La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas

Resumen

La técnica peel-blot es un método de preparación de rejilla crio-EM que permite la separación de muestras biológicas concentradas y de múltiples capas en capas individuales para reducir el espesor, aumentar la concentración de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes.

Resumen

La técnica de preparación de rejilla crio-EM peel-blot es un método de retroinyección significativamente modificado con el objetivo de lograr una reducción en las capas de muestras de múltiples capas. Esta eliminación de capas antes de la congelación por inmersión puede ayudar a reducir el grosor de la muestra a un nivel adecuado para la recopilación de datos crio-EM, mejorar la planitud de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes. La técnica peel-blot permite la separación de membranas multilamelares en capas individuales, de cristales 2D en capas en cristales individuales, y de estructuras apiladas, en forma de lámina, de proteínas solubles que también se separan en capas individuales. El alto espesor de muestra de este tipo de muestras con frecuencia plantea problemas insuperables para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes crio-EM, especialmente cuando la etapa del microscopio debe inclinarse para la recopilación de datos. Además, se pueden preparar rejillas de altas concentraciones de cualquiera de estas muestras para una recopilación de datos eficiente, ya que la concentración de la muestra antes de la preparación de la rejilla se puede aumentar y ajustar la técnica de peel-blot para dar como resultado una distribución densa de muestras de una sola capa.

Introducción

La técnica peel-blot se desarrolló con el fin de separar cristales bidimensionales apilados de proteínas de membrana en capas individuales para obtener muestras adecuadamente delgadas para la recolección de datos crio-EM 2D y 3D y facilitar el procesamiento de imágenes¹. El protocolo es igualmente adecuado para otros tipos de muestras multilaminares, así como para lograr altas concentraciones de muestra de cualquier tipo de muestra en la rejilla sin aumentar el grosor en Z.

La reducción de las capas de muestra a una capa se logra aplicando una combinación de presión capilar y fuerzas de cizallamiento en un protocolo que amplía sustancialmente y modifica el método de inyección posterior². Un primer paso de secado da como resultado un sándwich apretado y adherencia a la película de carbono y una barra de rejilla a cada lado de la muestra de varias capas durante la secado en submicrónico en lugar del tamaño de poro del papel de filtro de 20-25 μm en el método de inyección posterior. La separación, o pelado, de una capa individual ocurre al forzar la separación de las capas intercaladas una vez que la rejilla se presiona verticalmente sobre una gota de trehalosa, forzando la película de carbono lejos de la barra de rejilla (Figura 1). El reposicionamiento de la película de carbono lejos del punto de contacto original con la barra de rejilla se produce en el siguiente paso, cuando la rejilla se borra una vez más en papel de filtro submicrónico. El número de iteraciones de estos pasos se puede optimizar para muestras específicas. Además, el protocolo se puede utilizar para aumentar las concentraciones de la muestra evitando la agregación en Z. Debido a la dependencia de la adherencia a la barra de rejilla y la película de carbono, así como a la separación forzada, este enfoque puede no ser adecuado para moléculas altamente frágiles como ciertas proteínas delicadas y / o inestables y complejos de proteínas.

La técnica peel-blot no requiere equipo especializado ni suministros costosos. Sin embargo, la aplicabilidad a muestras específicas requerirá consideraciones cuidadosas de los parámetros biológicos. La decisión es más fácil para los cristales 2D, ya que se requiere una película de carbono para garantizar la planitud, pero la manipulación a través de la técnica peel-blot puede afectar la integridad biológica de la muestra o el orden cristalino. La idoneidad de la técnica peel-blot para partículas individuales está restringida y puede probarse para aquellas que requieren película de carbono y son estables a la manipulación. Los especímenes con interacciones biológicas críticas entre capas pueden no ser adecuados para la caracterización con la ayuda de la técnica peel-blot debido a la interrupción de tales interacciones.

La técnica peel-blot ("peel-blot") se optimiza más rápidamente mediante pruebas y cribado con tinción negativa o muestras no teñidas por TEM a temperatura ambiente. Una vez que se ha identificado el número óptimo de iteraciones de peel-blot, se puede determinar el tiempo para controlar el grosor antes de la vitrificación.

Protocolo

1. Pasos de preparación para la técnica peel-blot

NOTA: La preparación requiere que los siguientes elementos se coloquen uno al lado del otro.

1. Apile dos piezas de papel de filtro de tamaño de poro de 20-25 μm (consulte la Tabla de materiales).
2. Coloque una película de parafina de ~8 cm x 10 cm de largo adyacente al papel de filtro con el papel hacia arriba.
3. Coloque un trozo de papel de filtro submicrónico encima de dos trozos adicionales de papel de filtro #4 (Figura 1-1).
4. Coloque las pinzas anticapilares con la pierna doblada hacia arriba y la pierna recta hacia abajo. Luego, seleccione una cuadrícula de malla 600 con el lado liso / brillante hacia arriba. Coloque las pinzas sobre una placa de Petri u otra superficie elevada para evitar el contacto de la rejilla limpia con otros elementos.
5. Retire el papel de la película de parafina y tire de los lados (~ 5 mm) para crear un borde pequeño. Pipetear dos gotas de 150 μL de solución de trehalosa al 4% ~1-2 cm de un lado corto de la película de parafina y ~1 cm de distancia en la película de parafina.
6. En un banco separado o en el piso, vierta nitrógeno líquido en un recipiente pequeño de espuma de poliestireno (consulte la Tabla de materiales).
   PRECAUCIÓN: Reciba capacitación para el manejo adecuado con guantes y un protector facial para evitar la picadura de escarcha.
7. Coloque un pequeño recipiente de rejilla crio-EM en el nitrógeno líquido y cubra el recipiente de espuma de poliestireno con toallitas sin pelusa.

2. Colocación de la película de carbono en la rejilla

1. Use pinzas Dumont #5 (consulte la Tabla de materiales) para hacer flotar la película de carbono de la mica tocando un lado de la mica en un ligero ángulo hacia abajo (~ 20 ° -40 °) en una de las gotas de solución de trehalosa y lentamente deje que la tensión del agua se levante de la película de carbono moviendo la mica hacia abajo. Libere la mica una vez que la película de carbono flote en la superficie de la gota.
2. Inspeccione visualmente la película de carbono para evitar el uso de carbono con daños en forma de fracturas.
3. Inserte la rejilla sujeta por las pinzas anticapilares en un ángulo (~ 20 ° -30 °) en una gota de trehalosa en una posición adyacente y luego centrada debajo de la película de carbono. Recoja la película de carbono (Figura 1-2).
4. Mantenga la rejilla en la misma orientación y bájela lentamente sobre la superficie de la segunda gota de trehalosa sin romper la tensión superficial de la gota para eliminar la película de carbono innecesaria que puede haberse envuelto alrededor del borde de la rejilla hacia el lado áspero.

3. Separación de cristales 2D multicapa en capas individuales

1. Gire las pinzas anticapilares (consulte la Tabla de materiales) y colóquelas en una placa de Petri con el lado de carbono de la rejilla hacia abajo (Figura 1-3).
2. Pipetear 1,3 μL de la muestra en el menisco de trehalosa leve en la parte superior de la rejilla. Pipetear la solución ~8-10 veces para mezclar y distribuir la trehalosa y la muestra en ambos lados de la rejilla.
3. Mientras incuba la solución durante 1 minuto, pipete una o más gotas de 1,7 μL de solución de trehalosa sobre la película de parafina.
4. Gire la rejilla a su posición original con la película de carbono hacia arriba.
5. Utilice las pinzas anticapilares para presionar la rejilla sobre el papel de filtro submicrónico (Figura 1-4). Una vez que la solución haya sido absorbida por el papel de filtro y la película de carbono esté plana, espere 3s antes de levantar la rejilla y moverla verticalmente sobre la gota de 1,7 μL de solución de trehalosa (Figura 1-5).
   NOTA: Repita este paso varias veces para muestras muy apiladas, o la cuadrícula se prepara para la vitrificación en los pasos siguientes.
6. Seque la rejilla en las dos piezas de papel de filtro y luego levante la rejilla del papel de filtro (Figura 1-6). Después de aproximadamente 13 s, dependiendo de la humedad y el tampón de muestra, sumerja la rejilla en el nitrógeno líquido en el recipiente pequeño de espuma de poliestireno y coloque la rejilla en el contenedor de rejilla crio-EM o transfiérala directamente para la detección crio-EM o la recopilación de datos.
   NOTA: Para optimizar rápidamente el protocolo, manche negativamente la rejilla borrada en este paso en lugar de sumergirla en nitrógeno líquido. Tiñe negativamente la muestra aplicando 3 μL de acetato de uranilo al 1% a la rejilla, incubar la rejilla durante 30 s y secarla con un trozo rasgado de papel de filtro de 20-25 μm de tamaño de poro. Las rejillas de cristales 2D vitrificados en trehalosa, tanino o glucosa se sumergen rutinariamente a mano para la vitrificación, ya que la trehalosa, el tanino y la glucosa evitan la formación de hielo cristalino a las tasas utilizadas para la inmersión manual².

Resultados

Un experimento exitoso de peel-blot dará como resultado capas individuales de muestras a concentraciones a menudo altas. Es de esperar que algunas regiones en la mayoría de los cuadrados de cuadrícula todavía contengan múltiples capas, especialmente en un menor número de iteraciones de los pasos de peel-blot. La mayoría de los cuadrados de cuadrícula, sin embargo, contendrán extensas regiones de capas individuales como se observa para cristales 2D de leucotrieno humano C₄ sintasa (Figura 2) y liposomas (agrega...

Discusión

El peel-blot es un método poderoso para superar el apilamiento y el grosor de cristales 2D de múltiples capas y muestras similares para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes. La decisión sobre el uso del peel-blot se basará en los parámetros biológicos de la muestra y también requerirá una evaluación una vez que esté disponible un modelo 3D crio-EM. La importancia biológica de los contactos y la flexibilidad potencial de las regiones de contacto serán particularmente importantes en esta evaluaci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rejillas de malla 600	SPI	2060-C-XA
Pinzas anticapilares	Ted Pella	510-5
Carbono para recubrir mica
Cryo-EM			Las rejillas crio-EM pueden tamizarse a 120 kV o 200 kV. Los datos de alta resolución se recogen a 300 kV.
Pinza Dumpont #5	Ted Pella	5622
Caja de rejilla para almacenamiento crio-EM	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Nitrógeno
Mica	Ted Pella	56	La mica está recubierta de carbono y cortada en cuadrados que son ligeramente más grandes que una rejilla TEM. El espesor del carbono puede requerir una optimización para evitar el carbono delgado que se rompe fácilmente con múltiples manchas de cáscara.
tinción			al 1-2% es adecuado para muchas muestras. Se pueden sustituir otras tinciones como el ácido fosfotúngstico.
Parafilm
			Un contenedor de poliestireno puede reciclarse para este propósito y forrarse con papel de aluminio.
Papel de filtro submicrónico	MilliporeSigma	DAWP04700
Microscopio electrónico de transmisión	JEOL	JEM-1400	Cualquier TEM operado a un voltaje de aceleración de 80-120 kV será adecuado para el cribado de rejillas teñidas negativamente.
Trehalosa			Prepare una solución de trehalosa al 4%.
Papel de filtro Whatman #4	MilliporeSigma	WHA1004150	Esto corresponde a los 20-25 μ Papel de filtro de tamaño de poro m en el protocolo.