Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

Vigneshwaran Venkatesan; Abisha Crystal Christopher; Karthik V. Karuppusamy; Prathibha Babu; Manoj Kumar K. Alagiri; Saravanabhavan Thangavel

doi:10.3791/64064

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Artículo de método

Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

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DOI:

10.3791/64064

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9 de agosto de 2022

Vigneshwaran Venkatesan^*¹^,² , Abisha Crystal Christopher^*¹^,³ , Karthik V. Karuppusamy¹^,² , Prathibha Babu¹^,² , Manoj Kumar K. Alagiri¹^,² , Saravanabhavan Thangavel¹

¹Centre for Stem Cell Research (CSCR), A unit of InStem Bengaluru, Christian Medical College campus, ²Manipal Academy of Higher Education, ³Thiruvalluvar University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe un procedimiento optimizado de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para el injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Resumen

CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición de genes altamente versátil y eficiente adoptada ampliamente para corregir diversas mutaciones genéticas. La viabilidad de la manipulación génica de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) in vitro hace que las HSPC sean una célula diana ideal para la terapia génica. Sin embargo, las HSPC pierden moderadamente su potencial de injerto y repoblación multilinaje en el cultivo ex vivo . En el presente estudio, se describen las condiciones ideales de cultivo que mejoran el injerto de HSPC y generan un mayor número de células modificadas genéticamente in vivo. El informe actual muestra condiciones de cultivo in vitro optimizadas, incluido el tipo de medio de cultivo, la suplementación única de cóctel de moléculas pequeñas, la concentración de citoquinas, las placas de cultivo celular y la densidad de cultivo. Además de eso, se proporciona un procedimiento optimizado de edición de genes HSPC, junto con la validación de los eventos de edición de genes. Para la validación in vivo , se muestran los análisis de infusión y post-injerto de HSPC editados genéticamente en receptores de ratón. Los resultados demostraron que el sistema de cultivo aumentó la frecuencia de HSC funcionales in vitro, lo que resultó en un injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Introducción

La inaccesibilidad a donantes compatibles con antígenos leucocitarios humanos (HLA) en entornos de trasplante alogénico y el rápido desarrollo de herramientas de ingeniería genética altamente versátiles y seguras hacen del trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas (TCMH) una estrategia de tratamiento curativo para los trastornos sanguíneos hereditarios ^1,2. La terapia génica autóloga con células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPC) implica la recolección de HSPC de los pacientes, la manipulación genética, la corrección de mutaciones causantes de enfermedades y el trasplante de HSPC corregidas....