El protocolo describe cómo generar mioblastos knock-out utilizando CRISPR/Cas9, desde el diseño de arneses guía hasta la clonación celular y caracterización de los clones knock-out.
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Artículo de método
Desarrollo de líneas celulares musculares knock-out utilizando la edición de genes CRISPR/Cas9 mediada por lentivirus
En este artículo
Resumen
Resumen
Una aplicación importante de las repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas reguladoras agrupadas (CRISPR)/Cas 9 es el desarrollo de líneas celulares knock-out, específicamente para estudiar la función de nuevos genes/proteínas asociados con una enfermedad, identificados durante el diagnóstico genético. Para el desarrollo de tales líneas celulares, dos cuestiones principales deben desenredarse: la inserción de las herramientas CRISPR (el Cas9 y el ARN guía) con alta eficiencia en las células elegidas, y la restricción de la actividad cas9 a la deleción específica del gen elegido. El protocolo aquí descrito está dedicado a la inserción de las herramientas CRISPR en células difíciles de transfectar, como las células musculares. Este protocolo se basa en el uso de lentivirus, producidos con plásmidos disponibles públicamente, para los cuales se describen todos los pasos de clonación para dirigirse a un gen de interés. El control de la actividad de Cas9 se ha realizado mediante una adaptación de un sistema previamente descrito llamado KamiCas9, en el que la transducción de las células con un lentivirus que codifica un ARN guía dirigido al Cas9 permite la abolición progresiva de la expresión de Cas9. Este protocolo se ha aplicado al desarrollo de una línea celular muscular humana RYR1-knock out, que se ha caracterizado aún más a nivel proteico y funcional, para confirmar el knockout de este importante canal de calcio implicado en la liberación de calcio intracelular muscular y en el acoplamiento excitación-contracción. El procedimiento descrito aquí se puede aplicar fácilmente a otros genes en las células musculares o en otras células difíciles de transfectar y producir herramientas valiosas para estudiar estos genes en las células humanas.
Introducción
Con el progreso de la secuenciación de genes y la identificación de mutaciones en genes de funciones desconocidas en un tejido específico, el desarrollo de modelos celulares relevantes para comprender la función de un nuevo gen objetivo y confirmar su participación en los mecanismos fisiopatológicos relacionados constituye una herramienta esencial. Además, estos modelos son de gran importancia para futuros desarrollos terapéuticos 1,2, y constituyen una alternativa interesante al desarrollo de modelos animales knock-out en línea recta con las recomendaciones internacionales para la reducción del uso de animale....
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Protocolo
Las biopsias musculares se obtuvieron del Banco de Tejidos para la Investigación (Myobank, socio de la red de la UE EuroBioBank, París, Francia) de acuerdo con las recomendaciones europeas y la legislación francesa. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las personas. Los mioblastos inmortalizados fueron producidos amablemente por el Dr. V. Mouly (Instituto de Miología, París, Francia), y los protocolos fueron aprobados por el comité de ética del Instituto de Miología (MESRI, n AC-2019-3502).
1. Diseño de la guía CRISPR
- Identifique la región del gen que se va a eliminar. Busque su secuencia gen....
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Resultados
Este protocolo se aplicó a mioblastos inmortalizados de un sujeto sano15 (las llamadas células HM, para mioblastos humanos), en el que previamente se ha caracterizado el RyR116, con el fin de eliminar el gen RYR1 que codifica la proteína RyR1. El diseño de las guías de ARN se realizó para eliminar la secuencia que abarca parte del exón 101 y el intrón 101 del gen. Se prevé que la eliminación de parte del exón 101 provoque la interrupción del marco de lectura. Ademá.......
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Discusión
Un paso importante en el camino hacia la caracterización de genes de función desconocida implicados en patologías es el desarrollo de modelos celulares relevantes para estudiar la función de estos genes. El uso de la edición de genes utilizando CRISPR / Cas9 es un campo de investigación en crecimiento exponencial, y el desarrollo de modelos knock-out como se presenta aquí se encuentra entre sus aplicaciones más utilizadas. En este contexto, proponemos aquí un protocolo versátil para desarrollar un knock-out de línea celu.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) y de Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo anti-CACNA1S | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Anticuerpo primario |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Enzima de restricción |
| CalPhos Kit de transfección de mamíferos | Takara | 631312 | Kit de transfección |
| Anticuerpo secundario Easy blot anti IgG de ratón | GeneTex | GTX221667-01 | HRP Anticuerpo secundario |
| IgG de conejo | GeneTex | GTX221666 | HRP anticuerpo secundario |
| Fluo-4 directo | Sondas moleculares | F10472 | Imágenes de calcio |
| GAPDH(14C10) Conejo mAb | Tecnología de señalización celular | #2118 | Anticuerpo primario |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Enzima de restricción |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Kit de ligadura |
| MasterMix Phusion de alta fidelidad con GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix para reacción de PCR con polimerasa Taq de alta fidelidad y anticuerpo de cadena pesada miosina dNTPs |
| DHSB | MF20 | Anticuerpo primario | |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Kit de Maxipreparación para la purificación de plásmidos |
| NucleoSpin Gel y PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | Purificación de ADN |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | Kit de 740952 para la extracción de ADN de la célula | |
| One Shot Stbl3 Químicamente competente E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Células químicamente competentes |
| Plásmido #87904 | Addgene | 87904 | Plásmido lentiviral que codifica el SpCas9 (para LV-Cas9) |
| Plásmido #87919 | Addgene | 87919 | Columna vertebral lentiviral para la inserción de casete con guías (para LV-guide-target) |
| Plásmido #12260 | Addgene | 12260 | Plásmido lentiviral que codifica empaquetamiento lentiviral GAG POL |
| Plásmido #8454 | Addgene | 8454 | Proteína de envoltura que codifica plásmido lentiviral para producir partículas retrovirales lentivirales y MuLV |
| V5 Tag Monoclonal | Antibody Invitrogene | R96025 | Anticuerpo primario |
| XL10-Gold Células ultracompetentes | Agilent | 200317 | Células químicamente competentes |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Enzima de restricción |
Referencias
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G.
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Reimpresiones y permisos
