El protocolo presenta un modelo de inmunoterapia contra el cáncer utilizando la vacunación tumoral basada en células con melanoma B16-F10 que expresa Flt3L. Este protocolo demuestra los procedimientos, incluida la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación del tumor, la irradiación celular, la medición del crecimiento tumoral, el aislamiento de las células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo.
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Artículo de método
Modelo experimental de inmunoterapia de melanoma utilizando vacunación tumoral con una citocina hematopoyética
En este artículo
Resumen
Resumen
El ligando tirosina quinasa 3 similar a Fms (Flt3L) es una citocina hematopoyética que promueve la supervivencia y diferenciación de las células dendríticas (DC). Se ha utilizado en vacunas tumorales para activar la inmunidad innata y mejorar las respuestas antitumorales. Este protocolo demuestra un modelo terapéutico que utiliza una vacuna tumoral basada en células que consiste en células de melanoma B16-F10 que expresan Flt3L junto con análisis fenotípico y funcional de células inmunes en el microambiente tumoral (TME). Se describen los procedimientos para la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación de tumores, la irradiación celular, la medición del tamaño del tumor, el aislamiento de células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un modelo preclínico de inmunoterapia de tumores sólidos y una plataforma de investigación para estudiar la relación entre las células tumorales y las células inmunes infiltrantes. El protocolo de inmunoterapia descrito aquí se puede combinar con otras modalidades terapéuticas, como el bloqueo del punto de control inmunitario (anticuerpos anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) o la quimioterapia para mejorar el efecto terapéutico del melanoma en el cáncer.
Introducción
La inmunoterapia contra el cáncer ha sido reconocida como una estrategia terapéutica prometedora basada en sus efectos secundarios menos tóxicos y respuestas más duraderas. Se han desarrollado varios tipos de inmunoterapias, incluidas las terapias contra virus oncolíticos, vacunas contra el cáncer, terapias con citoquinas, anticuerpos monoclonales, transferencia adoptiva de células (células CAR-T o CAR-NK) y bloqueo del punto de control inmunitario1.
Para las vacunas contra el cáncer, existen diferentes formas de vacunas terapéuticas, como las vacunas basadas en células completas, las vacunas de proteínas o péptidos ....
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Protocolo
Todos los ratones utilizados en el estudio se mantuvieron y alojaron en el vivero del Instituto de Inmunología de La Jolla (LJI) en condiciones específicas libres de patógenos con temperatura y humedad controladas. Los experimentos con animales se realizaron con ratones hembra C57BL / 6 de 8-14 semanas de edad de acuerdo con las pautas y protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de LJI.
1. Preparación de células tumorales cultivadas para la implantación
- Cultivo de células de melanoma B16-F10 en el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) que contiene 10% de FBS inactivado por calor, 2 mM de gl....
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Resultados
Un punto negro visible de las células B16-F10 implantadas generalmente se observa en la superficie de la piel ~ 3 días después de la implantación del tumor. Los ratones son tratados con la vacuna tumoral 3, 6 y 9 días después de que el nódulo tumoral haya alcanzado un tamaño de ≥2 mm. Observamos una reducción significativa en el crecimiento tumoral en el grupo de ratones vacunados ~ 2 semanas después de la implantación del tumor (Figura 1). Al final del experimento, aislamos las células inmu.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí se basa en el estudio del grupo de Allison. Demostraron que la combinación de la vacuna B16-Flt3L con el bloqueo de CTLA-4 mostró un efecto sinérgico sobre la tasa de supervivencia y el crecimiento tumoral, mientras que no se observó una reducción del crecimiento tumoral en ratones que recibieron la vacuna B16-Flt3L o el tratamiento con anticuerpos anti-CTLA-4 solos7. Estudios recientes han revelado una nueva vía de señalización CTLA4-PKCη intrínseca a Treg que desempeña.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Stephen Schoenberger por proporcionar células B16-Flt3L y al personal de las instalaciones de citometría de flujo y animal LJI por un excelente apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% inactivado por calor FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lote# 209018 |
| Aguja 30G | BD Biosciences | 305106 | |
| placa inferior en forma de V de 96 pocillos | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 línea celular que expresa el ligando 3 de tirosina quinasa similar a Fms (B16-Flt3L) | Regalo del Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Los ADNc de Flt3L se clonaron en el vector retroviral pMG-Lyt2, como en la referencia 5, Figura suplementaria 1 | |
| Líneas celulares B16-F10 | Centrífuga ATCC | CRL-6475 | |
| 5810R | Tampón de fijación Eppendorf | ||
| Cytofix | BD Biosciences | BDB554655 | Tampón de fijación celular (4,2% PFA) |
| Kit Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Kit de solución de fijación/permeabilización |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Pinza digital electrónica | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | datos del citómetro | Tree Star | |
| GolgiStop (inhibidor del transporte de proteínas) | BD Biosciences | 554724 | dilución 1:1500 |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomicina | Sigma | I0634 | |
| Iscove' s Dulbecco modificado' s medio (IMDM) | Citómetros Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II | BD Biosciences | Citómetro | |
| MEM aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140-050 | |
| penicilina y estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | gradiente de densidad medio específico |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Tampón de lisado de glóbulos rojos Hybri-Max líquido Sigma | R7757-100ML | ||
| RPMI 1640 medio | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 Irradiador de rayos X | Rad Source Technologies | ||
| piruvato | de sodioGibco | 11360-070 | |
| Filtro de células estériles 40 μ m | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Filtro de células estériles 70 μ m | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua kit de viabilidad reparable | BioLegend | 423101 | |
| Anticuerpos | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clon: 30-F11 Fluoróforo: BV570 Dilución: 1:200 |
| Anti-mCD3 y épsilon; | 100327 | BioLegend | : 145-2C11 fluoróforo: PerCP-Cy5.5 Dilución: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 | Clon: 53-6.7 Fluoróforo: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilución: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | clon: GK1.5 Fluoróforo: APC-Cy7 Dilución: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 Clon: FJK-16s Fluoróforo: FITC Dilución: 1:100 | |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clon: QA16A02 Fluoróforo: PE Dilución: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clon: XMG1.2 Fluoróforo: PE-Cy7 Dilución: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clon: 6D5 Fluoróforo: BV785 Dilución: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clon: RB6-8C5 Fluoróforo: APC/Cy7 Dilución: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clon: M1/70 Fluoróforo: Pacific blue Dilución: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clon: BM8 Fluoróforo: PECy7 Dilución: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clon: N418 Fluoróforo: PerCP Cy5.5 Dilución: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | clon: M5/114.15.2 Fluoróforo: AF700 Dilución: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clon: 2E7 Fluoróforo: Alexa Fluor 647 Dilución: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clon: GL-1 Fluoróforo: PE Dilución: 1:200 |
| Bloqueador FC (Rata anti-ratón CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 Clon: 2.4G2 Dilución: 1:200 |
Referencias
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M.
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Reimpresiones y permisos
