Caracterización del interactoma de lisosoma neuronal con proteómica de etiquetado de proximidad

Ashley Frankenfield; Jiawei Ni; Ling Hao

doi:10.3791/64132

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Caracterización del interactoma de lisosoma neuronal con proteómica de etiquetado de proximidad

2.6K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/64132

⸱

23 de junio de 2022

Ashley Frankenfield^*¹ , Jiawei Ni^*¹ , Ling Hao¹

¹Department of Chemistry, The George Washington University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un protocolo proteómico de etiquetado de proximidad de lisosomas neuronales para caracterizar el microambiente lisosomal dinámico en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Las proteínas de membrana lisosomal y las proteínas que interactúan con los lisosomas (de forma estable o transitoria) se pueden cuantificar con precisión en este método con una excelente resolución espacial intracelular en neuronas humanas vivas.

Resumen

Los lisosomas frecuentemente se comunican con una variedad de biomoléculas para lograr la degradación y otras funciones celulares diversas. Los lisosomas son críticos para la función cerebral humana, ya que las neuronas son postmitóticas y dependen en gran medida de la vía autofagia-lisosoma para mantener la homeostasis celular. A pesar de los avances en la comprensión de varias funciones lisosomales, capturar las comunicaciones altamente dinámicas entre los lisosomas y otros componentes celulares es técnicamente desafiante, particularmente en una forma de alto rendimiento. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para el método proteómico de marcado de proximidad de lisosomas endógeno (knock-in) recientemente publicado en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC).

Tanto las proteínas de la membrana lisosomal como las proteínas que rodean los lisosomas dentro de un radio de 10-20 nm se pueden identificar con confianza y cuantificar con precisión en neuronas humanas vivas. Cada paso del protocolo se describe en detalle, es decir, cultivo de neuronas hiPSC, etiquetado de proximidad, recolección de neuronas, microscopía de fluorescencia, enriquecimiento de proteínas biotiniladas, digestión de proteínas, análisis de LC-MS y análisis de datos. En resumen, este método único de proteómica de etiquetado de proximidad lisosomal endógeno proporciona una herramienta analítica robusta y de alto rendimiento para estudiar las actividades lisosomales altamente dinámicas en neuronas humanas vivas.

Introducción

Los lisosomas son orgánulos catabólicos que degradan macromoléculas a través de la vía lisosomal-autofagia¹. Además de la degradación, los lisosomas están involucrados en diversas funciones celulares, como la transducción de señalización, la detección de nutrientes y la secreción ^2,3,4. Las perturbaciones en la función lisosomal han sido implicadas en trastornos de almacenamiento lisosomal, cáncer, envejecimiento y neurodegeneración 3,5,6,7.