Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas

Resumen

El conjunto estructural de la alfa-sinucleína monomérica afecta su función fisiológica y sus propiedades fisicoquímicas. El presente protocolo describe cómo realizar espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos y análisis de datos posteriores para determinar información conformacional sobre el monómero de esta proteína intrínsecamente desordenada en condiciones fisiológicas.

Resumen

La alfa-sinucleína (aSyn) es una proteína intrínsecamente desordenada cuyos agregados fibrilares son abundantes en los cuerpos de Lewy y las neuritas, que son las características distintivas de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, gran parte de su actividad biológica, así como su agregación, involucra centralmente la forma de monómero soluble de la proteína. La elucidación de los mecanismos moleculares de la biología y fisiopatología de aSyn requiere métodos estructuralmente altamente resueltos y es sensible a las condiciones biológicas. Sus estructuras metaestables desplegadas de forma nativa hacen que el aSyn monomérico sea intratable para muchas técnicas de biología estructural. Aquí, se describe la aplicación de uno de estos enfoques: espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX-MS) en la escala de tiempo de milisegundos para el estudio de proteínas con baja estabilidad termodinámica y factores de protección débiles, como aSyn. En la escala de tiempo de milisegundos, los datos de HDX-MS contienen información sobre la accesibilidad al disolvente y la estructura unida al hidrógeno de aSyn, que se pierden en tiempos de etiquetado más largos, lo que en última instancia produce una resolución estructural hasta el nivel de aminoácidos. Por lo tanto, HDX-MS puede proporcionar información a altas resoluciones estructurales y temporales sobre dinámica conformacional y termodinámica, interacciones intra e intermoleculares, y el impacto estructural de mutaciones o alteraciones en las condiciones ambientales. Si bien es ampliamente aplicable, se demuestra cómo adquirir, analizar e interpretar mediciones de HDX-MS de milisegundos en aSyn monomérica.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a millones de personas en todo el mundo¹. Se caracteriza por la formación de inclusiones citoplasmáticas conocidas como cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy en la región de la sustancia negra pars compacta del cerebro. Se ha encontrado que estas inclusiones citoplasmáticas contienen agregados de la proteína intrínsecamente desordenada aSyn². En la EP y otras sinucleinopatías, aSyn se transforma de un estado desordenado soluble en un estado enfermo insoluble y altamente estructurado. En su forma nativa, aSyn monomérico adopta una amplia gama de c....

Protocolo

1. Expresión proteica y purificación de aSyn

1. Prepare aSyn siguiendo un informe publicado anteriormente⁹.
2. Dializar en un tampón de almacenamiento seguro (por ejemplo, Tris, pH 7.2 ).
3. Si es necesario, concentre la muestra (por ejemplo, tubos de microcentrífuga de filtro de espín utilizando 3 kDa MWCO, 14,000 x g durante aproximadamente 10-30 min, consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Se aconseja no concentrarse excesivamente. La integridad del conjunto de monómeros no se ha verificado más allá de 25 μM.
4. Alícuota y conservación a −80 °C
   NOTA: La proteína mon....

Resultados

Debido a su naturaleza intrínsecamente desordenada, es difícil capturar los intrincados cambios estructurales en aSyn a pH fisiológico. HDX-MS monitorea el intercambio isotópico en los hidrógenos de amida de la columna vertebral, sondeando la dinámica e interacciones conformacionales de las proteínas. Es una de las pocas técnicas para adquirir esta información a altas resoluciones estructurales y temporales. Este protocolo es ampliamente aplicable a una amplia gama de proteínas y condiciones tampón, y esto se ejemplifica.......

Discusión

En el presente artículo, se describen los siguientes procedimientos: (1) realizar experimentos de mapeo de péptidos en aSyn monomérico para obtener la mayor cobertura de secuencia, (2) adquirir datos de HDX-MS de milisegundos en aSyn monomérico en condiciones fisiológicas, y (3) realizar análisis de datos e interpretación de los datos hdX-MS resultantes. Los procedimientos proporcionados son generalmente fáciles de ejecutar, cada experimento de etiquetado generalmente dura solo alrededor de 8 h para tres réplicas y ocho .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 y veces; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μ m Columna C18	Columna	186002346	Waters Corporation
Acetonitrilo Grado de HPLC >99,9% HiPerSolv	VWR	20060.420	Para fases móviles LC
CaCl2	Sigma Aldrich	C5670	Sal para tampones HDX
Chronos	Axel Semrau (Comprado a Waters Corporation)	667006090	Software de programación para habilitar múltiples inyecciones de muestras HDX-MS automáticamente. Hay software alternativo disponible de otros proveedores, por ejemplo, HDXDirector o LEAP Shell
Cloruro de deuterio	Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)	DLM-2-50	Para tampones de etiquetado HDX
Óxido de deuterio (99,9% D2O)	Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)	DLM-4	Agua deuterada
DynamX 3.0	Waters Corporation	176016027	Asignación isotópica y cálculo de la incorporación de deuterio
Enzymate BEH Columna de pepsina	Waters Corporation	186007233	Columna de digestión de pepsina
Ácido fórmico, 99.0% Grado LC/MS	Fisher Scientific	10596814	para fases móviles LC
Clorhidrato de guanidinio	Sigma Aldrich	RDD001-500G	Chaotrope/Desnaturalizante
HDfleX	Universidad de Exeter	N/A	https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl	Sigma Aldrich	P3911	Sal para tampones HDX
LEAP HDX-2 CTC Robot de muestreo PAL	Waters Corporation	725000637	Robot muestreador automático
Leucina encefalina Waters	Corporation	186006013	Para la calibración de espectrometría de masas lockspray
MassLynx	Waters Corporation	667004007	Software de control de métodos de entrada y espectrómetro de masas
Viales de máxima recuperación	Waters Corporation	600000670CV	Paquete de 100 con tapas incluidas: utilizado para bandeja de enfriamiento en LEAP HDX-2
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Sal para tampones HDX
Millipore 0.22 y micro; m filtros de jeringa	Millipore	N9CA7069B	Filtros de jeringa
ms2min	Applied Photophysics Ltd	N/A	de mezcla rápida de flujo de enfriamiento de milisegundos instrumento hdx
NaCl	Sigma Aldrich	S9888	Sal para tampones HDX
controlador de temperatura Peltier	LEAP Technologies Inc.	Controlador Peltier HP115-COOL/D	para ajustar con precisión la temperatura de las cámaras en el robot LEAP.
ProteinLynx Global Server 3.0	Waters Corporation	715001030	Software de identificación de péptidos. Hay software alternativo disponible de otros proveedores.
Envases de reactivos	100	186004632	Waters Corporation
Bote de reactivos para LEAP HDX-2 Paquete de	Waters 186001420Corporation		excluyendo los tapones, utilizados para tampones en LEAP HDX-2
Óxido de deutero sódico (99,5% en D2O)	Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)	DLM-57	Para tampones de etiquetado HDX
Tubos de microcentrífuga con filtro de centrifugado giratorio (3 kDa MWCO)	Amicon (Merck Sigma Aldrich)	UFC5003	Micro tubos centrífugos para concentrar proteínas. Esto facilita el intercambio de tampones y la carga precisa de muestras para experimentos HDX-MS.
Synapt G2-Si espectrómetro de masas	Waters Corporation	176850035	Espectrómetro
de masas Viales de recuperación total	Waters Corporation	600000671CV	Paquete de 100 con tapones incluidos - utilizado para etiquetar la bandeja en LEAP HDX-2
Tris-HCl	Sigma Aldrich T3253-250G		Tampón
Trizma base	Sigma Aldrich	T60040-B2005	Tampón
Urea	Sigma Aldrich	U5378-1KG	Chaotrope/Desnaturalizante
VanGuard 2,1 x 5 mm Columna ACQUITY BEH C18	Columna de desalinización de trampas	186004623	Waters Corporation

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