Artículo de método

Observación de fluorescencia profunda en brotes de arroz mediante tecnología de limpieza

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DOI:

10.3791/64116

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27 de junio de 2022

 ,  ,  , 
1Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University, 2Bioscience and Biotechnology Center, Nagoya University, 3Institute for Advanced Research (IAR), Nagoya University, 4Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe una técnica de limpieza para los brotes de arroz, que son difíciles de preparar para las observaciones estructurales internas debido a la naturaleza dura, gruesa o en capas de los tejidos. Este método facilita las observaciones de fluorescencia continua y profunda, incluso en plantas de arroz adultas.

Resumen

La tecnología de limpieza recientemente desarrollada que elimina los desajustes del índice de refracción y disminuye el material autofluorescente ha permitido observar los tejidos vegetales en tres dimensiones (3D) preservando sus estructuras internas. En el arroz (Oryza sativa L.), una planta modelo monocotiledónea y un cultivo de importancia mundial, se ha informado de tecnología de limpieza en órganos que son relativamente fáciles de observar, como las raíces y las hojas. También se han reportado aplicaciones de la tecnología de limpieza en el meristemo apical de brotes (SAM) y los tallos, pero solo en un grado limitado debido a la mala penetración de la solución de limpieza (CS) en estos tejidos. La eficiencia limitada de las soluciones de limpieza en estos tejidos se ha atribuido a la autofluorescencia, engrosamiento y endurecimiento de los tejidos en el tallo a medida que se desarrollan los haces vasculares y la epidermis y la estratificación de la SAM con hojas repelentes al agua. El presente protocolo informa la optimización de un enfoque de aclaramiento para la observación continua y 3D de la expresión génica desde la panícula SAM / joven hasta la base de los brotes durante el desarrollo. Las muestras de tejido fijo que expresaban un reportero de proteínas fluorescentes se recortaron en secciones utilizando una microcortadora vibratoria. Cuando se logró un espesor apropiado, se aplicó el CS. Al dirigirse específicamente al tejido central, la tasa de penetración y la uniformidad del SC aumentaron, y el tiempo requerido para hacer que el tejido sea transparente disminuyó. Además, la limpieza de las secciones recortadas permitió la observación de la estructura interna de todo el rodaje desde una perspectiva macro. Este método tiene aplicaciones potenciales en imágenes profundas de tejidos de otras especies de plantas que son difíciles de limpiar.

Introducción

La tecnología de limpieza recientemente desarrollada ha permitido observar los tejidos profundos de las plantas preservando su estructura interna 1,2,3. En la planta modelo dicotiledónea Arabidopsis, se han realizado muchos estudios sobre imágenes de proteínas fluorescentes utilizando tecnología de limpieza para eliminar los desajustes del índice de refracción y eliminar los materiales autofluorescentes 4,5,6. Aunque se ha informado del uso de la tecnología de limpieza7,8 y las imágenes 3D a resolución celular9 en arroz (Oryza sativa L.), una planta modelo monocotiledónea y un cultivo de importancia mundial, estos se limitan a órganos relativamente delgados y blandos, como raíces, hojas y meristemo apical de brotes (SAM), que son fáciles de observar.

El brote es el órgano principal que constituye las partes aéreas de las plantas vasculares. En el arroz, los brotes se componen de una serie de "fitómeros" apilados verticalmente, que comprenden brotes axilares, hojas y el tallo10. En la punta del brote, el SAM está compuesto de células madre indiferenciadas en el centro. Los fitómeros se forman por la diferenciación de células derivadas del SAM. Después de que las plantas pasan de la fase vegetativa a la reproductiva, los tallos del arroz se alargan y el SAM se diferencia en panículas jóvenes10. Este cambio en el desarrollo se acompaña de fluctuaciones en la expresión de varios genes en los tallos y SAM / panículas jóvenes. Para comprender los mecanismos subyacentes a la diferenciación celular en varios tejidos, es importante observar estructuralmente la morfología celular y la expresión génica en los tejidos internos de los brotes. Sin embargo, la imagen profunda de los tallos (nodos y entrenudos) en el brote presenta un desafío debido a la ineficiencia de las soluciones de limpieza para penetrar en el tejido. Los tallos experimentan inmediatamente un rápido aumento de volumen a partir del crecimiento lateral después de la diferenciación del SAM. El endurecimiento de los tejidos del nodo del arroz debido al engrosamiento de los haces vasculares y el enlace complejo horizontal de la anastomosis vascular ganglionar, además de la alta repelencia de los brotes de arroz, contribuyen a limitar la penetración del SC en los tallos10.

Este estudio tuvo como objetivo observar los cambios en la expresión génica en los tejidos de los brotes de arroz utilizando una técnica de fluorescencia profunda estructural. Este trabajo optimiza un protocolo de limpieza para que el arroz observe continuamente la expresión génica desde la panícula SAM / joven hasta la base en una estructura 3D, en lugar de en una superficie plana, utilizando un microscopio láser confocal.

Protocolo

1. Preparación de la solución fijadora

  1. Transfiera 70 ml de agua estéril a una botella de vidrio y agregue 10 g de paraformaldehído (PFA).
    PRECAUCIÓN: PFA es tóxico; Por lo tanto, se recomienda usar guantes.
  2. Añadir 2 ml de NaOH 1 N para disolver la solución de PFA.
  3. Disuelva la solución de PFA con agitación continua (300-500 rpm) a 60 °C durante aproximadamente 1 h hasta que la solución de PFA sea transparente.
  4. Agregue agua esterilizada para aumentar el volumen de la solución de PFA a 100 ml.
    NOTA: La solución de PFA se preparó recién antes de su uso. Además, una solución de PFA almacenada a 4 °C se puede utilizar durante aproximadamente 2 meses.
  5. Inmediatamente antes de la toma de muestras, añadir 25 ml de HEPES de 60 mM (pH 7,4), 3 ml de sacarosa 1 M y 2 ml de agua estéril en 20 ml de PFA al 10 % para preparar una solución fijadora de 50 ml.

2. Preparación de la solución de compensación (CS)

  1. Pese y mezcle 7.5 g de desoxicolato de sodio, 5 g de xilitol y 12.5 g de urea (consulte la Tabla de materiales) en 50 ml de agua estéril.
    NOTA: El polvo de desoxicolato de sodio se pesó en una cámara de tiro de laboratorio general para evitar la dispersión en el aire.
  2. Disuelva los ingredientes (paso 2.1.) con un agitador magnético para preparar el CS.
    NOTA: El presente estudio utilizó una solución de compensación preparada internamente (CS), pero también se puede usar una solución de compensación disponible comercialmente, ClearSee (ver Tabla de materiales).
  3. Transfiera el CS a un tubo cónico de 50 ml y guárdelo a temperatura ambiente (15-30 °C) en la oscuridad.
    NOTA: El CS se puede almacenar durante más de 1 año.

3. Muestreo

  1. Corta las raíces con cuidado sin dañar las plantas. Lave las plantas con agua para eliminar la suciedad.
    NOTA: Este método estudió la observación de tejidos desde la etapa de tres hojas (LS) hasta el LS indicador. El presente estudio utilizó los cultivares de arroz Nipponbare (Nip) y Taichung 65 (T65) en el 8-10 LS.
  2. Despegue las viejas hojas exteriores con las manos y las pinzas. Quedaban alrededor de 2-3 hojas.
  3. Corte el tejido desde la panícula SAM/joven hasta la base con una navaja de un solo filo con un movimiento deslizante para evitar aplastar las células (Figura 1A-C). Si la posición de la panícula SAM/joven no es visible, córtela por más tiempo.
  4. Dado que la sección transversal del brote de arroz tiene una forma ovalada (Figura 1D), afeite un lado del óvalo finamente en la dirección de su eje largo con una navaja de afeitar de doble filo (Figura 1E-F).
    NOTA: Este paso facilitó que la solución fijadora penetrara en la muestra. Una superficie de corte horizontal hace que la muestra sea más fácil de pegar a una bandeja de microcortadora vibratoria (consulte la Tabla de materiales).
  5. Confirmar la posición de la panícula SAM/joven por la aparición de un color blanquecino en la muestra (Figura 1G). Recorte el exceso de tejido.
    NOTA: La longitud de la muestra debe ajustarse a la longitud máxima que se puede recortar con una microcortadora vibratoria. Si la muestra es demasiado larga, divídala en varias piezas.

4. Fijación de las muestras

  1. Pipetear 1 ml de la solución fijadora (preparada en el paso 1.) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e introducir inmediatamente las muestras.
    NOTA: Asegúrese de que la cantidad de muestra no exceda el 20% del volumen de la solución fijadora.
  2. Cortar un trozo de película de parafina en 2,5 cm2. Moldee la película de parafina en bolas y colóquelas encima de las muestras para evitar que floten fuera de la solución fijadora.
  3. Coloque el tubo que contiene la muestra en un desecador. Luego, cierre la tapa del desecador y encienda la bomba de vacío para despresurizar el interior del desecador hasta -0.095 MPa lentamente.
  4. Después de cerrar el desecador a -0,095 MPa, apague la bomba de vacío y déjela reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: El nivel de vacío fue tal que las burbujas aparecieron gradualmente en las muestras.
  5. Abra ligeramente el desecador y lentamente vuelva a la presión atmosférica. Reduzca la presión del desecador a -0.095 MPa, apague la bomba de vacío y deje reposar la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente.
  6. Abra ligeramente el desecador y lentamente vuelva a la presión atmosférica. Si la muestra se fija correctamente, se hunde en la solución fijadora. Si no se hundió, reduzca la presión nuevamente.
  7. Retire la película de parafina, cierre la tapa y mantenga los tubos durante la noche a 4 °C.
    NOTA: Las muestras se fijaron en solución fijadora durante al menos 2 h. Se puede almacenar durante ~ 1 semana.

5. Recorte de la muestra fija

  1. Retire el exceso de solución fijadora de la muestra con toallitas sin pelusa.
    NOTA: El exceso de solución fijadora impide que la muestra se pegue correctamente en la bandeja.
  2. Fije la muestra en una bandeja vibratoria de microcortadoras con pegamento instantáneo. Colóquelo en una bandeja con el lado plano hacia abajo, que se afeitó durante el muestreo.
    NOTA: Debido a la estructura del brote de arroz, debe recortarse desde la base hacia la panícula SAM / joven.
  3. Ajuste las condiciones de recorte de acuerdo con la muestra fija.
    NOTA: En este estudio, el recorte se estableció en GRUESO, 130 μm; ANCHO, 15 mm; FRECUENCIA, 15%; y VELOCIDAD DE CORTE, 32 mm.
  4. Ajuste la posición de la muestra con el botón RVS o FWD y el botón ARRIBA o ABAJO . Llene la bandeja con agua desionizada hasta que todas las muestras estén sumergidas. Después de llenar la bandeja, pulse el botón START . Coloque las muestras recortadas en un portaobjetos de vidrio con una gota de 1x PBS.
    NOTA: Cambie la posición de la muestra hacia el otro lado después de cada recorte, ya que la muestra dura desgasta la hoja de afeitar.
  5. Después de verificar la muestra que contiene el sitio objetivo bajo un microscopio estereoscópico, transfiera la muestra recortada a una placa multipocillo con 1 ml de 1x PBS.
    NOTA: Elija el número de pozos según el tamaño de la muestra. En este estudio, se utilizó una placa de 12 pocillos.

6. Tratamiento con la solución de aclaramiento

  1. Retire el 1x PBS de la placa multipocillo y agregue 1x PBS fresco. Dejar reposar durante 1 min.
  2. Elimine 1x PBS y agregue el CS.
    NOTA: La cantidad de CS debe ser cinco veces el volumen de muestra.
  3. Coloque la placa multipocillo que contiene la muestra en un desecador. Luego, cierre la tapa del desecador y encienda la bomba de vacío para despresurizar el interior del desecador hasta -0.09 MPa lentamente.
  4. Después de cerrar el desecador a -0,09 MPa, apague la bomba de vacío y déjela reposar durante 1 h a temperatura ambiente.
  5. Abra ligeramente el desecador y lentamente vuelva a la presión atmosférica.
  6. Vierta agua desionizada en el espacio entre los pocillos para evitar la evaporación del CS. Almacene las placas de pocillos múltiples a temperatura ambiente en la oscuridad para limpiarlas.
    NOTA: Agite suavemente la placa multipocillo cada 1-2 días para difundir la clorofila y otros componentes.
  7. Cuando el CS se vuelva verde, reemplácelo con una solución nueva.

7. Tinción de la pared celular con colorante químico

  1. Pipetear la solución de blanco de calcofluor (1 ml, concentración final: 1 mg/ml en la solución de aclaración, ver Tabla de materiales) en una placa de pocillos múltiples. Colocar las muestras en la solución de colorante e incubar durante 1 h.
    NOTA: El volumen del tinte no debe exceder el 10% del volumen del CS.
  2. Lave las muestras teñidas en otra placa multipocillo con 1 ml de CS durante al menos 1 h.

8. Observación con un microscopio láser confocal

  1. Coloque una gota de CS en un portaobjetos de microscopio y transfiera las muestras tratadas (con CS) al portaobjetos.
    NOTA: Como las muestras tratadas son blandas, deben manipularse cuidadosamente con pinzas.
  2. Cubra la muestra con un cubreobjetos de vidrio para evitar la evaporación del CS.
    NOTA: El CS se precipita fácilmente.
  3. Observe las muestras tratadas bajo un microscopio láser confocal.
    NOTA: Después de la observación, las muestras tratadas pueden ser devueltas al CS para observaciones posteriores posteriores.

Resultados

En primer lugar, se validó la medida en que los tejidos duros y gruesos de las plantas de arroz adultas podían hacerse transparentes mediante el tratamiento de limpieza. Nip en el 9-10 LS, que es la etapa de formación de la panícula, y se utilizaron tejidos de 12-16 mm de largo cortados desde la panícula joven hasta la base del brote. Estas muestras, incluida la panículo joven, se fijaron en la solución fijadora y se observaron antes y después de 1-4 semanas del tratamiento de limpieza (Figura 2). Las muestras sin recortar permanecieron verdes y no se volvieron transparentes después de 4 semanas o incluso después de 3 meses de tratamiento con la solución de limpieza (Figura 2A). En las muestras que se despegaron de todas las hojas, los entrenudos se volvieron blancos después de 1 semana de tratamiento con el SC, aunque los ganglios permanecieron verdes. Esta muestra no se volvió transparente después de 4 semanas (Figura 2B). Después de 3 meses del tratamiento con el SC, solo la panícula joven se volvió transparente. Las muestras recortadas a mano cambiaron a blanco, excepto las hojas externas y los haces vasculares, después de 1 semana de tratamiento con el SC. Algunas partes de las hojas, la panícula joven y los entrenudos se volvieron translúcidas, pero no se volvieron transparentes después de 4 semanas (Figura 2C). Después de 3 meses, solo la panícula joven y las hojas internas se volvieron transparentes. Las muestras que se recortaron a 130 μm de espesor con el microcortador vibratorio se volvieron translúcidas después de 1 semana de tratamiento con el CS, y las hojas se volvieron transparentes. Después de 2 semanas, la muestra fue casi transparente y permaneció sin cambios después de 4 semanas (Figura 2D). Después de 3 meses, las muestras se volvieron completamente transparentes.

A continuación, se validó la profundidad por la cual el tratamiento de limpieza permitió observaciones de expresión génica en el brote de T65 en el 8 LS. Se utilizaron brotes expresados UBQpro:: NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro ::NGCN, ver Tabla de materiales). Las muestras de tejido se fijaron en la solución fijadora antes de recortarlas a 130 μm de espesor utilizando una microcortadora vibratoria. Las muestras se observaron bajo un microscopio láser confocal (láser: 488 nm / 13%, objetivo: 20x, agujero de alfiler: 0.93 UA, promedio: 16, ganancia del detector: 800) a intervalos de 10 μm en la dirección del eje z cada semana de 0 a 4 semanas de tratamiento con el CS. Los resultados representativos se muestran en la Figura 3. Todas las cifras se ajustaron con el mismo procesamiento para comparar la intensidad de fluorescencia. En el nodo sin tratamiento, se observaron señales fluorescentes débiles a una profundidad de -40 μm (Figura 3A). La profundidad observable fue de -60 μm después de 1 semana del tratamiento con SC y -90 μm después de 2 semanas, pero la autofluorescencia del citoplasma fue notable en ambas semanas a una profundidad de -20 μm. La autofluorescencia se volvió algo más débil después de 3 semanas y ya no era visible después de 4 semanas. Se observaron señales fluorescentes a una profundidad de -80 μm a las 3 semanas y a una profundidad de -100 μm a las 4 semanas. En el entrenudo, se observaron señales fluorescentes a una profundidad de −60 μm sin el tratamiento de SC (Figura 3B). La profundidad observable fue de -90 μm después de 1 semana a 3 semanas del tratamiento con SC y -100 μm después de 4 semanas, pero la autofluorescencia en el citoplasma fue notable a una profundidad de -20 μm después de 1 semana. La autofluorescencia ya no era visible después de 2 semanas. En las hojas, se observaron señales fluorescentes a una profundidad de −90 μm sin el tratamiento de SC (Figura 3C). Las señales fluorescentes se observaron más profundamente en las hojas que en los nodos y entrenudos. Sin embargo, las señales fluorescentes eran más débiles. Las señales fluorescentes se hicieron claras después de 1 semana de tratamiento con SC y se observaron a una profundidad de -120 μm. Después de 2 semanas y 3 semanas, se observaron señales fluorescentes a una profundidad de -110 μm y, después de 4 semanas, a una profundidad de -120 μm.

Finalmente, se observó la expresión del factor de transcripción OsMADS15 11 fusionado con mOrange12, que regula la transición de SAM de la fase vegetativa a la reproductiva13. Las muestras de tejido de Nip en el 10 LS con OsMADS15-mOrange se fijaron, se recortaron a 130 μm de espesor y se trataron con el CS durante 2 semanas. La Figura 4 muestra que la solución de aclaramiento podría usarse simultáneamente para observar las proteínas fluorescentes (OsMADS15-mOrange) de la expresión génica natural y la tinción de colorantes fluorescentes (blanco de calcofluor). Se observó toda la floreta a profundidades de 0 a −130 μm, y la imagen 3D se reconstruyó a partir de 43 imágenes de pila z a intervalos de 3 μm (Figura 4E).

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Figura 1: Posición de muestreo y procesamiento. (A) Cortar plántulas en el 8 LS en la condición de día corto. (B) Vista ampliada de la base. (C) Un recorte de muestra desde la panícula SAM/joven hasta la base. (D) Una sección transversal ovalada de C (recuadro). (E) Afeitando finamente un lado del brote con una cuchilla. (F) Superficie finamente afeitada. (G) Muestra que muestra el alargamiento de entrenudos. La sección blanquecina indicada por las puntas de flecha son los nodos. La parte superior del nodo superior tiene la panícula joven. Barras de escala: (A) 10 cm, (B-C, E-G) 1 cm, (D) 0,5 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: La limpieza del tejido depende del grosor de la muestra y del período de tratamiento con SC . (A) Muestras sin recortar con brotes parciales que incluyen la panícula joven. Espesor máximo: 4 mm. (B) Todas las hojas se desprendieron de las muestras para exponer la panícula joven. Espesor máximo: 2,5 mm. YP: panícula joven, en: entrenudo; Las puntas de flecha indican nodo. (C) Muestras que fueron recortadas a mano a 1 mm de espesor. (D) Muestras recortadas con la microcortadora vibratoria hasta un espesor de 130 μm. Barra de escala: 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: La profundidad de la observación de fluorescencia depende del tipo de tejido y del período de tratamiento con SC. Imágenes profundas de UBQpro::NGCN en el nodo (A), (B) entrenudo y (C) hoja. "Combinar" significa que las imágenes se fusionaron con la imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC) y todas las imágenes z-stack. Las imágenes en las que no se observó fluorescencia se marcaron como "n.d." (no detectado). Los ajustes de la microscopía láser confocal son los siguientes: láser: 488 nm/13%, objetivo: 20x, estenopeico: 0,93 UA, promedio: 16, ganancia del detector: 800, intervalo: 10 μm. Barras de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Observación de fluorescencia profunda de OsMADS15-mOrange. (A) La imagen DIC de Nip en el 10 LS. yp: panícula joven, le: hoja, no: nodo, en: entrenudo; Las puntas de flecha indican floretes. (B) Imagen de fluorescencia de OsMADS15-mOrange. Los puntos amarillos indican las proteínas fluorescentes de OsMADS15-mOrange en el núcleo. La pared celular se tiñó cian con la solución blanca de calcofluor. (C) Vista ampliada de la panícula joven. (D) Imágenes profundas de la floreta. pa: palea, le: lemma, fm: meristemo floral; Los asteriscos indican estambre primordios. El microscopio láser confocal se configuró de la siguiente manera: OsMADS15-mOrange; láser: 555 nm/13%, objetivo: 20x, estenopeico: 0,96 UA, promedio: 16, ganancia del detector: 800, intervalo: 3 μm. Calcofluor blanco; láser: 405 nm/3%, objetivo: 20x, estenopeico: 0,93 UA, promedio: 16, ganancia del detector: 470, intervalo: 3 μm. (E) La imagen 3D de la figura (D) construida a partir de las imágenes de la pila z. Barras de escala: (A-B) 1 mm, (C) 500 μm, (D) 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Pasos críticos del protocolo
Los pasos críticos en este protocolo son la fijación y el recorte. Los brotes de arroz tienen tejidos duros, gruesos o en capas que limitan la penetración de la solución fijadora. Para mejorar la permeabilidad de la solución fijadora, un lado del tejido se afeitó finamente en el muestreo, como se muestra en la Figura 1E-F. Además, los tratamientos de vacío se repitieron dos veces utilizando una presión más alta. Además, las muestras se fijaron durante la noche a 4 °C en lugar de la fijación habitual de 2 h a 4 °C.

El punto clave en el paso de recorte es determinar el grosor de los tejidos que deben prepararse para observar las proteínas fluorescentes mientras se preserva su estructura interna después de un corto período de tratamiento con CS. Como se muestra en la Figura 2C, las muestras de 1 mm de espesor, recortadas a mano lo más delgadas posible, se volvieron transparentes solo en un número limitado de tejidos, incluso después de 3 meses de tratamiento con CS. Por lo tanto, el paso de recorte es esencial para la observación de fluorescencia profunda de brotes de arroz adultos. En este estudio, las muestras se recortaron a un espesor de 130 μm, como se muestra en la Figura 2D. El grosor de 130 μm permitió limpiar las hojas después de 1 semana de tratamiento con SC y toda la muestra después de 2 semanas. En este estudio se utilizaron brotes de arroz adultos en el LS 9-10. Los tejidos gruesos pero más blandos de los brotes de arroz más jóvenes se pueden eliminar más rápido con el tratamiento con SC. El grosor de las muestras y la duración del tratamiento con CS deben ajustarse de acuerdo con el tipo de tejido, la condición y el grosor de la estructura 3D a observar.

Modificaciones y métodos de solución de problemas
El CS precipitó fácilmente a bajas temperaturas. El SC precipitado no puede preservar las proteínas fluorescentes; Por lo tanto, se debe tener cuidado al almacenar las muestras a la temperatura adecuada. Además, tanto el CS como la solución fijadora no tienen efecto antiséptico; Por lo tanto, las proteínas fluorescentes se degradarán si están contaminadas. El arroz cultivado en el suelo es propenso al crecimiento de hongos; Por lo tanto, el muestreo y la manipulación de las muestras deben realizarse con cuidado para evitar la contaminación.

El exceso de colorantes fluorescentes en el tampón puede emitir fluorescencia de fondo e interferir con las observaciones microscópicas. Por ejemplo, anteriormente se utilizó una solución blanca de calcofluor que contenía colorante azul Evans. Después de la tinción durante 1 h y el lavado durante 1 h, las proteínas fluorescentes de OsMADS15-mOrange se observaron utilizando un láser de 555 nm. Sin embargo, no se pudieron observar proteínas fluorescentes debido a la fluorescencia de fondo derivada del colorante azul de Evans. Esta fluorescencia de fondo casi se eliminó lavando las muestras durante 2 h. Además, las proteínas fluorescentes eran más claras si las muestras se dejaban durante la noche. Por lo tanto, se utilizó una solución blanca de calcofluor puro en este estudio. La fluorescencia de fondo derivada del colorante fluorescente debe verificarse utilizando diferentes longitudes de onda láser antes de las observaciones.

Limitaciones del método
Como se muestra en la Figura 3, se observaron proteínas fluorescentes profundas en las muestras que tenían 130 μm de espesor después de 2 semanas de tratamiento con SC. Esto es consistente con los resultados mostrados en la Figura 2D, donde la muestra de 130 μm de espesor se volvió transparente después de 2 semanas de tratamiento con CS. Sin embargo, como se muestra en la Figura 3A, la autofluorescencia del citoplasma todavía era notable en los ganglios después de 2 semanas y solo se eliminó por completo después de 4 semanas de tratamiento con SC. Los nodos tienen una alta densidad celular y, por lo tanto, requieren más tiempo para eliminar los materiales autofluorescentes.

Como se muestra en la Figura 3C, se observaron proteínas fluorescentes profundas en las hojas sin tratamiento con SC, pero el brillo fue más débil que en los nodos e internodos a la misma profundidad de 20 μm. Después de 1 semana de tratamiento con CS, las proteínas fluorescentes fueron más brillantes. La clorofila es abundante en las hojas y absorbe 488 nm de luz de excitación. También tienen autofluorescencia naranja / roja, que puede interferir con la observación de proteínas fluorescentes utilizando un láser de 555 nm. Después de 1 semana de tratamiento con CS, se eliminaron la clorofila y otros materiales autofluorescentes, lo que resultó en imágenes de alta relación señal-ruido.

Las profundidades que se pudieron observar en los tejidos después de 2 semanas y 4 semanas de tratamiento con SC no fueron significativamente diferentes, aunque las proteínas fluorescentes parecían más débiles después de 4 semanas (Figura 3). Normalmente, el brillo de las proteínas fluorescentes y la autofluorescencia se debilita con el tiempo, lo que resulta en una mayor relación señal-ruido. Por lo tanto, las proteínas fluorescentes se pueden observar más claramente ajustando las condiciones microscópicas y el procesamiento de imágenes. Con base en estos resultados, se concluyó que 2 semanas de tratamiento con SC podrían facilitar la observación de proteínas fluorescentes profundas, dadas nuestras condiciones de muestra. Sin embargo, se necesitan 4 semanas para observar imágenes más claras que excluyan completamente los materiales autofluorescentes.

Las estructuras con autofluorescencia fuerte, como los haces vasculares y las células de múltiples brazos, no se pueden eliminar en el SC. Para observar estas estructuras sin autofluorescencia, es necesario utilizar un método de activación temporal12 u obtener imágenes por espectroscopia del espectro de fluorescencia. Un microscopio de dos fotones puede ser más adecuado para observar tejidos más profundos si se observan tejidos más gruesos.

Importancia del método con respecto a los métodos existentes y alternativos
En general, las estructuras internas de las plantas de arroz se han observado utilizando criostato o sección de vibratomo. Un criostato es adecuado para preparar secciones delgadas, lo que permite una observación más fácil, pero la preparación de las muestras y el funcionamiento del equipo requieren mucho tiempo. Reconstruir la estructura 3D original a partir de secciones delgadas también es difícil. El vibratomo es relativamente fácil de operar y adecuado para producir secciones gruesas. Sin embargo, las secciones gruesas de los tejidos diana solo permiten observar la superficie cortada y no los tejidos profundos que la luz no puede alcanzar. Por estas razones, ninguno de los métodos es adecuado para observaciones de fluorescencia profunda.

Este estudio abordó los desafíos en la observación de fluorescencia profunda en brotes de arroz, como la penetración tisular limitada del CS y la mala resolución de objetos bajo un microscopio confocal, combinando los métodos existentes. Como se muestra en la Figura 4, observamos proteínas fluorescentes (OsMADS15-mOrange) expresadas en los tejidos profundos de brotes de arroz adultos desde la panícula joven hasta la base. La figura 4D se centra en el florete y muestra proteínas fluorescentes profundas a intervalos de 3 μm. Se observaron tejidos de más de -130 μm de profundidad después de 2 semanas de tratamiento con SC, pero solo se observaron los tejidos dentro de -27 μm de profundidad (datos no mostrados) en el florete con el mismo tamaño y etapa de crecimiento sin tratamiento de SC. El protocolo mejorado actual permitió la observación no solo de la sobreexpresión de genes, sino también de la expresión génica natural en los tejidos profundos de los brotes de arroz adultos.

Importancia y aplicaciones potenciales del método en áreas de investigación específicas
Este protocolo, que optimiza la observación de fluorescencia profunda de brotes de arroz adultos, permite la limpieza eficiente de tejidos duros, gruesos o en capas al recortar tejidos innecesarios y aumentar la permeabilidad del CS. Además, el espesor de las muestras para el análisis se optimizó para permitir la observación continua y estructural de fluorescencia profunda utilizando un microscopio láser confocal, que normalmente no puede resolver tejidos gruesos u opacos.

Es difícil comparar muestras de arroz en diferentes etapas de crecimiento porque las proteínas fluorescentes se degradan con el tiempo en las soluciones fijadoras y PBS. Sin embargo, las proteínas fluorescentes en el SC pueden almacenarse durante más de 5 meses1. La larga vida útil del CS es una gran ventaja para la observación de fluorescencia profunda en el arroz.

Recientemente, se han desarrollado muchas tecnologías de limpieza, lo que permite observar tejidos profundos en 3D mientras se preservan sus estructuras internas. Estas tecnologías han seguido evolucionando y se han desarrollado nuevas soluciones de compensación. Un buen ejemplo es iTOMEI14, que permite la eliminación eficiente de clorofila y una detección de fluorescencia más brillante. Otro ejemplo es ClearSeeAlpha15, que evita el oscurecimiento de los tejidos durante el tratamiento de limpieza y los hace parecer transparentes. La combinación de estas soluciones de compensación con el método actual puede permitir una limpieza más eficiente y efectiva.

Se espera que el método actual ayude a obtener nuevos conocimientos a través de imágenes profundas no solo del arroz sino también de otras plantas.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. R. Terada, al Dr. Z. Shimatani y al Dr. H. Tsuji por proporcionarnos las semillas OsMADS15-mOrange; Dr. D. Kurihara por proporcionarnos la construcción de NGCN; y al Dr. R. Shim por editar nuestro manuscrito. Este trabajo fue financiado por JSPS KAKENHI (números de subvención JP20H05912, 20H05778, 20H05779) y por el programa SATREPS (no. JPMJSA1706) del JST y JICA.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLBIO-BIKST-0150F
Placa multipocillo de 12 pocillosCorning353043
tubo cónico de 50 mLCorning352070
Solución blanca de calcofluorSigma-Aldrich910090
ClearSeeFUJIFILM Wako Pure Chemical031-25151Esto se puede hacer o comprar.
Microscopio láser confocalCarl ZeissLSM700
DesecadorSANPLATECHecho a medida en acrílico. 30 cm (L), 30 cm (W), 14,5 cm (H)
Cubreobjetos de vidrio (18 × 18 No.1)MATSUNAMIC018181
HEPESFUJIFILM Wako Pure Chemical342-01375
Portaobjetos de microscopio (76 × 26)MATSUNAMIS2441
Película de parafinaBemisPM-996
ParaformaldehídoFUJIFILM Wako Pure Chemical162-16065
Desoxicolato de sodioIndustria química de TokioC0316
SacarosaFUJIFILM Wako Pure Chemical190-00013
UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN)proporcionado por Dr. Kurihara
UreaFUJIFILM Wako Pure Chemical211-01213
Bomba de vacíoAS OneAS-01
Microcortadora vibratoriaDOSAKADTK-3000
XilitolFUJIFILM Wako Pure Chemical248-00545

Referencias

  1. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
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  3. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107(2016).
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