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Artículo de método

Conceptos básicos de histología y detección de muerte celular en tejido de abeja melífera

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DOI:

10.3791/64141

7 de julio de 2022

En este artículo

Resumen

Los métodos inmunohistoquímicos son útiles en la investigación de abejas melíferas para detectar y evaluar el nivel de apoptosis y necrosis en el intestino medio y las glándulas hipofaríngeas de las abejas adultas.

Resumen

Las abejas melíferas (Apis mellifera L.) dentro de la colmena (obreras nodrizas y otras abejas de la colmena) y fuera de la colmena (recolectoras) están expuestas a cambios climáticos y climáticos, diversos pesticidas, patógenos y desnutrición, que ingresan principalmente por la boca y afectan principalmente el tracto digestivo de las abejas adultas. Para comprender y prevenir los efectos de tales factores estresantes externos e internos en las abejas, un método de investigación útil es el método inmunohistoquímico. Se describe un protocolo básico para preparar el intestino medio (ventrículo) y las glándulas hipofaríngeas (HPG) de las abejas adultas para el análisis histológico. Se describe una metodología detallada para evaluar el nivel de daño celular y distinguir la necrosis de la muerte celular programada (apoptosis) como un proceso natural de regeneración tisular. Se presentan los resultados del tratamiento de abejas adultas con ácido oxálico y pesticidas (insecticida y acaricida) y la determinación de la muerte celular en el ventrículo y HPG. También se discuten los pros y los contras de la metodología.

Introducción

Las abejas melíferas (Apis mellifera L.) son, entre otros polinizadores silvestres, los polinizadores más importantes de las plantas agrícolas. Durante miles de años, el entorno cambiante ha influido en las abejas para adaptar su morfología, fisiología, comportamiento y tolerancia a varios patógenos y parásitos. Por lo tanto, las abejas han desarrollado una gama muy diversa de especies y subespecies en todo el mundo1. Estos resultados son consistentes con hallazgos previos, que existe variación genética en la estructura del tracto digestivo de la abeja, pero también sugieren que las alteraciones del intestino medio se deben a factores ....

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Protocolo

1. Histología básica para la investigación de las abejas melíferas

  1. Disección de tejido de abeja melífera
    NOTA: Para la disección de abejas obreras, use un microscopio de disección con una fuente de luz LED. El aumento más útil es ~20x.
    1. Manipulación y disección
      1. Tome con cuidado una abeja obrera con fórceps y póngala en hielo (o en el congelador a -20 ° C) durante 2 minutos para inmovilizarla22. Fije la abeja en la placa de Petri diagonalmente a través de la parte posterior superior del tórax dos veces, de izquierda a derecha y de derecha a izquierda.
      2. Vierta solución salina de insectos para ....

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Resultados

Detección de muerte celular en el intestino medio
Las abejas obreras recién emergidas (Apis mellifera carnica) del colmenar experimental en el Instituto Agrícola de Eslovenia en Liubliana fueron tratadas individualmente con ácido oxálico (OA) al 3%23. OA se utiliza con frecuencia en la apicultura para el control del destructor Varroa . Después del tratamiento, las abejas obreras (tres de cada grupo) fueron inmovilizadas en hielo. Se diseccionó el intestino med.......

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Discusión

En los organismos vivos, la muerte celular se define como apoptosis o necrosis25 y puede ir acompañada de autofagia26. La diferencia entre las células apoptóticas y necróticas es que la apoptosis es una forma de muerte celular programada y aparece en células normales, mientras que la necrosis ocurre debido a condiciones letales (por ejemplo, accidente, enfermedad)27,28. La apoptosis se puede detectar utilizando kits.......

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Divulgaciones

El autor no tiene conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradezco el apoyo de la Agencia de Investigación de Eslovenia, subvención nº P4-133.

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-Propanol
(detección de apoptosis in situ de peroxidasa ApopTag)Sigma-AldrichS7100Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA
jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE
j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx
H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA
vD_BwE; Controles positivos incluidos en S7101 Cubiertas
DeadEnd, Sistema TUNEL colorimétricoPromegaG7360, Ensayo A,
https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 Microscopio de disección  (para disección de abejas)Zeiss
Agua
Casete
Sistema EnVision kit de fosfatasa alcalinaDako
Eosina Y SoluciónSigma-AldrichEtanol
95% (o menos puro), 90%, 80%
Faramount medio de montaje, acuosoMediode montaje
Mesa de aplanamientoLeicaHI1220
Pinzas  (para disección de abejas)Herramientas de ciencia fina11294-00Estándar #4
Formalina 10%Formaldehído
HematoxilinaSigma-Aldrich
Agente de limpieza HistoChoice Agentede limpiezaSigma-Aldrich
Peroxidasa de hidrógeno 3%
IncubadoraBioRad
Alfileres para insectos  (para disección de abejas)Entosphinx44594Alfileres de insectos de acero inoxidable y blanco, tamaño 2
ISCDDK, AP (Kit de detección de muerte celular in situ, fosfatasa alcalina)Roche11684809910 Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b
ul.pdf
KH2PO4
Lab clock
Microscopioóptico Los
caja con los portaobjetos debe conservarse en una envoltura de plástico para evitar el polvo
MicrotomoLeica
Na2HPO4
NaCl
Paraformaldehído 4%
ParaplastPipetas
Pasteur1,5 mL; 3 mL
(para disección de abejas)Lleno de silicio de condensación   (Xantoprene L azul y Líquido universal más activador)
Proteinasa KMerck21627
Solución de timbre  (para disección de abejas)7,5 g de NaCL, 2,38 g de Na2HPO4, 2,72 g de KH2PO4, 1 L de agua destilada
Tijeras  (para disección de abejas)Herramientas de ciencia fina1406-09, 14061-09Recto y curvo, 9 cm
Activador universal de líquido plus  (para disección de abejas)Relojero Kulzer
' pinzas s (para disección de abejas)Herramientas de ciencia fina91100-12
Baño de aguaPincel de
2x
(para disección de abejas)Kulzer
Kit de peroxidasa ApopTag ,, destiladade inclusión alcohólico Dako portaobjetos de microscopio Leica La Estación modular de inclusión de tejidos Leica Leica de PBS Placa de Petri  acuarela Leica Xantoprene L azul 

Referencias

  1. Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
  2. Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
  3. Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee.

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Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Histolog a de la abeja mel feram todo inmunohistoqu micodetecci n de apoptosisevaluaci n de la necrosisdisecci n del intestino mediogl ndulas hipofar ngeastinci n con hematoxilina y eosinamicroscop a pticatoxicolog a de pesticidas