Los métodos inmunohistoquímicos son útiles en la investigación de abejas melíferas para detectar y evaluar el nivel de apoptosis y necrosis en el intestino medio y las glándulas hipofaríngeas de las abejas adultas.
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Artículo de método
Conceptos básicos de histología y detección de muerte celular en tejido de abeja melífera
En este artículo
Resumen
Resumen
Las abejas melíferas (Apis mellifera L.) dentro de la colmena (obreras nodrizas y otras abejas de la colmena) y fuera de la colmena (recolectoras) están expuestas a cambios climáticos y climáticos, diversos pesticidas, patógenos y desnutrición, que ingresan principalmente por la boca y afectan principalmente el tracto digestivo de las abejas adultas. Para comprender y prevenir los efectos de tales factores estresantes externos e internos en las abejas, un método de investigación útil es el método inmunohistoquímico. Se describe un protocolo básico para preparar el intestino medio (ventrículo) y las glándulas hipofaríngeas (HPG) de las abejas adultas para el análisis histológico. Se describe una metodología detallada para evaluar el nivel de daño celular y distinguir la necrosis de la muerte celular programada (apoptosis) como un proceso natural de regeneración tisular. Se presentan los resultados del tratamiento de abejas adultas con ácido oxálico y pesticidas (insecticida y acaricida) y la determinación de la muerte celular en el ventrículo y HPG. También se discuten los pros y los contras de la metodología.
Introducción
Las abejas melíferas (Apis mellifera L.) son, entre otros polinizadores silvestres, los polinizadores más importantes de las plantas agrícolas. Durante miles de años, el entorno cambiante ha influido en las abejas para adaptar su morfología, fisiología, comportamiento y tolerancia a varios patógenos y parásitos. Por lo tanto, las abejas han desarrollado una gama muy diversa de especies y subespecies en todo el mundo1. Estos resultados son consistentes con hallazgos previos, que existe variación genética en la estructura del tracto digestivo de la abeja, pero también sugieren que las alteraciones del intestino medio se deben a factores ....
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Protocolo
1. Histología básica para la investigación de las abejas melíferas
- Disección de tejido de abeja melífera
NOTA: Para la disección de abejas obreras, use un microscopio de disección con una fuente de luz LED. El aumento más útil es ~20x.- Manipulación y disección
- Tome con cuidado una abeja obrera con fórceps y póngala en hielo (o en el congelador a -20 ° C) durante 2 minutos para inmovilizarla22. Fije la abeja en la placa de Petri diagonalmente a través de la parte posterior superior del tórax dos veces, de izquierda a derecha y de derecha a izquierda.
- Vierta solución salina de insectos para ....
- Manipulación y disección
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Resultados
Detección de muerte celular en el intestino medio
Las abejas obreras recién emergidas (Apis mellifera carnica) del colmenar experimental en el Instituto Agrícola de Eslovenia en Liubliana fueron tratadas individualmente con ácido oxálico (OA) al 3%23. OA se utiliza con frecuencia en la apicultura para el control del destructor Varroa . Después del tratamiento, las abejas obreras (tres de cada grupo) fueron inmovilizadas en hielo. Se diseccionó el intestino med.......
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Discusión
En los organismos vivos, la muerte celular se define como apoptosis o necrosis25 y puede ir acompañada de autofagia26. La diferencia entre las células apoptóticas y necróticas es que la apoptosis es una forma de muerte celular programada y aparece en células normales, mientras que la necrosis ocurre debido a condiciones letales (por ejemplo, accidente, enfermedad)27,28. La apoptosis se puede detectar utilizando kits.......
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Divulgaciones
El autor no tiene conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradezco el apoyo de la Agencia de Investigación de Eslovenia, subvención nº P4-133.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Propanol | |||
| (detección de apoptosis in situ de peroxidasa ApopTag) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Controles positivos incluidos en S7101 Cubiertas |
| DeadEnd, Sistema TUNEL colorimétrico | Promega | G7360 | , Ensayo A, |
| https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 Microscopio de disección (para disección de abejas) | Zeiss | ||
| Agua | |||
| Casete | |||
| Sistema EnVision kit de fosfatasa alcalina | Dako | ||
| Eosina Y Solución | Sigma-Aldrich | Etanol | |
| 95% (o menos puro), 90%, 80% | |||
| Faramount medio de montaje, acuoso | Medio | de montaje | |
| Mesa de aplanamiento | Leica | HI1220 | |
| Pinzas (para disección de abejas) | Herramientas de ciencia fina | 11294-00 | Estándar #4 |
| Formalina 10% | Formaldehído | ||
| Hematoxilina | Sigma-Aldrich | ||
| Agente de limpieza HistoChoice Agente | de limpieza | Sigma-Aldrich | |
| Peroxidasa de hidrógeno 3% | |||
| Incubadora | BioRad | ||
| Alfileres para insectos (para disección de abejas) | Entosphinx | 44594 | Alfileres de insectos de acero inoxidable y blanco, tamaño 2 |
| ISCDDK, AP (Kit de detección de muerte celular in situ, fosfatasa alcalina) | Roche | 11684809910 Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf | |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Microscopio | óptico Los | ||
| caja con los portaobjetos debe conservarse en una envoltura de plástico para evitar el polvo | |||
| Microtomo | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehído 4% | |||
| Paraplast | Pipetas | ||
| Pasteur | 1,5 mL; 3 mL | ||
| (para disección de abejas) | Lleno de silicio de condensación (Xantoprene L azul y Líquido universal más activador) | ||
| Proteinasa K | Merck | 21627 | |
| Solución de timbre (para disección de abejas) | 7,5 g de NaCL, 2,38 g de Na2HPO4, 2,72 g de KH2PO4, 1 L de agua destilada | ||
| Tijeras (para disección de abejas) | Herramientas de ciencia fina | 1406-09, 14061-09 | Recto y curvo, 9 cm |
| Activador universal de líquido plus (para disección de abejas) | Relojero Kulzer | ||
| ' pinzas s (para disección de abejas) | Herramientas de ciencia fina | 91100-12 | |
| Baño de agua | Pincel de | ||
| 2x | |||
| (para disección de abejas) | Kulzer |
Referencias
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee.
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Reimpresiones y permisos
