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Artículo de método

Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

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DOI:

10.3791/64064

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9 de agosto de 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Stem Cell Research (CSCR), A unit of InStem Bengaluru, Christian Medical College campus, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe un procedimiento optimizado de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para el injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Resumen

CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición de genes altamente versátil y eficiente adoptada ampliamente para corregir diversas mutaciones genéticas. La viabilidad de la manipulación génica de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) in vitro hace que las HSPC sean una célula diana ideal para la terapia génica. Sin embargo, las HSPC pierden moderadamente su potencial de injerto y repoblación multilinaje en el cultivo ex vivo . En el presente estudio, se describen las condiciones ideales de cultivo que mejoran el injerto de HSPC y generan un mayor número de células modificadas genéticamente in vivo. El informe actual muestra condiciones de cultivo in vitro optimizadas, incluido el tipo de medio de cultivo, la suplementación única de cóctel de moléculas pequeñas, la concentración de citoquinas, las placas de cultivo celular y la densidad de cultivo. Además de eso, se proporciona un procedimiento optimizado de edición de genes HSPC, junto con la validación de los eventos de edición de genes. Para la validación in vivo , se muestran los análisis de infusión y post-injerto de HSPC editados genéticamente en receptores de ratón. Los resultados demostraron que el sistema de cultivo aumentó la frecuencia de HSC funcionales in vitro, lo que resultó en un injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Introducción

La inaccesibilidad a donantes compatibles con antígenos leucocitarios humanos (HLA) en entornos de trasplante alogénico y el rápido desarrollo de herramientas de ingeniería genética altamente versátiles y seguras hacen del trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas (TCMH) una estrategia de tratamiento curativo para los trastornos sanguíneos hereditarios 1,2. La terapia génica autóloga con células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPC) implica la recolección de HSPC de los pacientes, la manipulación genética, la corrección de mutaciones causantes de enfermedades y el trasplante de HSPC corregidas genéticamente en el paciente 3,4. Sin embargo, el resultado exitoso de la terapia génica depende de la calidad del injerto trasplantable modificado genéticamente. Los pasos de manipulación génica y el cultivo ex vivo de HSPC afectan la calidad del injerto al disminuir la frecuencia de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSCs), lo que requiere la infusión de grandes dosis de HSPC manipuladas genéticamente 2,5,6.

Varias moléculas pequeñas, incluyendo SR1 y UM171, se están empleando actualmente para expandir robustamente las HSPC de la sangre del cordón umbilical 7,8. Para las HSPC adultas, debido al mayor rendimiento celular obtenido en la movilización, no se requiere una expansión robusta. Sin embargo, la retención del tallo de las HSPC aisladas en cultivo ex vivo es crucial para sus aplicaciones de terapia génica. Por lo tanto, se desarrolla un enfoque centrado en el enriquecimiento en cultivo de células madre hematopoyéticas (HSC) utilizando una combinación de moléculas pequeñas: resveratrol, UM729 y SR1 (RUS)7. Las condiciones optimizadas de cultivo de HSPC promueven el enriquecimiento de HSCs, resultando en una mayor frecuencia de HSCs modificadas genéticamente in vivo, y reducen la necesidad de manipular genes grandes dosis de HSPCs, facilitando enfoques de terapia génica rentables8.

Aquí, se describe un protocolo integral para el cultivo de HSPCs, junto con la infusión y el análisis de células editadas genéticamente in vivo.

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Protocolo

Los experimentos in vivo en ratones inmunodeficientes fueron aprobados y realizados siguiendo las directrices del Comité de Ética Animal del Instituto (IAEC), Christian Medical College, Vellore, India. Las muestras de sangre periférica movilizadas por el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) se recolectaron de donantes humanos sanos con consentimiento informado después de obtener la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB).

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) y purificación de células CD34+

  1. Realice el aislamiento PBMNC siguiendo los pasos a continuación.
    NOTA: Para el cultivo in vitro de HSPC y la edición de genes, comenzar con al menos 1 x 106 HSPCs/grupo es ideal. Para el análisis de injerto in vivo , un número de células iniciales de al menos 5 x 10 6 HSPCs/grupo es ideal si un grupo contiene ocho ratones y cada ratón está infundido con al menos6 x 105 células. Para obtener un número suficiente de PBMNC (~1 x 109) para el procedimiento, se recomienda comenzar con 20 ml de sangre periférica movilizada (mPB).
    1. Después de la recolección de mPB, diluir 20 ml de mPB con solución salina estéril 1x tamponada con fosfato (PBS) en una proporción de 1:1.
      NOTA: La eficacia de la movilización del G-CSF puede variar entre los individuos9, y por lo tanto, el número de CPHS obtenidos de 20 ml de sangre movilizada varía entre los donantes.
    2. Agregue 10 ml de medio de gradiente de densidad (Lymphoprep, consulte la Tabla de materiales) a un tubo de 50 ml y coloque la sangre diluida a través de los lados del tubo en una proporción de 1: 2.
      NOTA: Inclinar el tubo de 50 ml en un ángulo de 20° mientras se agrega la sangre diluida evita que se mezcle con Lymphoprep, lo que lleva a una separación clara de los componentes sanguíneos después de la centrifugación.
    3. Centrífuga a 600 x g durante 30 min a temperatura ambiente (RT) con una velocidad de aceleración de 1 m/s² y una velocidad de deceleración de 1 m/s². Desechar la capa superior (plasma) con una pipeta serológica y cosechar la capa leucocitaria presente en la interfase (PBMNC) por encima de la capa media de gradiente de densidad.
      NOTA: Aspirar la capa leucocitaria con una pipeta serológica girándola suavemente a los lados del tubo. Evite recoger un mayor volumen de interfase mientras aspira la capa leucocitaria para evitar la contaminación de granulocitos y glóbulos rojos.
    4. Transfiera los PBMNC a un tubo cónico fresco de 50 ml y diluya la suspensión celular con 1x PBS en una proporción de 1: 2.
      NOTA: Diluir la suspensión celular con 1x PBS en una proporción de 1:4 si se recogió un exceso de interfase mientras se aspiraba la capa leucocitaria.
    5. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente con una aceleración de 9 m/s² y una velocidad de deceleración de 7 m/s² y desechar el sobrenadante con una pipeta serológica. Agregue 30 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos helado (ver Tabla 7) al pellet e incubar en hielo durante 10 minutos. Mezclar invirtiendo el tubo cada 2 min.
    6. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente con una velocidad de aceleración de 9 m/s² y una velocidad de desaceleración de 7 m/s², y desechar el sobrenadante. Repita los pasos 1.1.5.-1.1.6. hasta que el enrojecimiento del pellet desaparezca. Resuspender el pellet con medios basales (IMDM, ver Tabla de materiales) y realizar un recuento de células utilizando azul de tripano en una cámara Neubauer10.
      NOTA: Los PBMNC aislados se pueden usar inmediatamente para purificar CD34+ HSPCs. Alternativamente, los PBMNCs pueden ser criopreservados y revividos siempre que sea necesario para el enriquecimiento CD34+. Para la criopreservación, centrifugar 5 x 108 células a 200 x g durante 5 min y añadir 4 ml de medios criogénicos que contengan IMDM: FBS: DMSO (ver Tabla de materiales) en una proporción de 7:2:1.
    7. Transfiera los viales a un refrigerador criogénico a 1 °C y guárdelos a -80 °C durante un máximo de 12 h. Transfiera y almacene los crioviales en un recipiente de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
  2. Revivir los PBMNC criopreservados.
    1. Descongelar a media los crioviales en un baño maría a 37 °C girando suavemente durante <1 min. Transfiera la suspensión celular del criovial a un tubo de 50 ml que contenga IMDM en una proporción de 1:10.
    2. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente con una velocidad de aceleración de 9 m/s² y una velocidad de deceleración de 7 m/s², y desechar el sobrenadante con una pipeta serológica.
  3. Purifice las células CD34 + de PBMNC siguiendo los pasos a continuación.
    1. Preparar el tampón de purificación con 1x PBS estéril que contenga 2% de suero bovino fetal filtrado (FBS). Resuspender el pellet de células PBMNC en el tampón de acuerdo con la Tabla 1.
      NOTA: El tampón debe estar libre de Ca++ y Mg++.
    2. Transfiera la suspensión celular que contiene 1 x 10 8-5 x 108 células de PBMNC frescos o criopreservados al tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Agregue DNasa (consulte la Tabla de materiales) a una concentración final de 100 μg/ml a la suspensión celular para evitar la aglutinación celular. Utilizamos un kit disponible comercialmente para la purificación de CD34 que contiene el cóctel de selección positiva de CD34 humano y las esferas rápidas de dextrano (ver Tabla de materiales).
    3. Agregue el cóctel de selección positiva de CD34 humano disponible comercialmente (consulte la tabla de materiales) a la concentración de 100 μL / ml de células y resuspenda suavemente.
    4. Incubar a RT durante 30 min y resuspender suavemente la suspensión celular cada 5 min. Agregue 50 μL/ml de esferas rápidas de Dextrano disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales) y vuelva a suspender suavemente.
      NOTA: Realice un vórtice de las esferas de dextrano a alta velocidad durante 5 s para asegurarse de que las partículas aparezcan dispersas uniformemente y luego agréguelas a las células.
    5. Incubar a RT durante 15 min y resuspender suavemente la suspensión celular cada 5 min. Haga la suspensión celular a un volumen total de 2.5 mL con tampón de purificación y vuelva a suspenderla suavemente.
    6. Coloque el tubo en un imán inmunomagnético libre de columna disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) e incube durante 5 minutos en RT. Después de la incubación, invierta el imán y deseche el sobrenadante en un movimiento continuo.
      NOTA: Las células CD34+ marcadas con Dextran Rapid Spheres permanecen atraídas a los lados del tubo por el campo magnético. El tubo debe mantenerse en posición invertida durante 2-3 s. Evite temblar o secar las gotas que quedan colgando de la boca del tubo.
    7. Retire el tubo del imán y agregue 2.5 ml de tampón de purificación. Repita los pasos 1.3.6-1.3.7 cinco veces.
      NOTA: Durante la adición del tampón de purificación, coloque el tubo en un ángulo agudo y agregue amortiguador girando el tubo, ya que las células podrían adherirse a las paredes de la superficie mientras invierten el imán.
    8. Después de completar cinco lavados, retire el tubo del imán, agregue 4 ml de PBS estéril 1x y vuelva a suspender la suspensión celular. Transfiera la suspensión celular al tubo de centrífuga de 15 ml y enfríe hasta 10 ml con 1x PBS. Realizar un recuento de células utilizando azul de tripano en una cámara de Neubauer10.
    9. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a RT (aceleración ~9 m/s², desaceleración ~7 m/s²) y desechar el sobrenadante con una pipeta. Para cultivar las HSPC, resuspenda las células en medios de cultivo HSPC, como se mencionó en el paso 2.1.
      NOTA: Los excesos de HSPC purificados se criopreservaron en un medio de criopreservación disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) a una densidad de 9 x 106 células/ml después de cultivar los HSPC durante 12 h en medios de cultivo HSPC.
  4. Revivir los HSPC criopreservados.
    1. Descongele los crioviales durante <1 min en un baño de agua a 37 °C mediante un suave remolino. Transfiera la suspensión celular en el criovial a un tubo de 50 ml.
    2. Agregue 1% de BSA resuspendido en 1x PBS gota a gota con agitación constante y enhebra hasta 20 mL. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente con una aceleración de 9 m/s² y una velocidad de desaceleración de 7 m/s² y desechar el sobrenadante con una pipeta serológica.
    3. Repita el paso 1.4.2. 1x. Vuelva a suspender las células en medios de cultivo y cultivo de HSPC como se describe en el paso 2.1.

2. Cultivo in vitro de HSPC purificadas

  1. Preparar los medios de cultivo utilizando SFEM-II con SCF (240 ng/mL), FLT3 (240 ng/mL), TPO (80 ng/mL), IL6 (40 ng/mL) y 1x antibiótico-antimicótico (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Se recomienda encarecidamente los medios de cultivo recién preparados. Sin embargo, el medio puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 24 h después de la preparación.
  2. Resuspender el pellet CD34+ con los medios de cultivo, añadir 3 μL de cóctel RUS/ml de medio (Resveratrol, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; ver Tabla de materiales), y cultivar las células a 37 °C con 5% deCO2.
    NOTA: UM171 (10 nm) se puede utilizar para sustituir UM729 (500 nM) ya que ambos tienen efectos similares en el mantenimiento del vástago HSPC7. Los viales no se pueden congelar y descongelar más de dos veces.
  3. Inicialmente, siembre las células purificadas en una confluencia de 5 x 105 / ml en placas de 6 pocillos tratadas en superficie delta disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales) para eliminar las células adherentes.
  4. Vuelva a sembrar las células en la suspensión en una confluencia de 2 x 105 células/ml en una nueva placa de 6 pocillos después de 6 h de purificación.
  5. Caracterizar el tallo de las HSPC utilizando citometría de flujo antes de la edición génica.
    1. Para el análisis de citometría de flujo, tome 1 x 105 células en 100 μL de 1x PBS y agregue 3 μL (75 ng) de CD34 PE, 4 μL (100 ng) de CD133 FITC y 4 μL (100 ng) de CD90 APC (ver Tabla de materiales).
    2. Incubar el tubo a RT durante 20 minutos en la oscuridad. Lavar las células con 2 mL de 1x PBS 2x y centrifugar a 200 x g durante 5 min a RT. Desechar el sobrenadante con una pipeta, resuspender el pellet celular con 150 μL de 1x PBS, y adquirirlo en citometría de flujo.
      NOTA: Si el porcentaje de células CD34+ es <90%, aumente el número de lavados hasta seis veces en el paso 1.3.7. Sembrar las HSPC purificadas en medios de cultivo y, después de 6 h, recoger sólo las células en la suspensión. La mayoría de las células CD34- se adhieren a la placa de cultivo.

3. Edición genética de HSPCs

  1. Realizar la reconstitución guía del ARN.
    NOTA: El sgRNA sintético con modificaciones de fosforotioato dirigidas al locus CCR5 se obtuvo de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales).
    1. Para la reconstitución, ajuste el mezclador térmico a 37 °C y precaliente el tampón 1x TE (consulte la Tabla de materiales) a 37 °C durante 10 min. Centrifugar el vial de sgRNA sintético modificado químicamente a 11.000 x g durante 1 min a 4 °C.
    2. Al vial de sgRNA que contiene 1,5 nM de sgRNA liofilizado, agregue 15 μL de tampón TE 1x, produciendo una concentración final de 100 pM/μL. Resuspenda suavemente hasta 5x, girando la punta alrededor de las esquinas.
    3. Incubar en el mezclador térmico a 37 °C durante 30-40 s con una agitación mínima. Después de un giro corto, recolectar 15 μL de sgRNA y almacenar como alícuotas de 1 μl (100 pM/μL) a -80 °C para su uso futuro hasta por 1 año.
      NOTA: Evite la congelación y descongelación repetidas. Se recomienda un máximo de un ciclo de congelación-descongelación de ARNg alícitado.
  2. Realice la nucleofección siguiendo los pasos a continuación.
    1. En el día 3 de cultivo, contar las células utilizando la cámara mejorada de recuento de células10 de Neubauer.
    2. Para la preparación de RNP (para nucleofecting 2 x 10 5 células), tomar 1 μL de sgRNA dirigido al gen CCR5 (100 pM) en un tubo de0,5 ml y añadir 2,65 μL de Cas9 (50 pM) girando suavemente alrededor del fondo del vial. Incubar en RT durante 10 min.
      NOTA: secuencia de ARNg: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG.
    3. Para la preparación tampón, añadir 16,4 μL de solución de células primarias P3 y 3,6 μL de suplemento, provisto del kit de nucleofección comercial (ver Tabla de materiales), e incubar a RT durante 10 min. Preparar los medios de cultivo (paso 2.1.) y preincubarlos a 37 °C en la placa de cultivo antes de la nucleofección.
    4. Granular 2 x 10 5 células centrifugando a 200 x g durante5 min a RT y desechar suavemente el sobrenadante con una pipeta sin alterar el pellet. Resuspender el pellet con 20 μL del tampón preparado en la etapa 3.2.3. y resuspenderlo suavemente.
    5. Mezclar suavemente la suspensión celular con el complejo RNP preparado (paso 3.2.2.) sin burbujas de aire. Transfiera la suspensión a la tira de nucleofección comercial (consulte la Tabla de materiales) y seleccione el código de pulso DZ100 para electropolar las células utilizando el nucleofector 4D (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: El volumen final de la suspensión celular, incluidos los componentes tampón y RNP, no debe exceder más de 27 μL/electroporación.
    6. Para el control experimental, granular 2 x 10 5 HSPC sin editar centrifugando a 200 x g durante5 min a RT, y resuspender el pellet con 20 μL del tampón preparado en la etapa 3.2.3. sin complejo RNP.
    7. Añadir 100 μL de medios de cultivo preincubados (paso 3.2.3.) a las células electroporadas y dejar las células inalteradas durante 10 minutos en la tira de nucleofección a RT. Después de 10 minutos de incubación, transfiera el contenido a la placa de cultivo según los requisitos experimentales.
      NOTA: Este protocolo se puede aplicar a la interrupción dirigida mediada por la unión de extremos no homólogos (NHEJ) de cualquier locus genómico utilizando ARNg específico del objetivo. Se puede aplicar el mismo protocolo para introducir grandes deleciones mediante la inclusión de ARNg dual en el paso 3.2.2. 11. Además, después de 10 min de incubación de RNP, el mismo protocolo puede ser utilizado para la edición de genes basada en la reparación dirigida por homología (HDR) cuando se proporciona una plantilla de donante12. El protocolo ha sido validado por la interrupción dirigida de AAVS1, pseudo β-globina, β-globina y el locusCCR5 7,8.

4. Validación de eventos de edición de genes en HSPCs

  1. Realizar la extracción de ADN.
    1. Después de 72 h después de la nucleofección, realizar un recuento de células utilizando azul de tripano en una cámara Neubauer. Recolectar 1 x 105 HSPC editadas genéticamente para la extracción de ADN.
    2. Centrifugar las células a 11.000 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante con una pipeta. Resuspender el pellet con 1 mL de 1x PBS y repetir la centrifugación y desechar el sobrenadante. Añadir al pellet 20 μL de solución de extracto rápido (ver Tabla de materiales) por 1 x 105 células y resuspender el pellet.
    3. Incubar la mezcla en un termociclador a 68 °C durante 30 min. Después de un breve giro, incubar la mezcla en un termociclador a 98 °C durante 10 min. Medir la concentración de ADN en el lisado crudo utilizando un espectrofotómetro13.
  2. Realizar la amplificación del locus editado genéticamente por PCR.
    1. Usando Primer3 (ver Tabla de materiales), diseñe los cebadores específicos del locus que abarcan el sitio de rotura de doble cadena (DSB) con tamaños de amplicón que oscilan entre 400-700 pb (Tabla 2).
      NOTA: Primer3 es una herramienta de código abierto basada en la web para diseñar cebadores de PCR.
    2. Prepare la mezcla de reacción como se indica en la Tabla 3 y haga funcionar el termociclador con las condiciones de ciclo mencionadas en la Tabla 4. Para confirmar la amplificación del locus deseado, mezcle 5 μL de producto de PCR con 6x colorante de carga y cargue sobre la electroforesis en gel de agarosa al 2% realizada con tampón TAE.
      NOTA: Los componentes del búfer TAE se proporcionan en la Tabla 7.
    3. Ejecute durante 30-40 minutos a 100 V y detecte el amplicón utilizando un sistema de imágenes en gel (consulte la Tabla de materiales). De acuerdo con el protocolo del fabricante de purificación por PCR (consulte la Tabla de materiales), limpie el producto de PCR amplificado.
    4. Mida la concentración del producto de PCR purificado utilizando un espectrofotómetro de nanogotas (consulte la Tabla de materiales).
  3. Realice la secuenciación de Sanger y la eliminación del terminador de tinte libre siguiendo los pasos a continuación.
    1. Preparar la mezcla de reacción como se muestra en la Tabla 5. Haga funcionar el termociclador con las condiciones de ciclo como se menciona en la Tabla 6.
    2. Agregue 10 μL de reactivo HighPrep DTR (consulte la Tabla de materiales) y 40 μL de etanol al 85% a 10 μL de muestra de PCR en un tubo de 1.5 ml y mezcle con un pipeteo vigoroso aproximadamente 8x-10x.
    3. Incubar la mezcla a RT durante 5 min y colocar el tubo de 1,5 ml en el soporte de separación magnética durante 5 min. Retire el sobrenadante con una pipeta y agregue 100 μL de etanol al 85%.
    4. Desechar el sobrenadante y repetir el paso 4.3.3. 1x. Saque los tubos de 1,5 ml del soporte del imán e incubarlos a 37 °C durante 10 minutos en un mezclador térmico para secar el etanol.
    5. Resuspender vigorosamente las perlas con 40 μL de agua libre de nucleasas e incubar a RT durante 5 min. Colocar el tubo en el soporte de separación magnética durante 5 min, y realizar la secuenciación de Sanger siguiendo los informes publicados14,15.
  4. Realizar una evaluación de frecuencia indel mediante análisis ICE16.
    1. Utilice Synthego (consulte la Tabla de materiales) para el análisis de ICE.
    2. Cargue archivos ab1 de muestras editadas y no editadas y secuencias de ARNg y haga clic en analizar para obtener la frecuencia de los Indels.

5. Trasplante de HSPC editadas genéticamente

  1. Preacondicionar el ratón gamma scid (NSG) NOD disponible comercialmente17 y NOD. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 ratones (ver Tabla de materiales) para trasplante de médula ósea.
    1. Para el preacondicionamiento de ratones NSG, elija ratones hembra de 6-8 semanas de edad y sepárelos en grupos de control y editados por aleatorización ciega.
    2. Coloque los ratones NSG en las jaulas de tarta e irradie a 3.5 Gy usando un irradiador disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) 6-8 h antes del trasplante de HSPC.
      NOTA: Se recomienda pesar los ratones antes de la irradiación, y los ratones que pesen >20 g serán sometidos a irradiación.
    3. Para el preacondicionamiento de ratones NBSGW machos y hembras de 6-8 semanas de edad, inyecte busulfano (ver Tabla de materiales) a través de inyección intraperitoneal (IP) a una dosis de 12.5 mg/kg de peso corporal 48 h antes del trasplante de HSPC.
      NOTA: El acondicionamiento con busulfano aumenta el injerto de HSPC humanas en la médula ósea del ratón y disminuye la necesidad de infundir grandes dosis de HSPC editadas genéticamente19. El rango ideal de dosis de busulfano para el acondicionamiento es entre 10 mg/kg y 15 mg/kg de peso corporal. El aumento de las dosis de busulfano dará lugar a graves problemas de mortalidad.
  2. Preparar la suspensión celular para el trasplante de médula ósea.
    1. Después de 10 min de incubación de las HSPC editadas genéticamente en la tira de nucleofección (ver paso 3.2.7.), transferir la suspensión celular a 10 ml de 1x PBS. Cuente las células utilizando la cámara de conteo de células mejorada10 de Neubauer.
    2. Para la infusión de un ratón, pellet 6 x 10 5 células en un tubo de 1,5 ml centrifugando a 200 x g durante5 min a RT y desechar suavemente el sobrenadante con una pipeta sin alterar el pellet. Resuspender el pellet celular con 100 μL de 1x PBS.
  3. Infunda las HSPC mediante inyección en la vena de la cola siguiendo los pasos a continuación.
    1. Coloque el ratón NSG o NBSGW preacondicionado en el sistema de retención del ratón (consulte la Tabla de materiales).
    2. Sostenga la cola del mouse y empuje suavemente el tapón para sujetar el mouse. Limpie suavemente la cola del ratón con etanol al 70%. Aspirar 100 μL de la suspensión celular en una jeringa de insulina de 31 G.
      NOTA: Evite estrictamente las burbujas en el producto de infusión golpeando suavemente la jeringa o moviendo suavemente el émbolo.
    3. Dirija la luz de la lámpara infrarroja a la cola durante 30-40 s, cubriendo el área del cuerpo del ratón con pliegues de papel de seda. Inserte suavemente la parte biselada de la aguja en la vena caudal izquierda o derecha en un ángulo de 20°.
    4. Levante la cola con el dedo índice izquierdo para mantenerla en el eje plano con la jeringa. Empuje el émbolo para infundir la suspensión celular en la vena. Aplique una presión suave cerca de la región perforada con papel de seda y saque la aguja.
    5. Después de 30 s de aplicar una presión suave, retire el ratón del sistema de sujeción y transfiéralo a su jaula.

6. Evaluación del potencial de injerto a corto plazo

  1. Después de 4 semanas de trasplante de HSPC humano, evaluar el injerto a corto plazo mediante la recolección de sangre a través del seno venoso orbitario en un tubo heparinizado utilizando una pipeta Pasteur.
    1. Anestesiar al animal con ketamina (90-120 mg/kg) y xilazina (8-12 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal (IP) antes de la recogida de la muestra.
      NOTA: Aplique presión suavemente en las extremidades posteriores del ratón anestesiado para confirmar la pérdida de sensibilidad.
    2. Después de anestesiar, coloque al animal en decúbito ventral y frote suavemente el ratón para abrir el ojo, lo que permite que el globo del ojo sobresalga ligeramente.
    3. Inserte suavemente la pipeta Pasteur en el canto medial del ojo debajo de la membrana nictilante en un ángulo de 30°-45°. Después de colocar la pipeta Pasteur en la posición correcta, aplique una ligera presión en el tubo y comience a girar suavemente el tubo.
      NOTA: La sangre entrará en el tubo por acción capilar tan pronto como se perfore el plexo retroorbital.
  2. Después de recoger 50-80 μL de sangre periférica, retire suavemente la pipeta del canto medial del ojo.
    1. Para detener el sangrado alrededor de la órbita del ojo, cierre los párpados y aplique una presión suave con un trozo de gasa.
  3. Teñir las células con los anticuerpos respectivos (Tabla 8) e incubar las células en la oscuridad durante 25-30 min en RT.
  4. Para la lisis de glóbulos rojos, a la suspensión celular, agregue 3 ml de 1x tampón de lisis de glóbulos rojos (Tabla 7) e incube durante 10 minutos en hielo.
    1. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante con una pipeta. Repita el paso 6.4. hasta que el enrojecimiento del pellet desaparezca.
    2. Agregue 2 ml de 1x PBS y centrifugar a 200 x g durante 5 minutos a RT para eliminar los restos celulares asociados con la lisis de glóbulos rojos.
    3. Añadir 150 μL de 1x PBS al pellet y luego proceder con el inmunofenotipado para citometría de flujo para evaluar el porcentaje de células humanas injertadas7.

7. Evaluación del potencial de injerto a largo plazo

  1. Eutanasia a los ratones.
    1. Sacrificar los ratones trasplantados en la semana 16 para el análisis de injerto introduciendo 100% de asfixia deCO2 20 dentro de la jaula de ratones durante 1-2 min.
    2. Confirme la eutanasia determinando el paro cardíaco y respiratorio y la ausencia de movimientos musculares con un suave pellizco de las extremidades posteriores. Si se cumplen ambas condiciones, retire los ratones de la jaula.
    3. Para evaluar el quimerismo de las células humanas, recoja las células de la médula ósea.
  2. Aísle las células de la médula ósea siguiendo los pasos a continuación.
    1. Después de la eutanasia, haga una incisión vertical 1 cm por encima de la uretra y extienda hasta 1 cm por debajo del diafragma. Corte horizontalmente en las esquinas del área incisa para abrir ampliamente la región abdominal.
    2. Diseccionar el fémur y la tibia y retirar los tejidos blandos unidos al fémur y la tibia con unas tijeras. Frote suavemente con papel de seda y haga un pequeño orificio con un diámetro no superior a 0,2 cm en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml con un bisturí.
    3. Retire los extremos proximales de los huesos con un bisturí y coloque los huesos con el lado cortado mirando hacia el orificio del tubo de microcentrifugación de 0,5 ml. Coloque el tubo de 0,5 ml con los huesos en el tubo de 1,5 ml que contiene 100 μL de 1x PBS estéril.
    4. Cierre la tapa, gire los tubos durante 3 minutos a 1000 x g en condiciones estériles a RT y deseche los tubos de 0,5 ml que contienen huesos con una cavidad medular vacía. Añadir 1 ml de 1x PBS al tubo de reacción de 1,5 ml que contiene médula ósea y resuspender suavemente las células aproximadamente no menos de 10x con una pipeta de 1 ml.
    5. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a un tubo de 15 ml que contenga 9 ml de tampón de lisis RBC. Incubar las células en hielo durante 7 min con una inversión suave de los tubos cada 2 min.
    6. Después de 7 min, centrifugar a 200 x g durante 5 min a RT con una aceleración de 9 m/s² y una desaceleración de 7 m/s². Repita el paso 7.2.5. hasta que se observa una bolita blanca pálida clara.
    7. Resuspender las células con 10 ml de 1x DPBS estéril y filtrar la suspensión de células de médula ósea utilizando un filtro de células de 40 μm en un tubo de 15 ml. Enjuague el colador celular con 2 ml de 1x PBS 2x para evitar la pérdida de células.
    8. Centrifugar durante 5 min a 200 x g, RT, y desechar el sobrenadante con una pipeta. Resuspender las células con 10 ml de IMDM con DNasa-I a una concentración de trabajo de 100 μg/ml.
    9. Tomar 1 x 106 células mononucleares en un tubo FACS para el análisis de injerto por citometría de flujo. Para evaluar la frecuencia de edición génica en células mononucleares de médula ósea injertadas, granular 1 x 106 células mononucleares a 11.000 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante usando una pipeta.

8. Inmunofenotipado

  1. Incubar las células de la médula ósea con 1,5 μL de una proteína Fc humana recombinante purificada (ver Tabla de materiales) durante 15 min a 4 °C antes de teñir con anticuerpos.
    NOTA: La proteína Fc humana utilizada aquí está formulada para bloquear la tinción de anticuerpos no específicos causada por receptores para IgG; Por lo tanto, aumenta la especificidad del etiquetado de anticuerpos 7,21,22. Antes de la tinción de anticuerpos de las células diana, realice la titulación de anticuerpos. Se recomienda encarecidamente incluir controles FMO y controles de isotipo mientras se trabaja en el análisis flowcitométrico multicolor.
  2. Para determinar el porcentaje de injerto de células humanas por citómetro de flujo, tomar 1 x 106 células mononucleares en un tubo FACS y teñir las células como se menciona en la Tabla 8.
  3. Incubar las células en la oscuridad durante 25-30 min a RT. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante con una pipeta.
  4. Adquiera las células mediante un citómetro de flujo, compuerta la población celular (P1) utilizando dispersiones hacia adelante (FSC) y laterales (SSC) de células mononucleares, y ajuste el voltaje de acuerdo con la población celular. Adquirir 50.000 eventos celulares en la población P1.
  5. Para analizar las poblaciones de leucocitos humanos en la médula ósea del ratón, compuerta las células CD45+ humanas y CD45.1 de ratón de la población de células P1 utilizando un software de análisis de datos de citometría de flujo (ver Tabla de materiales).
  6. Calcule el injerto de células humanas utilizando la siguiente fórmula8:
    % de injerto = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
    NOTA: El umbral para el injerto humano se consideró positivo al 0,1% para CD45.
  7. Además, analice el porcentaje de células hCD34 + de células CD45 + humanas para evaluar las células de repoblación a largo plazo. Para evaluar la reconstitución multilinaje de las células humanas injertadas, teñir 100 μL de suspensión celular siguiendo la Tabla 9.
    NOTA: Los anticuerpos deben ser titulados antes de los experimentos.
  8. Usando el software de citometría de flujo, compuerta el hCD45 de la población de células P1 y, a partir de hCD45, cuantifique el porcentaje de hCD19, hCD3 y hCD13 (subconjuntos linfoides y mieloides).

9. Evaluación de la frecuencia de edición génica en células mononucleares de médula ósea injertadas

  1. A la gránula de células mononucleares de médula ósea, añadir 50 μL de solución de extracto rápido (ver Tabla de materiales) para 5 x 105 células y resuspender el pellet.
  2. Incubar la mezcla en un termociclador a 68 °C durante 30 min. Después de un breve giro, incubar la mezcla en un termociclador a 98 °C durante 10 min.
  3. Mida la concentración de ADN en el lisado crudo utilizando un espectrofotómetro. Siga los pasos 4.2.-4.4. validar la frecuencia de edición génica mediante análisis ICE 8,15.

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Resultados

El presente estudio identifica las condiciones ideales de cultivo de HSPC que facilitan la retención de CD34 + CD133 + CD90 + HSC en cultivo ex vivo. Para demostrar el enriquecimiento del cultivo de HSC junto con la generación mejorada de HSC modificadas genéticamente, se proporcionan los procedimientos optimizados para el aislamiento de PBMNC, purificación de células CD34 +, cultivo, edición de genes, trasplante, caracterización de injertos y células modificadas g...

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Discusión

El resultado exitoso de la terapia génica HSPC depende predominantemente de la calidad y cantidad de HSC injertables en el injerto. Sin embargo, las propiedades funcionales de las HSC se ven muy afectadas durante la fase preparatoria de los productos de terapia génica, incluso por el cultivo in vitro y la toxicidad asociada con el procedimiento de manipulación génica. Para superar estas limitaciones, hemos identificado condiciones ideales de cultivo de HSPC que conservan el tallo de las HSC CD34 + CD133 + CD90

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Divulgaciones

Los autores declaran que no existen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores quieren reconocer al personal de la instalación de citometría de flujo y la instalación de animales de CSCR. A. C. está financiado por una beca ICMR-SRF, K. V. K. está financiado por una beca DST-INSPIRE y P. B. está financiado por una beca CSIR-JRF. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India (subvención no. BT / PR26901 / MED / 31/377 / 2017 y BT / PR31616 / MED / 31/408 / 2019)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4D-Nucleofector® X UnidadLONZA BIOSCIENCEAAF-1003X
4D-Nucleofector™ X Kit ( Nucleocuvette&trade de 16 pocillos; Tiras)LONZA BIOSCIENCEV4XP-3032
Antibiótico-Antimicótico (100X)THERMO SCIENTIFIC15240096
Anti-humano CD45 APCBD BIOSCIENCE 555485 
Anti-humano CD13 PEBD BIOSCIENCE
Anti-humano CD19 PerCPBD BIOSCIENCE
Anti-humano CD3 PE-Cy7BD BIOSCIENCE 557749
Anti-humano CD90 APCBD BIOSCIENCE
Anti-humano CD133/1 Miltenyibiotec130-113-673
Anti-humano CD34 PEBD BIOSCIENCE
Anti-ratón CD45.1 PerCP-Cy5BD BIOSCIENCE560580
Blood Irradator-2000  BRIT (Departamento de Biotecnología, India)BI 2000 
Placa de cultivo celular (placas de 6 pocillos con tratamiento superficial delta)NUNC (THERMO SCIENTIFIC)
CrysoStor CS10BioLife solutions#07952
BusulfanCELON LABS (60 mg/10 ml)- 
Guide-it Recombinante Cas9TAKARA BIO632640
Cas9-eGFPSIGMAC120040 
  Tubo de centrífuga-15mlCORNING430790
  Tubo de centrífuga-50mlNUNC (THERMO SCIENTIFIC)
DMSOMPBIO219605590
DNAaseSTEMCELL TECHNOLOGIES6469
Dulbecco′ s Solución salina tamponada con fosfato- 1XHYCLONESH30028.02
EasySep™ Kit de selección positiva CD34 humano IISTEMCELL TECHNOLOGIES17856
Imán EasySepSTEMCELL TECHNOLOGIES18000
Unidad de electroforesisORANGE INDIAHDS0036
FBSTHERMO SCIENTIFIC
Citómetro de flujo – ARIA IIIBD BIOCIENCIA-&NBSP;
FlowJo BDBIOSCIENCE -
Flt3-LPEPROTECH300-19-1000
Sistema de imagen en gelCELL BIOSCIENCES11630453
HighPrep Reactivo DTRMAGBIOGENOMICSDT-70005
Humano BD Fc BloqueBD BIOSCIENCE553141
IL6PEPROTECH200-06-50
IMDM mediosTHERMO SCIENTIFIC12440053
Lámpara infrarrojaMURPHY-Jeringade
insulina 6mm 31GBD BIOSCIENCE
KetaminaKETMIN 50-Colorantede
carga 6XTAKARA BIO9156
LymphoprepSTEMCELL TECHNOLOGIES7851
Ratón RestrainerAVANTORTV-150
Espectrofotómetro de nanogotasTHERMO SCIENTIFICND-2000C
Cámara de recuento de células NeubauerROHEM INSTRUMENTSCC-3073
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)El Laboratorio JacksonRRID:IMSR_JAX:005557
NOD,B6. SCID Il2rγ −/− KitW41/W41 (NBSGW)El laboratorio JacksonRRID:IMSR_JAX:026622
Placa de 6 pocillos Nunc deltaTHERMO SCIENTIFIC 140675
Tubo de poliestireno de fondo redondoCélula primaria BD352008
P3 Solución de nucleofecciónLONZA BIOSCIENCEPBP3-02250
Pipeta PasteurFISHER SCIENTIFIC13-678-20A
Kit de limpieza PCRTAKARA BIO740609.25
Jaula para tartasde ratón FISCHER SCIENTIFIC50-195-5140
tubo de poliestireno de fondo redondo (12 x 75 mm)STEMCELL TECHNOLOGIES38007
Primer3Whitehead Institute for Biomedical Researchhttps://primer3.ut.ee/
QuickExtract™ Solución de extracción de ADNLucigenQE09050
ReserveratrolSTEMCELL TECHNOLOGIES72862
SCFPEPROTECH300-07-1000
SFEM-II STEMCELLTECHNOLOGIES9655
sgRNASYNTHEGO- 
SPINWINTARSON1020
StemReginin 1STEMCELL TECHNOLOGIES72342
Herramienta de análisis ICESYNTHEGOa href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/
Tris-EDTA solución tampón (TE) 1XSYNTHEGOSuministrado con gRNA 
TermocicladorAPPLIED BIOSYSTEMS4375305
TPOPEPROTECH300-18-1000
Azul tripánHIMEDIA LABSTCL046
UM171TECNOLOGÍAS DE CÉLULASMADRE 72914
UM729TECNOLOGÍAS DE CÉLULAS MADRE72332
XilacinaXILAXINA - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED-
555394 340421 561971 348057 140675 339652 10270106 324903 <

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