La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas

Resumen

La técnica peel-blot es un método de preparación de rejilla crio-EM que permite la separación de muestras biológicas concentradas y de múltiples capas en capas individuales para reducir el espesor, aumentar la concentración de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes.

Resumen

La técnica de preparación de rejilla crio-EM peel-blot es un método de retroinyección significativamente modificado con el objetivo de lograr una reducción en las capas de muestras de múltiples capas. Esta eliminación de capas antes de la congelación por inmersión puede ayudar a reducir el grosor de la muestra a un nivel adecuado para la recopilación de datos crio-EM, mejorar la planitud de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes. La técnica peel-blot permite la separación de membranas multilamelares en capas individuales, de cristales 2D en capas en cristales individuales, y de estructuras apiladas, en forma de lámina, de proteínas solubles que también se separan en capas individuales. El alto espesor de muestra de este tipo de muestras con frecuencia plantea problemas insuperables para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes crio-EM, especialmente cuando la etapa del microscopio debe inclinarse para la recopilación de datos. Además, se pueden preparar rejillas de altas concentraciones de cualquiera de estas muestras para una recopilación de datos eficiente, ya que la concentración de la muestra antes de la preparación de la rejilla se puede aumentar y ajustar la técnica de peel-blot para dar como resultado una distribución densa de muestras de una sola capa.

Introducción

La técnica peel-blot se desarrolló con el fin de separar cristales bidimensionales apilados de proteínas de membrana en capas individuales para obtener muestras adecuadamente delgadas para la recolección de datos crio-EM 2D y 3D y facilitar el procesamiento de imágenes¹. El protocolo es igualmente adecuado para otros tipos de muestras multilaminares, así como para lograr altas concentraciones de muestra de cualquier tipo de muestra en la rejilla sin aumentar el grosor en Z.

La reducción de las capas de muestra a una capa se logra aplicando una combinación de presión capilar y fuerzas de cizallamiento en un protocolo ....

Protocolo

1. Pasos de preparación para la técnica peel-blot

NOTA: La preparación requiere que los siguientes elementos se coloquen uno al lado del otro.

1. Apile dos piezas de papel de filtro de tamaño de poro de 20-25 μm (consulte la Tabla de materiales).
2. Coloque una película de parafina de ~8 cm x 10 cm de largo adyacente al papel de filtro con el papel hacia arriba.
3. Coloque un trozo de papel de filtro submicrónico encima de dos trozos adicionales de papel de filtro #4 (Figura 1-1).
4. Coloque las pinzas anticapilares con la pierna dob....

Resultados

Un experimento exitoso de peel-blot dará como resultado capas individuales de muestras a concentraciones a menudo altas. Es de esperar que algunas regiones en la mayoría de los cuadrados de cuadrícula todavía contengan múltiples capas, especialmente en un menor número de iteraciones de los pasos de peel-blot. La mayoría de los cuadrados de cuadrícula, sin embargo, contendrán extensas regiones de capas individuales como se observa para cristales 2D de leucotrieno humano C₄ sintasa (Figura 2) y liposomas (agrega.......

Discusión

El peel-blot es un método poderoso para superar el apilamiento y el grosor de cristales 2D de múltiples capas y muestras similares para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes. La decisión sobre el uso del peel-blot se basará en los parámetros biológicos de la muestra y también requerirá una evaluación una vez que esté disponible un modelo 3D crio-EM. La importancia biológica de los contactos y la flexibilidad potencial de las regiones de contacto serán particularmente importantes en esta evaluaci.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rejillas de malla 600	SPI	2060-C-XA
Pinzas anticapilares	Ted Pella	510-5
Carbono para recubrir mica
Cryo-EM			Las rejillas crio-EM pueden tamizarse a 120 kV o 200 kV. Los datos de alta resolución se recogen a 300 kV.
Pinza Dumpont #5	Ted Pella	5622
Caja de rejilla para almacenamiento crio-EM	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Nitrógeno
Mica	Ted Pella	56	La mica está recubierta de carbono y cortada en cuadrados que son ligeramente más grandes que una rejilla TEM. El espesor del carbono puede requerir una optimización para evitar el carbono delgado que se rompe fácilmente con múltiples manchas de cáscara.
tinción			al 1-2% es adecuado para muchas muestras. Se pueden sustituir otras tinciones como el ácido fosfotúngstico.
Parafilm
			Un contenedor de poliestireno puede reciclarse para este propósito y forrarse con papel de aluminio.
Papel de filtro submicrónico	MilliporeSigma	DAWP04700
Microscopio electrónico de transmisión	JEOL	JEM-1400	Cualquier TEM operado a un voltaje de aceleración de 80-120 kV será adecuado para el cribado de rejillas teñidas negativamente.
Trehalosa			Prepare una solución de trehalosa al 4%.
Papel de filtro Whatman #4	MilliporeSigma	WHA1004150	Esto corresponde a los 20-25 μ Papel de filtro de tamaño de poro m en el protocolo.

líquidoEl acetato de uranilo con negativa Contenedor de poliestireno Se utiliza para vitrificar la rejilla de pelado-mancha.