres controles sanos. El paciente 1 poseía una mutación c.1685_1686delAT en el exón 14 del gen RPGR, el paciente 2 albergaba una mutación c.2234_2235delGA en el exón 15 del gen RPGR y el paciente 3 tenía una mutación c.2403_2404delAG en el exón 15 del gen RPGR. Elegir tres voluntarios sanos como controles14. Recolectar muestras de sangre total periférica de los pacientes y controles sanos con venopunción, y colocarlas en tubos de recolección de sangre (Tabla de Materiales).
  2. Aísle células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad con un medio de gradiente de densidad25. Expanda las PBMC CD34+ activadas con citocina en 8 mL de medio de mejora del crecimiento (Tabla 1) en una placa de Petri.
  3. Después de 1 semana, electropore las células mononucleares de sangre periférica CD34 positivas con un sistema de transfección (Tabla de materiales) y elija las células CD34 positivas y el programa T-01 incorporado sin ninguna modificación. Transfectar un cóctel de plásmidos de reprogramación (2 μg) que podrían producir proteínas humanas OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC y KLF4.
  4. Siembre las células transfectadas en placas de seis pocillos recubiertas de proteínas recombinantes humanas con vitronectina en 2 mL de DMEM/F12 suplementadas con B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0,5 μM), bFGF (100 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0,5 μM) y hLIF (1000 U/mL) para mantener el crecimiento de las iPSC.
  5. 3 semanas después de la transducción, recoja las colonias de iPSC manualmente, posteriormente transfiéralas a placas de seis pocillos y manténgalas en el reactivo B (Tabla de Materiales) para su expansión.
    NOTA: Las placas de seis pocillos deben estar recubiertas con proteína recombinante humana de vitronectina. Diluir la solución de vitronectina en DPBS hasta alcanzar una concentración final de 10 μg/mL. Agregue la vitronectina diluida a placas de seis pocillos tratadas con cultivo de tejidos. Gire el material de cultivo para esparcir la solución de vitronectina de manera uniforme por la superficie de las placas de seis pocillos. Incubar las placas a 37 °C durante al menos 1 h.
  6. Asegúrese de que las células estén desagregadas con EDTA de 0,5 mM cuando las iPSC alcancen una confluencia de alrededor del 80%-90% y que la relación de división sea 1:8 o 1:10. El día del paso, añadir blebbistatina (2,5 μM) al reactivo B (Tabla 1).
    NOTA: La blebbistatina se utilizó para promover la adhesión celular y la viabilidad de las células madre y prevenir la apoptosis de las células madre. 18 h después, el medio debe refrescarse con el reactivo B.

2. Generación de RO humanos

NOTA: Las iPSCs deben estar disociadas cuando las iPSCs alcanzan alrededor del 80%-90% de confluencia.

  1. Disocie las colonias humanas de iPSC (hiPSC) utilizando EDTA 0,5 mM a 37 ◦C durante 5 min.
  2. Separe los grupos de hiPSC en celdas individuales mediante un pipeteo suave. Cuente las células para su mantenimiento y cultírelas en el reactivo B (Tabla 1).
  3. En el día 0, siembre 12.000 células/pocillo en 96 pocillos cónicos con fondo en V para la reagregación celular en 100 μL de medio de diferenciación (Tabla 1).
  4. El día 6, aspire cuidadosamente el medio de cultivo celular y agregue 100 μL del medio de diferenciación que contiene 20 μM Y 27632 y 1,5 nM (55 ng/mL) hBMP4.
  5. En el día 9, reemplace la mitad del medio de diferenciación para mantener la concentración de hBMP4 en alrededor de 0,75 nM.
  6. Aspire 60 μL del medio de diferenciación de cada pocillo y añada 60 μL del medio de diferenciación fresco que contenga 20 μM Y-27632 a cada pocillo.
  7. En el día 12, reemplace la mitad del medio de diferenciación con un medio de diferenciación nuevo para lograr 0,375 nM hBMP4.
  8. El día 18, transfiera los agregados a una nueva placa de Petri con puntas de 10 ml y corte cada agregado en 2-4 piezas con un bisturí microquirúrgico bajo un microscopio invertido para generar más organoides.
  9. Transfiera los agregados del mismo grupo a un tubo de centrífuga de 15 mL. Cuando los agregados se depositen en el fondo de los tubos, aspire el sobrenadante.
  10. Resuspender los agregados con 1 mL de medio de retina neural (DMEM/F12, 10% de suero fetal bovino, 1% de suplemento de N-2, 0,5 μM de ácido retinoico, 0,1 mM de taurina, 1% de penicilina-estreptomicina) y transferirlos a placas de Petri antiadherentes con 15 mL de medio de retina neural. Coloque de 10 a 15 organoides retinianos en una placa de Petri.
  11. Refresque el medio de cultivo cada 5 días. Mantener el cultivo en la oscuridad, ya que el ácido retinoico es sensible a la luz (Figura 1), y controlar la formación del tejido retiniano humano autoorganizado con un microscopio invertido 26,27,28,29.

3. Análisis de organoides retinianos

  1. Tinción de inmunofluorescencia de retinas 3D derivadas de hiPSC
    1. Fijar la retinae 3D en 1 mL de paraformaldehído fresco al 4% en DPBS durante 20 min a 4 °C. A continuación, enjuague los organoides con 1 ml de tampón DPBS.
    2. Mida 0,5 g de agarosa (Tabla de Materiales) y mezcle el polvo de agarosa con 100 mL de DPBS en un matraz apto para microondas. Use un microondas para disolver la agarosa durante 1-3 minutos hasta que se disuelva por completo. Deje que la solución de agarosa se enfríe a unos 40 °C.
    3. Incrustarlos en el 2% en DPBS.
    4. Corta las muestras en secciones con un grosor de 50 μm con un vibrátomo. Coloque las secciones cortadas en rodajas en portaobjetos de microscopio de adhesión (Tabla de materiales) y guárdelas a -80 °C.
    5. Descongele las rodajas durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
    6. Lave las rodajas con DPBS durante 5 minutos y repita 3 veces.
    7. Utilice Triton X-100 al 0,5% en una solución DPBS para permeabilizar las rodajas durante 15 min a RT.
    8. Retire la solución de permeabilidad, lave las rodajas con DPBS durante 5 minutos y repita 3 veces.
    9. Incubar las rodajas con 1% de BSA y 0,5% de Triton X-100 en DPBS durante 30 min en RT.
    10. Incubar las rodajas con anticuerpo anti-rodopsina (1:1000) y anticuerpo anti-L/M opsina (1:1000) diluidos en BSA al 1% y Triton X-100 al 0,1% durante 16 h a 4 °C.
    11. Lave las rodajas con DPBS durante 5 minutos y repita 3 veces.
    12. Incubar las rodajas con anticuerpo secundario anti-ratón y conejo de burro (1:500) diluido en BSA al 1% y Triton X-100 al 0,1% durante 1 h a RT.
    13. Añadir 30 nM 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en DPBS durante 15 min en RT para la tinción nuclear.
    14. Lave las rodajas con DPBS durante 5 minutos y repita 5 veces.
    15. Monte las rebanadas con medio de inclusión (Tabla de Materiales) y cubra las correderas (Tabla de Materiales). Consérvelo en una caja oscura y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 4 semanas.
  2. Extracción de ARN y secuenciación de ARN
    1. Recoja de 1 a 3 (según tamaños) retinas 3D derivadas de cada control y paciente en los mismos puntos de tiempo de diferenciación (día 0, día 47, día 91, día 121 y día 151) en 1 ml de reactivo de extracción de ARN (Tabla de materiales) en hielo.
    2. Utilice el homogeneizador (Tabla de materiales) para interrumpir las muestras, 1 min ON, 30 s OFF, durante tres ciclos, y compruebe si hay interrupciones en la muestra.
    3. Detenga la homogeneización cuando las muestras estén totalmente homogeneizadas, y agite el tubo vigorosamente durante 30 s.
    4. Incubar las muestras en hielo durante 15 min.
    5. Centrifugar las muestras a 13.800 x g durante 15 min a 4 °C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo libre de RNasa de 2 mL.
    6. Añadir 0,4 mL de cloroformo al tubo, al vórtice y a la centrífuga a 13.800 x g durante 10 min a 4 °C.
    7. Transfiera con cuidado una porción (aproximadamente 2/3) de la fase superior incolora a un nuevo tubo libre de RNasa. No aspire ni altere la interfaz blanca que contiene ADN.
    8. Añadir 0,5 mL de isopropanol frío, vórtice durante 30 s y centrifugar a 13.800 x g durante 15 min a 4 °C. Se forma un gránulo en el costado del fondo del tubo.
    9. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con la punta de una pipeta y guarde el pellet.
      NOTA: La bolita de ARN es gelatinosa y transparente cuando la pureza es muy alta.
    10. Añadir 1 mL de etanol frío al 70%, vorexear las muestras vigorosamente durante 30 s y centrifugar a 13.800 x g durante 10 min a 4 °C.
    11. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con la punta de una pipeta y seque al aire el pellet en la campana a RT durante 5-10 min. No seque demasiado el pellet.
    12. Añadir 20-50 μL de agua sin RNasa y volver a suspender el pellet con cuidado pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    13. Aplique 1 μL de ARN en un espectrofotómetro (Tabla de Materiales). Se utilizaron alrededor de 10 μg de ARN de controles y pacientes, respectivamente, para la preparación de la biblioteca Illumina30.
    14. Almacene el ARN a -80 °C.

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Resultados

La ilustración esquemática describe los procedimientos de diferenciación para generar organoides retinianos sanos y derivados de iPSC en pacientes (Figura 1). Desde iPSC hasta RO, se pueden producir variaciones debido a varios factores. El estado de la iPSC es el paso determinante de la generación de ósmosis inversa. Además, se recomienda encarecidamente que los investigadores registren cada paso, catálogo y número de lote de todos los medios para que se pueda realizar un seguimiento de todo...

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Discusión

Los organoides de la retina son estructuras laminadas en 3D derivadas de hiPSCs o células madre embrionarias (ESC) y se presentan como un modelo muy prometedor para imitar los patrones espaciales y temporales del desarrollo de la retina humana31,32. Las RO consisten en varios tipos de células de la retina, incluidos los fotorreceptores, las células bipolares, las células ganglionares, las células amacrinas, las células horizontal...

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Divulgaciones

Todos los autores no revelan conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a M.S. Yan-ping Li y Zhuo-lin Liu por su apoyo técnico y sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (Z200014, 82125007) y el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2017YFA0105300).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
96 pozos cónicos con fondo en VSumitomo BaquelitaMS-9096VZ
A-83– 01R& D Systems2939/10
Portaobjetos de microscopio de adherenciaCITOtest188105
AgarosaGene Tech111760
Amaxa Dispositivo Nucleofector 2bLonzaAAB-1001 Sistema detransfección
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR& D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Tubo de extracción de sangreBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Portaobjetos de cubiertaCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MedioNuwacell Biotechnologies RP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Jamón' s F12Gibco10565-042
Burro anti-ratón 488InvitrogenA-21202
Burro anti-conejo 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Medio de inclusiónReactivo FluorSaveTM 345789
EX-CYTE medio de mejora del crecimientoSigma811292Medio de mejora del crecimiento
Suero fetal bovinoGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Medio de gradiente de densidad
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061 Suplemento deL-glutamina
HA-100STEMCELL Technologies72482
Jamón' s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
HomogeneizadorEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove' s Dulbecco Medium ModificadoGibco12440053
KnockOut Serum Reemplazo - Multi-SpeciesGibcoA3181502Medios de reemplazo de suero
L/M-opsinaMilliporeab5405
MonotioglicerolSigmaM6145
N-2 suplementoThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop EspectrofotómetroThermo Fisher ScientificND2000Espectrofotómetro
ncEpic 125x SuplementoNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Suplemento
ncEpic Medio basalNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Medio basal hpsc
ncLaminin511 proteína recombinante humanaNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
BMP4 humano recombinanteR& D Systems314-BP
Ácido retinoicoSigmaR2625
RodopsinaSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM medioSTEMCELL Technologies09600
TaurinaSigmaT8691
Trizol reactivoInvitrogen15596026
VitronectinaNuwacell BiotechnologiesRP01002
Cuchillo V-LanceAlcon Surgical 8065912001

Referencias

  1. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  2. Lin, Q., et al. Generation of nonhuman primate model of cone dysfunction through in situ AAV-mediated CNGB3 ablation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 869-879 (2020).
  3. Zhou, M., Liu, Y., Ma, C. Distinct nuclear architecture of photoreceptors and light-induced behaviors in different strains of mice. Translational Vision Science & Technology. 10 (2), 37(2021).
  4. Zito, I., et al. RPGR mutation associated with retinitis pigmentosa, impaired hearing, and sinorespiratory infections. Journal of Medical Genetics. 40 (8), 609-615 (2003).
  5. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  6. Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A Comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), 0125631(2015).
  7. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  8. Han, J. W., Yoon, Y. S. Induced pluripotent stem cells: Emerging techniques for nuclear reprogramming. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (7), 1799-1820 (2011).
  9. Kim, J. S., Choi, H. W., Choi, S., Do, J. T. Reprogrammed pluripotent stem cells from somatic cells. International Journal of Stem Cells. 4 (1), 1-8 (2011).
  10. Li, Y. P., Liu, H., Jin, Z. B. Generation of three human iPSC lines from a retinitis pigmentosa family with SLC7A14 mutation. Stem Cell Research. 49, 102075(2020).
  11. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  12. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 366(2020).
  13. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  14. Deng, W. L., et al. Gene correction reverses ciliopathy and photoreceptor loss in iPSC-derived retinal organoids from retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  15. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
  16. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  17. Aasen, D. M., Vergara, M. N. New drug discovery paradigms for retinal diseases: A focus on retinal organoids. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 36 (1), 18-24 (2020).
  18. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  19. Anasagasti, A., Irigoyen, C., Barandika, O., Lopez de Munain, A., Ruiz-Ederra, J. Current mutation discovery approaches in Retinitis Pigmentosa. Vision Research. 75, 117-129 (2012).
  20. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Genes and mutations causing autosomal dominant retinitis pigmentosa. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (10), 017129(2014).
  21. Kortum, F., et al. X-linked retinitis pigmentosa caused by non-canonical splice site variants in RPGR. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 850(2021).
  22. Megaw, R. D., Soares, D. C., Wright, A. F. RPGR: Its role in photoreceptor physiology, human disease, and future therapies. Experimental Eye Research. 138, 32-41 (2015).
  23. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).
  24. Liu, H., Hua, Z. Q., Jin, Z. B. Modeling human retinoblastoma using embryonic stem cell-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100444(2021).
  25. Zhang, X. H., Xie, Y., Xu, K., Li, Y. Generation of an induced pluripotent stem cell line BIOi002-A from a patient with autosomal dominant optic atrophy. Stem Cell Research. 53, 102278(2021).
  26. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286(2015).
  28. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  29. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  30. Kumar, R., et al. A high-throughput method for illumina RNA-seq library preparation. Frontiers in Plant Science. 3, 202(2012).
  31. Fligor, C. M., et al. Three-dimensional retinal organoids facilitate the investigation of retinal ganglion cell development, organization and neurite outgrowth from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 8 (1), 14520(2018).
  32. Morizur, L., Herardot, E., Monville, C., Ben M'Barek, K. Human pluripotent stem cells: A toolbox to understand and treat retinal degeneration. Molecular and Cellular Neurosciences. 107, 103523(2020).
  33. Bhatt, L., Groeger, G., McDermott, K., Cotter, T. G. Rod and cone photoreceptor cells produce ROS in response to stress in a live retinal explant system. Molecular Vision. 16, 283-293 (2010).
  34. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  35. Xue, Y., et al. Retinal organoids long-term functional characterization using two-photon fluorescence lifetime and hyperspectral microscopy. Frontiers in Cellular Neurosciences. 15, 796903(2021).
  36. Colombo, L., et al. Comparison of 5-year progression of retinitis pigmentosa involving the posterior pole among siblings by means of SD-OCT: A retrospective study. BMC Ophthalmology. 18 (1), 153(2018).
  37. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: Genes and disease mechanisms. Current Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  38. Shintani, K., Shechtman, D. L., Gurwood, A. S. Review and update: Current treatment trends for patients with retinitis pigmentosa. Optometry. 80 (7), 384-401 (2009).
  39. Wang, A. L., Knight, D. K., Vu, T. T., Mehta, M. C. Retinitis pigmentosa: Review of current treatment. International Ophthalmology Clinics. 59 (1), 263-280 (2019).
  40. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  41. Parfitt, D. A., et al. Identification and correction of mechanisms underlying inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell Stem Cell. 18 (6), 769-781 (2016).
  42. Shimada, H., et al. In vitro modeling using ciliopathy-patient-derived cells reveals distinct cilia dysfunctions caused by CEP290 mutations. Cell Reports. 20 (2), 384-396 (2017).
  43. Deretic, D., Wang, J. Molecular assemblies that control rhodopsin transport to the cilia. Vision Research. 75, 5-10 (2012).
  44. Rao, K. N., Li, L., Anand, M., Khanna, H. Ablation of retinal ciliopathy protein RPGR results in altered photoreceptor ciliary composition. Scientific Reports. 5, 11137(2015).
  45. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33(2021).
  46. Zhang, X. H., Jin, Z. B. Patient iPSC-derived retinal organoids: Observable retinal diseases in-a-dish. Histology and Histopathology. 36 (7), 705-710 (2021).

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