Las células T e ILC2 que expresan IL-9 se inducen durante la infección por N. brasiliensis , sin embargo, su caracterización se ha pasado por alto en gran medida en el intestino infectado debido a su baja frecuencia y cinética diferencial. Este protocolo describe el aislamiento de estas células de diferentes órganos diana y la confirmación de su identidad mediante citometría de flujo en diferentes etapas de infección.
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Artículo de método
Una estrategia para el estudio de células linfoides productoras de IL-9 en el modelo de infección por Nippostrongylus brasiliensis
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Resumen
Resumen
IL-9 es una citocina pleiotrópica asociada con diversos procesos, incluida la inmunidad antitumoral, la inducción de patologías alérgicas y la respuesta inmune contra las infecciones por helmintos, donde desempeña un papel importante en la expulsión del parásito. En un modelo murino de infección por Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 es producida principalmente por linfocitos T CD4 + y células linfoides innatas que se encuentran en el pulmón, el intestino delgado y los ganglios linfáticos drenantes. Dadas las dificultades técnicas involucradas en la tinción intracelular de IL-9, así como la complejidad de aislar células hematopoyéticas del intestino delgado tras la infección, existe una necesidad apremiante de un protocolo completo pero directo para analizar la expresión de IL-9 en diferentes tejidos linfoides y no linfoides en este modelo. El protocolo descrito aquí describe la cinética de IL-9 producida por las células T CD4 + y las células linfoides innatas en el pulmón y el intestino delgado, los principales órganos dirigidos por N. brasiliensis, así como en los ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos, a lo largo de la infección. Además, detalla el número de larvas necesarias para la infección, dependiendo del tipo de célula y órgano de interés. Este protocolo tiene como objetivo ayudar en la estandarización de ensayos para ahorrar tiempo y recursos al ofrecer la oportunidad de centrarse en las células, órganos y etapas específicas de la enfermedad de interés en el modelo de infección por N. brasiliensis.
Introducción
Los anquilostomas son parásitos intestinales que infectan a aproximadamente 700 millones de personas en todo el mundo, principalmente en áreas tropicales de países subdesarrollados. Las infecciones de alta intensidad con Ancylostoma duodenale y Necator americanus, los parásitos anquilostomas más comunes en humanos, causan anemia y deficiencia de proteínas que pueden resultar en retraso en el crecimiento y el desarrollo mental1. N. americanus y el parásito roedor Nippostrongylus brasiliensis inducen una respuesta inmune prototípica tipo 2 en su huésped y comparten similitudes en su ciclo de vida. Por lo tanto,....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Interno de Manejo Animal (CICUAL) del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México.
NOTA: En la figura 1 se muestra un diagrama de flujo de todo el protocolo.
1. Alojamiento de ratones
- Utilizar grupos de ratones hembra o macho de 8-10 semanas de edad, alojados en instalaciones para animales con temperatura y humedad constantes en ciclos de luz/oscuridad de 12 h, con acceso ad libitum a agua y alimentos.
NOTA: Este protocolo utiliza ....
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Resultados
Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 200 larvas de N. brasiliensis en estadio L3, o con PBS para controles simulados. El número de larvas utilizadas en este protocolo se ajustó para aislar células viables de los pulmones, el tejido linfoide y el intestino delgado, a diferencia de informes anteriores donde se utilizaron cargas más altas de gusanos para detectar células en tejidos linfoides y pulmones solo4. Los pulmones, los ganglios linfáticos mediastínicos, los ganglios l.......
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Discusión
Una comprensión completa de las interacciones parásito-huésped intestinal y las respuestas inmunes a la infección por helmintos requiere la identificación y el análisis de las diferentes poblaciones celulares y moléculas efectoras que son clave para la inducción de la remodelación tisular y la expulsión de gusanos. Las helmintiasis transmitidas por el suelo representan un gran problema en los países en desarrollo de todo el mundo. Sin embargo, hasta hace poco, no se disponía de un protocolo que permitiera el análisis de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a José Luis Ramos-Balderas por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por la siguiente subvención a PLL del CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P y EO-M recibieron una beca del CONACYT (736162 y 481437, respectivamente). MCM-M recibió una beca del CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tampón ACK | Citómetro Attune | ||
| Thermofisher | |||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 Biolegend | 100404 | ||
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Colagenasa D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Actividad específica: ≥ 10 000 unidades/mg |
| Clasificador Facs ARIA II | BD Biosciences Clasificador de | ||
| células FACS Melody | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| Fcε RI | eBioscience | 13589885 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Cittometría de flujo software de datos de análisis | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | |||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1& nbsp; | Biolegend | 108704 | |
| Malla de nylon | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Gradiente de densidad Medio Sigma | D1556 | ||
| Solución salina tamponada con fosfato | casero | ||
| Gibco 11875093 | |||
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Estreptavidina Biolegend | 405206 | ||
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γ δ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tampón Tricine | Tinte de viabilidad casero | ||
| Zombie Aqua Fixable Biolegend | 423101 |
Referencias
- Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
- Mearns, H., et al.
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Reimpresiones y permisos
