Microdisección láser industrializada guiada por inteligencia artificial para el análisis proteómico a microescala del microambiente tumoral

Summary

Este protocolo describe un flujo de trabajo de alto rendimiento para la segmentación impulsada por inteligencia artificial de regiones de interés confirmadas por patología a partir de imágenes de sección de tejido delgado teñidas para el enriquecimiento de poblaciones celulares resueltas por histología utilizando microdisección láser. Esta estrategia incluye un algoritmo novedoso que permite la transferencia de demarcaciones que denotan poblaciones celulares de interés directamente a los microscopios láser.

Abstract

El microambiente tumoral (TME) representa un ecosistema complejo compuesto por docenas de tipos de células distintas, incluidas las poblaciones de tumores, estroma y células inmunes. Para caracterizar la variación a nivel de proteoma y la heterogeneidad tumoral a escala, se necesitan métodos de alto rendimiento para aislar selectivamente poblaciones celulares discretas en neoplasias malignas de tumores sólidos. Este protocolo describe un flujo de trabajo de alto rendimiento, habilitado por la inteligencia artificial (IA), que segmenta imágenes de hematoxilina y eosina (H&E) teñidas de secciones de tejido delgado en regiones de interés confirmadas por patología para la recolección selectiva de poblaciones celulares resueltas por histología utilizando microdisección láser (LMD). Esta estrategia incluye un nuevo algoritmo que permite la transferencia de regiones que denotan poblaciones celulares de interés, anotadas utilizando software de imagen digital, directamente a microscopios láser, lo que permite colecciones más fáciles. Se realizó una implementación exitosa de este flujo de trabajo, lo que demuestra la utilidad de este método armonizado para cosechar selectivamente poblaciones de células tumorales del TME para el análisis proteómico cuantitativo multiplexado mediante espectrometría de masas de alta resolución. Esta estrategia se integra completamente con la revisión histopatología de rutina, aprovechando el análisis de imágenes digitales para apoyar el enriquecimiento de las poblaciones celulares de interés y es totalmente generalizable, lo que permite cosechas armonizadas de poblaciones celulares del TME para análisis multiómicos.

Introduction

El TME representa un ecosistema complejo poblado por una gama muy diversa de tipos de células, como células tumorales, células estromales, células inmunes, células endoteliales, otros tipos de células mesenquimales y adipocitos, junto con una matriz extracelular compleja¹. Este ecosistema celular varía dentro y entre los diferentes sitios de órganos de la enfermedad, lo que resulta en una heterogeneidad tumoral compleja ^2,3. Estudios recientes han demostrado que los tumores heterogéneos y los tumores con baja celularidad tumoral (baja pureza) a menudo se correlacionan con un mal pronóstico de la enfermedad ^2,3.

Para comprender la interacción molecular entre las poblaciones de células tumorales y no tumorales dentro de la EMT a escala, se necesitan estrategias estandarizadas y de alto rendimiento para cosechar selectivamente distintas poblaciones celulares de interés para el análisis multiómico posterior. La proteómica cuantitativa representa una técnica en rápida evolución y cada vez más importante para mejorar la comprensión de la biología del cáncer. Hasta la fecha, la preponderancia de los estudios que emplean proteómica lo han hecho con proteínas extraídas de preparaciones de tejido tumoral completo (por ejemplo, criopulverizadas), lo que lleva a una escasez en la comprensión de la heterogeneidad a nivel de proteoma en la TME ^4,5,6.

El desarrollo de estrategias de recolección de muestras que se integren a la perfección y aprovechen la información de los flujos de trabajo de patología clínica permitirá una nueva generación de proteómicas resueltas por histología que son altamente complementarias a los flujos de trabajo de patología diagnóstica estándar de oro. LMD permite la recolección directa y selectiva de subpoblaciones celulares o regiones de interés (ROI) a través de la inspección microscópica de secciones delgadas de tejido teñido histológicamente⁷. Los recientes avances importantes en patología digital y análisis habilitados para IA han demostrado la capacidad de identificar características composicionales y ROI únicas dentro de la EMT de manera automatizada, muchas de las cuales se correlacionan con alteraciones moleculares y características clínicas de la enfermedad, como la resistencia a la terapia y el pronóstico de la enfermedad⁸.

El flujo de trabajo descrito en el protocolo presentado aquí aprovecha las soluciones de software comerciales para anotar selectivamente los ROI tumorales dentro de las imágenes de histopatología digital, y utiliza herramientas de software desarrolladas internamente para transferir estos ROI tumorales a microscopios láser para la recopilación automatizada de poblaciones celulares discretas de interés que se integran a la perfección con los flujos de trabajo de análisis multiómico posteriores. Esta estrategia integrada disminuye significativamente el tiempo del operador de LMD y minimiza la duración durante la cual se requiere que los tejidos estén a temperatura ambiente. La integración de la selección automatizada de características y la cosecha de LMD con la proteómica cuantitativa de alto rendimiento se demuestra a través de un análisis diferencial de la EMT de dos subtipos histológicos representativos de cáncer de ovario epitelial, el cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) y el carcinoma de células claras de ovario (OCCC).

Protocol

Todos los protocolos del estudio fueron aprobados para su uso bajo un protocolo aprobado por Western IRB "An Integrated Molecular Analysis of Endometrial and Ovarian Cancer to Identify and Validate Clinically Informative Biomarkers" considerado exento bajo la regulación federal de ee. UU. 45 CFR 46.102 (f). Todos los protocolos experimentales que involucran datos humanos en este estudio estaban de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio.

PRECAUCIÓN: Los siguientes reactivos utilizados a lo largo del protocolo son carcinógenos conocidos o sospechosos y/o contienen materiales peligrosos: etanol, agua DEPC, solución de hematoxilina de Mayer, solución de Eosina Y, metanol, acetonitrilo y ácido fórmico. El manejo adecuado, como se describe en las respectivas hojas de datos de seguridad (SDS), y el uso de equipos de protección personal (EPP) apropiados son obligatorios.

1. Generación del archivo de datos de lista de formas predeterminado (.sld) que contiene fiduciales del calibrador

NOTA: Los pasos del protocolo descritos en esta sección son específicos para usar con un microscopio láser invertido y el software asociado (consulte la Tabla de materiales). La creación de un archivo .sld predeterminado solo es necesaria una vez por microscopio láser. El archivo resultante se puede utilizar para cortar fiduciales en todas las diapositivas PEN utilizadas a partir de entonces. Tiempo aproximado: 5 min (solo una vez).

1. Abra el software LMD y cargue la corredera de membrana de naftalato de polietileno (PEN) en el escenario LMD boca abajo, con la etiqueta más cercana al usuario. Anule la selección del cuadro Cerrar línea(s) en el lado derecho de la ventana del programa.
2. Utilice la función PtoP (punto a punto) con un aumento alto (63x) para dibujar tres flechas "V" que sirvan como fiduciales de calibración. Comenzando en un punto externo en la V, dibuje una línea hasta el punto medio de la V y haga un solo clic. A continuación, dibuje una segunda línea desde el punto central de la V hasta el final del segundo punto V externo y haga doble clic para crear una forma de V única y sin cerrar a partir de las dos líneas.
   NOTA: Estos fiduciales de calibración deben colocarse en tres esquinas de la corredera: delantera derecha, trasera derecha, trasera izquierda.
3. Seleccione la opción AF (enfoque automático) antes de cortar . Corte la diapositiva en la posición 1, muévala a cada una de las posiciones de diapositiva restantes y trace con precisión sobre los cortes de calibración.
4. Guarde el archivo .sld y seleccione la opción Guardar sin calibración en el cuadro de diálogo emergente para evitar cortar los fiduciales de calibración en la membrana.
   NOTA: En el archivo complementario 1 se proporciona un archivo .sld representativo que contiene fiduciales calibradores estándar para cuatro posiciones de diapositivas.

2. Preparación de diapositivas LMD

NOTA: Los pasos del protocolo descritos en esta sección son específicos para usar con un microscopio láser invertido y el software asociado (consulte la Tabla de materiales). Tiempo aproximado: 5 min.

1. Asegúrese de que la corredera esté completamente seca antes de cortar los fiduciales de calibración de referencia. Abra el software LMD y abra el archivo .sld de calibración predeterminado en la opción Importar formas .
2. Seleccione la opción AF (enfoque automático) antes de cortar . Cargue la(s) diapositiva(s) con el tejido hacia abajo y la diapositiva de la etiqueta más cerca del operador en el soporte de la diapositiva en el escenario LMD.
3. Utilizando el microscopio láser y el archivo .sld de calibración predeterminado, corte los fiduciales de calibración en la membrana PEN.
   1. OPCIONAL: Corte los fiduciales de calibración en la membrana PEN antes o después de que la(s) sección(es) de tejido se coloquen en el portaobjetos. Si los fiduciales de calibración se cortan antes de la colocación del tejido, asegúrese de que el tejido y/o el fijador no se superpongan con los calibradores cuando el tejido se coloque en el portaobjetos en el Paso 2.5. Si los fiduciales de calibración se cortan después de la colocación del tejido, deténgase después de completar el Paso 2.4 y continúe con la sección 3.
4. Revise todos los calibradores individualmente para asegurarse de que cada corte esté completo y sea visible.
   NOTA: Utilice la función Mover y cortar para dirigir manualmente el láser sobre cualquier fiducial de calibración que no haya atravesado completamente la membrana PEN.
5. Coloque la sección de tejido congelado o fijado en formalina, incrustado en parafina (FFPE) en la diapositiva que contiene los fiduciales de calibración.

3. Tinción de tejidos

NOTA: Tiempo aproximado: 30 min.

1. Fije los portaobjetos de tejido LMD congelados en etanol al 70% (EtOH) que contiene reactivos de cóctel inhibidores de la fosfatasa durante 5 min.
2. Lave los portaobjetos en agua de dietil pirocarbomato (DEPC) que contenga reactivos de cóctel inhibidores de la fosfatasa durante 1 min.
3. Lave los portaobjetos en agua DEPC durante 1 min.
4. Incubar los portaobjetos en la solución de hematoxilina de Mayer durante 3 min.
5. Enjuague los toboganes en agua DEPC durante 3 min.
6. Enjuague los toboganes en un intercambio fresco de agua DEPC durante 1 min.
7. Incubar los portaobjetos en solución acuosa de Eosin Y durante 1 s.
8. Enjuague las diapositivas 2 x 5 s en 95% EtOH.
9. Enjuague las diapositivas 3 x 10 s en 100% EtOH.
10. Limpie el exceso de EtOH de la parte posterior de las diapositivas y deje que las diapositivas se sequen al aire.
11. Guarde las diapositivas a -80 °C si la LMD no se va a realizar inmediatamente.

4. Imágenes de diapositivas

Nota : los pasos de protocolo descritos en esta sección son específicos para las diapositivas escaneadas (consulte la Tabla de materiales) y las imágenes resultantes guardadas como archivos .svs. Utilice cualquier escáner y su software asociado que genere archivos de imagen en un formato que el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) pueda abrir. Los tipos de archivo que utilizan tiffs piramidales que son compatibles incluyen JPG, TIF, MRXS, QPTIFF, componente TIFF, SVS, AFI, SCN, LIF, DCM, OME. TIFF, ND2, VSI, NDPI, NDPIS, CZI, BIF, KFB e ISYNTAX. Tiempo aproximado: 5 min.

1. Encienda el escáner y abra el software del escáner de diapositivas. Cargue la diapositiva con el tejido hacia arriba en la etapa de diapositiva única en el escáner. Asegúrese de que el portaobjetos esté completamente seco y coloque suavemente un deslizamiento sobre el tejido. No use etanol o aceite de inmersión debajo de la cubierta.
2. Capture la imagen de la micrografía utilizando ajustes calibrados para ajustar la membrana PEN en lugar del fondo de vidrio e ignorar la tinción de la membrana de fondo, según las instrucciones del fabricante.
3. Ajuste el área de imagen arrastrando y cambiando el tamaño del perímetro verde interior para capturar toda el área de la membrana PEN, según sea necesario. Agregue cuatro puntos de enfoque al tejido haciendo doble clic en la imagen general de la instantánea y tres puntos de enfoque en la membrana cerca de los fiduciales de calibración (un punto de enfoque por cada uno de los tres fiduciales de calibración).
   NOTA: Los cuatro puntos de enfoque se pueden colocar casi en cualquier lugar de la sección de tejido, aunque colocarlos sobre el tejido que está demasiado oscuro y parece negro puede hacer que la exploración falle.
4. En el menú Ver , seleccione Monitor de vídeo. Ajuste manualmente el enfoque utilizando el control deslizante de enfoque fino y/o macro, según sea necesario, para cada punto alrededor del tejido LMD. Capture el escaneo de la imagen con un aumento alto (20x). Confirme que todos los fiduciales de calibración son visibles y claros en la imagen guardada.

5. Selección automatizada de características utilizando software de análisis de imágenes

1. Para colecciones completas de tumores (tiempo aproximado: 5 min; casos dependientes):
   1. Abra el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Seleccione Abrir imágenes y, en la ventana emergente, seleccione el archivo de imagen .svs generado al escanear la diapositiva en el escáner AT2.
      NOTA: Se proporciona un archivo de imagen .svs representativo en el archivo complementario 2.
   2. Desplácese hasta la pestaña Anotaciones . Seleccione la herramienta Pluma en la barra de herramientas Anotación y dibuje una forma alrededor del tejido.
   3. Seleccione la forma y haga clic con el botón derecho en la imagen. En el menú desplegable Avanzado , seleccione Particionamiento (en mosaico). Establezca el tamaño de mosaico y el espacio entre 500 y 40, respectivamente, y seleccione Aceptar para generar los mosaicos. Seleccione y elimine la forma perimetral utilizada para generar los iconos en el paso 5.1.2.
   4. Seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Exportar para guardar las anotaciones en mosaico como un archivo .annotation.
      NOTA: En el archivo complementario 3 se proporciona un archivo de anotación .annotation representativo para una colección completa de tejido tumoral.
   5. Cree una carpeta para la sesión o el proyecto y guarde el archivo .annotation dentro de una subcarpeta etiquetada con el identificador único de la diapositiva.
   6. Desplácese hasta la pestaña Anotaciones . Seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Eliminar todas las capas para eliminar todas las anotaciones de la imagen. Seleccione la herramienta de lápiz y dibuje una línea corta desde la punta interior de la punta de flecha para cada fiducial de calibración. Dibuje las líneas de las marcas en el siguiente orden: arriba a la izquierda, arriba a la derecha, abajo a la derecha.
   7. Seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Exportar para guardar las anotaciones de línea como un archivo .annotation. Agregue _calib al nombre de archivo y colóquelo en la subcarpeta que contiene las coordenadas de las formas en mosaico.
      Nota : un archivo de _calib.anotación representativo se proporciona en el archivo complementario 4.
   8. Copie la dirección del proyecto principal o de la carpeta de sesión. Abra el script generador de importación XML, "Malleator" (disponible a través de https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), utilizando el entorno de desarrollo integrado IDLE y pegue la dirección de la carpeta del proyecto entre las comillas en la parte inferior del script.
   9. Seleccione el menú desplegable Ejecutar | Ejecute Module para ejecutar el script.
      NOTA: El archivo de importación LMD .xml se generará dentro de la subcarpeta creada para la imagen/diapositiva. Se proporciona un archivo .xml representativo en el Archivo Complementario 5.
2. Solo para colecciones enriquecidas con LMD (tiempo aproximado: 15 min; dependiendo del caso):
   1. Abra el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Seleccione Abrir imágenes y, en la ventana emergente, seleccione el archivo de imagen .svs generado al escanear la diapositiva.
   2. Desplácese hasta la pestaña Anotaciones . Seleccione y utilice la herramienta de anotación Rectángulo para dibujar un cuadro alrededor del tejido.
   3. Seleccione la anotación del cuadro y haga clic con el botón derecho en la imagen. Seleccione el menú desplegable Avanzado | Opción de particionamiento (mosaico). Establezca el tamaño de mosaico y el espacio entre 500 y 40, respectivamente, y seleccione Aceptar para generar los mosaicos. Seleccione y elimine la anotación del cuadro perimetral utilizada para generar los iconos en el paso 5.2.2.
   4. Seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Exportar para guardar las anotaciones en mosaico como un archivo .annotation.
   5. Coloque una copia guardada del algoritmo "Dapọ" de Python (disponible a través de https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), desarrollado para fusionar las capas de anotación clasificadas por IA, en la misma carpeta que el archivo de anotaciones en mosaico.
   6. Copie el nombre del archivo de anotación en mosaico. Abra el programa Python utilizando el entorno de desarrollo integrado IDLE y pegue el nombre del archivo de anotación en mosaico entre las citas en la parte inferior del programa.
   7. Seleccione el menú desplegable Ejecutar | Ejecute el módulo. Espere a que se genere un nuevo archivo que tendrá todas las anotaciones en mosaico combinadas en una sola capa.
   8. Abra el software de análisis de imágenes y navegue hasta la pestaña Anotaciones . Seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Eliminar todas las capas para eliminar todas las anotaciones de la imagen.
   9. Seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Importar archivo de anotación local. En la ventana emergente, seleccione el archivo .annotation combinado generado por el script. Asegúrese de que todos los iconos importados estén bajo la misma capa de anotación.
   10. Vaya a la pestaña Clasificador y siga las instrucciones del fabricante para generar formas para los ROI. Antes de ejecutar el clasificador, seleccione la(s) capa(s) de anotación deseada(s) (es decir, la capa de tumor o estroma) marcando la casilla o casillas ROI en la pestaña Anotaciones, en Opciones avanzadas del clasificador. Utilice la opción Capa de anotación del menú Acciones del clasificador para ejecutar el clasificador.
   11. Una vez finalizado el análisis del clasificador, vaya a la pestaña Anotaciones y seleccione la capa de anotación generada a partir del análisis. Seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Eliminar todas las capas menos actuales para eliminar todas las demás capas de anotación de la imagen.
   12. Seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Exportar para guardar las anotaciones como un archivo .annotation. Cree una carpeta para la sesión o el proyecto y guarde el archivo .annotation dentro de una subcarpeta etiquetada con el identificador único de la diapositiva.
       NOTA: En el archivo complementario 6 se proporciona un archivo de anotación .annotation representativo para una colección de tejido enriquecido con LMD clasificado.
   13. Vaya a la pestaña Anotaciones, seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Eliminar todas las capas para eliminar todas las anotaciones de la imagen. Seleccione la herramienta de lápiz y dibuje una línea corta de cada fiducial de calibración. Dibuje líneas de las marcas en el siguiente orden: arriba a la izquierda, arriba a la derecha, abajo a la derecha.
   14. Seleccione el menú desplegable Acciones de capa | Exportar para guardar las anotaciones de línea como un archivo .annotation. Agregue _calib al nombre de archivo y coloque el archivo en la subcarpeta que contiene las coordenadas de las formas en mosaico.
   15. Copie la dirección del proyecto principal o de la carpeta de sesión. Abra el script generador de importación XML, "Malleator" (disponible a través de https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), utilizando el entorno de desarrollo integrado IDLE, luego pegue la dirección de la carpeta del proyecto entre las comillas en la parte inferior del script.
   16. Seleccione el menú desplegable Ejecutar | Ejecute Module para ejecutar el script.
       NOTA: El archivo de importación LMD .xml se generará dentro de la subcarpeta creada para la imagen/diapositiva.

6. Microdisección láser

NOTA: Los pasos del protocolo descritos en esta sección son específicos para usar con un microscopio láser invertido y el software asociado (consulte la Tabla de materiales). Tiempo aproximado: 2 h; depende del caso.

1. Cargue el portaobjetos de membrana marcados (que contiene fiduciales de calibración) con el tejido hacia abajo y el lado de la etiqueta más cerca del operador en el soporte del portaobjetos en la etapa del microscopio láser.
2. Seleccione Importar formas en el menú desplegable Archivo . Seleccione el archivo de importación LMD .xml generado para la diapositiva. Seleccione No en la ventana emergente para evitar cargar puntos de referencia desde el archivo y No en la segunda ventana emergente para evitar el uso de puntos de referencia almacenados previamente para la calibración.
3. Siga las indicaciones de la aplicación LMD y alinee la cruz de calibración con cada uno de los tres fiduciales de calibración de la diapositiva. Busque los fiduciales de calibración que aparecen en la parte superior izquierda, superior derecha e inferior derecha de la imagen de la diapositiva en el software de análisis de imágenes que corresponderán a puntos de referencia en las esquinas delantera derecha, trasera derecha y trasera izquierda, respectivamente, de la diapositiva LMD invertida en el escenario del microscopio. Cambie entre el uso de la lente de objetivo 5x para localizar y el objetivo de 63x para alinear cada fiducial de calibración. Seleccione No en la ventana emergente para evitar guardar los puntos de referencia en el archivo y Aceptar en la segunda ventana emergente para confirmar que se inserta la diapositiva.
4. Mueva la lente del objetivo 5x a su posición y seleccione Sí en la ventana emergente para usar la ampliación real. Una vez que aparezcan las formas importadas, enfoca la cámara en el tejido.
5. Resalte y seleccione todas las formas de la ventana Lista de formas , arrástrelas a su lugar utilizando una o dos anotaciones dentro del campo de visión como referencias y alinee el eje Z vertical para cortar con el láser.
6. Revise las formas importadas y asígnelas a la posición de tubo adecuada para la recolección. Pulse Start Cut para iniciar el láser.
   NOTA: Las formas importadas en el archivo .xml se asignarán automáticamente a la posición "sin mayúsculas" en la ventana Lista de formas . Para cosechar tejido, las formas importadas deben reasignarse a una posición que contenga un tubo cargado.

7. Digestión de proteínas por tecnología de ciclo de presión (PCT)

NOTA: Tiempo aproximado: 4 h (3 h sin tiempo de secado de la centrífuga al vacío).

1. Coloque los tubos de 0,5 ml que contienen los microtubos PCT tapados que contienen tejido cosechado LMD en 20 μL de 100 mM TEAB/10% de acetonitrilo en un termociclador y caliente a 99 °C durante 30 min, luego enfríe a 50 °C durante 10 min.
2. Gire los tubos durante 30 s a 4.000 × g y luego retire los MicroTubos de los tubos de 0,5 ml. Con la herramienta MicroCap, elimine y deseche los MicroCaps de los MicroTubos del PCT. Agregue tripsina (consulte la Tabla de materiales) en una proporción de 1 μg por tejido de 30 mm² e inserte un MicroPestle en el MicroTube utilizando la herramienta MicroCap.
3. Transfiera los MicroTubos a un cartucho de barociclizador y ensamble el cartucho completo. Coloque el cartucho en la cámara de presión del barociclizador y asegure la tapa. Barociclo a 45.000 psi durante 50 s y presión atmosférica durante 10 s a 50 °C durante 60 ciclos.
4. Una vez que se complete el barociclo, transfiera los microtubos a un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml y centrífuga durante 2 minutos a 4.000 × g.
5. Retire el MicroTube del tubo de microcentrífuga de 0,5 ml con la herramienta de tapa. Retire cuidadosamente el mortero con la herramienta de tapa y enjuague la mitad inferior del mortero con 20 μL de agua líquida de grado de cromatografía de masas-espectrometría de masas (LC-MS) y recoja el lavado en un tubo de microcentrífuga limpio de 0,5 ml.
6. Toque suavemente el MicroTube en la parte superior del banco para mover el líquido a la parte inferior y transfiera toda la solución del MicroTube al tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
7. Agregue 20 μL de agua de grado LC-MS al MicroTube y tóquelo suavemente en la parte superior del banco. Transfiera la solución de lavado al tubo de 0,5 ml y repita este paso de lavado una vez más.
8. Centrífuga al vacío para secar las muestras a ~2 μL y añadir 100 μL de 100 mM TEAB, pH 8.0.
9. Determine la concentración de péptidos utilizando un ensayo colorimétrico (ensayo de ácido bicinconínico (BCA); consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

8. Etiquetado de etiquetas de masa en tándem (TMT) y limpieza EasyPep

NOTA: Tiempo aproximado: 7 h 20 min (2 h 20 min sin tiempo de secado de la centrífuga al vacío).

1. Lleve los reactivos de etiquetado TMT isobárico a temperatura ambiente antes de abrirlos. Añadir 500 μL de 100% de acetonitrilo a cada vial de TMT (5 mg). Incubar durante 10 min con vórtice ocasional.
2. Disolver 5 μg de la muestra peptídica en 100 μL de 100 mM TEAB, pH 8.0, y añadir 10 μL de un reactivo TMT dado. Construir e incluir grupos de referencia que representen cada muestra individual en el experimento en cada conjunto de muestras multiplex TMT para facilitar la cuantificación de muestras a través de múltiples multiplexores TMT⁹. Incubar reacciones durante 1 h a temperatura ambiente con sacudidas/golpeteos ocasionales.
3. Apague la reacción de etiquetado de TMT agregando 10 μL de hidroxilamina al 5% e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente con golpeteo ocasional. Después del enfriamiento, combine las muestras marcadas con TMT en un tubo y séquelas a aproximadamente 200 μL.
4. Añadir 1.800 μL de ácido fórmico al 0,1%. Verifique el pH con papel de pH: si pH ~ 3, agregue 1 ml de ácido fórmico al 0.1%; si el pH >3, agregue 10-20 μL de ácido fórmico al 5% hasta el pH ~ 3. Añadir 0.1% de ácido fórmico para llevar a un volumen final de 3 mL.
5. Retire la pestaña en la parte inferior de la columna de limpieza de péptidos, retire la tapa y colóquela en un tubo cónico de 15 ml. Transfiera la muestra etiquetada con TMT a la columna y proceda con la limpieza según el protocolo del fabricante.
6. Centrífuga al vacío para secar los péptidos eluidos a ~ 20 μL, transferir a un vial de LC utilizando bicarbonato de amonio de 25 mM para un volumen final de 80 μL y proceder al fraccionamiento fuera de línea.

9. Fraccionamiento y agrupación de muestras multiplex TMT

NOTA: Tiempo aproximado: 3 h 30 min (1 h 30 min sin tiempo de secado de la centrífuga al vacío).

1. Fraccionar los multiplexores peptídicos marcados con TMT mediante cromatografía básica de fase inversa en 96 fracciones mediante el desarrollo de un gradiente lineal creciente (0,69% ^min-1) de fase B móvil (acetonitrilo) en fase móvil A (10 mM NH₄HCO₃, pH 8.0).
2. Generar 36 fracciones concatenadas agrupando pozos de muestra. Centrífuga al vacío para secar fracciones a ~2 μL y resuspend en bicarbonato de amonio de 25 mM (concentración final 1.5 μg/10 μL), centrifugación a 15,000 × g durante 10-15 min, y transferencia a viales LC para análisis de EM.

10. Cromatografía líquida en tándem espectrometría de masas (LC-MS/MS)

NOTA: Tiempo aproximado: El método del instrumento y el diseño experimental dependen.

1. Calibre el espectrómetro de masas de acuerdo con las instrucciones /protocolos del fabricante.
2. Prepare nuevas fases móviles y estándares y realice preparaciones apropiadas de LC previas a la ejecución (incluidos, entre otros, disolventes de purga, aire enjuagado y scripts de prueba de fugas para el instrumento al que se hace referencia [consulte la Tabla de materiales]). Equilibre las columnas pre y analíticas y el bucle de muestra antes de comenzar los análisis.
3. Antes y entre los análisis multiplex de TMT en serie, valide que el sistema LC-MS cumpla con las métricas de rendimiento previamente comparadas utilizando resúmenes de péptidos etiquetados con TMT de garantía de calidad / control de calidad (QA / QC) y (por ejemplo, MSPE (consulte la Tabla de materiales), HeLa).
4. Cargue los viales del muestreador automático en las posiciones adecuadas en el muestreador automático LC. Analice fracciones individuales con un método de gradiente/MS apropiado. Intercalar una ejecución de "lavado" con el estándar de péptidos (por ejemplo, calibración del tiempo de retención de péptidos [PRTC]) aproximadamente una vez al día para evaluar el rendimiento cromatográfico y espectral de masas. Después del análisis de cada serie de fracciones de muestra multiplex TMT, ejecute los estándares de referencia QA/QC TMT para evaluar el rendimiento del sistema.
5. Ejecute rutinas de evaluación de espectrómetros de masas después de los estándares de referencia QA / QC TMT para evaluar el rendimiento posterior a la muestra y luego calibre el sistema como en el paso 10.1 para el siguiente conjunto de muestras.

11. Análisis de datos bioinformáticos

NOTA: Tiempo aproximado: Diseño experimental dependiente.

1. Transfiera todos los datos de muestra (por ejemplo, archivos .raw) a una unidad de computadora/almacenamiento de red adecuada.
2. Busque todas las fracciones juntas utilizando la aplicación de análisis de datos deseada (por ejemplo, Proteome Discover, Mascot) utilizando los parámetros apropiados⁹ en una base de datos de referencia de proteínas específicas de la especie para generar coincidencias espectrales de péptidos (PSM) y extraer intensidades de señal de iones del informador TMT. Filtre los PSM en función de las métricas de control de calidad apropiadas y agregue las abundancias de la relación de iones del informador TMT normalizada y media transformada en log₂ en abundancias a nivel de proteína global, como se describió anteriormente ^3,9.
3. Comparar alteraciones proteicas en condiciones de interés utilizando el software de análisis diferencial deseado.

Results

Las secciones delgadas de tejido fresco congelado de dos pacientes con HGSOC y dos OCCC se analizaron utilizando este flujo de trabajo integrado de identificación, segmentación, LMD y análisis proteómico cuantitativo de ROI de tejidos impulsado por IA (Figura 1). Las secciones representativas de tejido teñido de H&E para cada tumor fueron revisadas por un patólogo certificado por la junta; la celularidad tumoral varió de 70% a 99%. Los tejidos se sembraron en diapositivas de membrana PEN (Archivo suplementario 2) y se precortaron con fiduciales calibradores (Archivo suplementario 1), lo que permitió la integración de los datos de orientación posicional de las anotaciones generadas en el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) con la orientación de coordenadas cartesianas en el software LMD. Después de la tinción de H&E, se capturaron imágenes de alta resolución (20x) de las diapositivas PEN que contenían el tejido más los calibradores.

Las poblaciones de células tumorales y estromales en las micrografías se segmentaron utilizando software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) para la cosecha selectiva por LMD, junto con cosechas que representan toda la sección delgada del tejido (por ejemplo, tejido tumoral completo) (Figura 1). Las anotaciones no discriminatorias para colecciones completas de tejido tumoral se generaron dividiendo toda la sección de tejido con baldosas de 500 μm², dejando un espacio de 40 μm entre las baldosas para mantener la integridad de la membrana PEN y evitar que la membrana se enrosque durante lmD. En las diapositivas para el enriquecimiento de LMD resuelto por histología, el clasificador de IA en el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) fue entrenado para discriminar entre células tumorales y estromales, junto con el fondo de diapositiva de vidrio en blanco. El tumor representativo, el estroma y las regiones de vidrio en blanco se resaltaron manualmente, y se utilizó la herramienta clasificadora para segmentar estos ROI en toda la sección de tejido. Las capas segmentadas que representan el tejido entero, el epitelio tumoral y el estroma se guardaron por separado como archivos de anotación .annotation individuales (Archivo suplementario 3 y Archivo suplementario 6). En una copia separada del archivo de imagen (sin las anotaciones ROI particionadas), se anotó una línea corta desde la punta central de cada uno de los tres calibradores fiduciarios y se guardó como un archivo de anotación .utilizando el mismo nombre de archivo que cada uno de los archivos de capa de anotación LMD, pero anexado con el sufijo "_calib" (Archivo suplementario 4). Estas líneas se utilizaron para registrar conjuntamente la posición de los calibradores de membrana PEN con los datos de la lista de formas de anotación dibujados en el software de análisis de imágenes.

El presente estudio proporciona dos algoritmos, "Malleator" y "Dapọ" en Python para admitir este flujo de trabajo LMD impulsado por IA, que están disponibles en https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022. El algoritmo Malleator extrae las coordenadas cartesianas específicas para todas las anotaciones individuales (ROI de tejido y calibradores) de los archivos .annotation emparejados y las combina en un único archivo de importación de lenguaje de marcado extensible (XML) (archivo suplementario 5). Específicamente, el algoritmo Malleator utiliza el nombre del directorio de una carpeta principal como entrada para buscar en todas las carpetas de subdirectorios y genera archivos .xml para cualquier subcarpeta que aún no tenga un archivo combinado .xml. El algoritmo Malleator fusiona todas las capas de anotación en el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) en una sola capa y convierte los datos de la lista de formas generada por IA, que se guardan como tipo de archivo de anotación .annotation propietario, en .xml formato compatible con el software LMD. Después de fusionar los archivos de anotación y calibrador, el archivo de .xml generado por el algoritmo se guarda e importa en el software LMD. Se necesitan ligeros ajustes para ajustar manualmente la alineación de las anotaciones, lo que también sirve para registrar la posición vertical (plano z) de la etapa de deslizamiento en el microscopio láser. El algoritmo Dapọ se utiliza específicamente para colecciones enriquecidas con LMD. Los mosaicos particionados se asignan automáticamente a capas de anotación individuales por el software de análisis de imágenes. El algoritmo Dapọ combina todos los mosaicos particionados en una sola capa de anotación antes de usar la herramienta Clasificador, lo que reduce el tiempo de ejecución del análisis del clasificador para colecciones enriquecidas con LMD.

El tumor completo y las muestras de tejido enriquecido con LMD fueron digeridas, marcadas con reactivos TMT, multiplexadas, fraccionadas fuera de línea y analizadas a través de proteómica cuantitativa basada en EM como se describió anteriormente⁹. El rendimiento medio de péptidos (43-60 μg) y la recuperación (0,46-0,59 μg/mm²) para las muestras cosechadas utilizando este flujo de trabajo impulsado por IA fueron comparables con los informes^{anteriores 9,10}. Un total de 5.971 proteínas fueron cocuantificadas en todas las muestras (Tabla suplementaria S1). La agrupación jerárquica no supervisada utilizando las 100 proteínas más variables dio lugar a la segregación de los histotipos HGSOC y OCCC de las muestras tumorales completas y enriquecidas con LMD (Figura 2A), similar a la descrita anteriormente¹¹. Por el contrario, las muestras de estroma enriquecido con LMD de HGSOC y OCCC se agruparon e independientemente de las muestras de tumor enriquecido con LMD y tumores completos. Entre las 5.971 proteínas cuantificadas, 215 se alteraron significativamente (LIMMA adj. p < 0,05) entre colecciones completas de tumores de muestras de HGSOC y OCCC (Tabla suplementaria S2). Estas proteínas alteradas fueron comparadas con las identificadas para diferenciar el tejido tumoral HGSOC y OCCC por Hughes et ^al.11. De las 76 proteínas de firma cuantificadas por Hughes et al., 57 fueron cocuantificadas en este conjunto de datos y estuvieron altamente correlacionadas (Spearman Rho = 0,644, p < 0,001) (Figura 2B).

Figura 1: Resumen del flujo de trabajo integrado para la selección automatizada de la región tisular de interés para la microdisección láser para la proteómica cuantitativa aguas abajo. Los fiduciales de calibración se cortan en portaobjetos de membrana PEN para registrar conjuntamente los datos de orientación posicional de los segmentos derivados de IA del ROI del tejido en el software de análisis de imágenes, HALO, con posicionamiento horizontal en el microscopio LMD. El algoritmo Malleator se utiliza para combinar los datos de segmentación anotados en todas las capas de anotación de una diapositiva con el archivo de referencia _calib, y para convertirlos en un archivo .xml compatible con el software LMD. El tejido cosechado por LMD para el análisis proteómico se digiere y analiza mediante proteómica cuantitativa de alto rendimiento como se describió anteriormente⁹. Abreviaturas: LMD = microdisección láser; ROI = región de interés; TMT = etiqueta de masa en tándem; Quant. = cuantificación; Ident. = identificación; LC-MS/MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de las proteínas en muestras tumorales enteras y enriquecidas con LMD. (A) Análisis de conglomerados jerárquicos no supervisados de las 100 proteínas más variadamente abundantes en muestras tumorales completas y enriquecidas con LMD de HGSOC y OCCC. (B) Correlación de las abundancias de proteínas log₂ veces de cambio entre las cosechas tumorales completas de HGSOC y OCCC en el presente estudio (Mitchell et al., eje x) y un estudio similar de Hughes et al. (eje y)¹¹. Abreviaturas: LMD = microdisección láser; HGSOC = cáncer de ovario seroso de alto grado; OCCC = carcinoma de células claras de ovario; log₂FC = abundancia proteómica transformada en log₂. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria S1: Abundancias de 5.971 proteínas cocuantificadas en todas las muestras de tumores enriquecidos con LMD y completas de muestras de tejido HGSOC y OCCC. Abreviaturas: LMD = microdisección láser; HGSOC = cáncer de ovario seroso de alto grado; OCCC = carcinoma de células claras de ovario. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria S2: Proteínas expresadas diferencialmente (215) en colecciones tumorales completas de HGSOC vs OCCC (LIMMA adj. p < 0,05). Abreviaturas: HGSOC = cáncer de ovario seroso de alto grado; OCCC = carcinoma de células claras de ovario. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo suplementario 1: Archivo de datos de lista de formas representativas (.sld) que contiene fiduciales de calibrador estándar para cuatro posiciones de diapositiva. El archivo se puede importar al software LMD. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Archivo de imagen .svs representativo de una sección de tejido de alta resolución (20x) teñida de H&E. El archivo se puede abrir y ver utilizando un software de análisis de imágenes o un software LMD. Abreviatura: H&E = hematoxilina y eosina; LMD = microdisección láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Archivo de anotación .antación representativo de segmentos tumorales enteros particionados. El archivo se puede importar a un software de análisis de imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 4: Archivo representativo _calib.anotación de segmentos fiduciarios calibradores. La información de coordenadas representa el posicionamiento oriental de las líneas cortas del calibrador dibujadas desde cada fiducial de punta de flecha. El archivo se puede importar a un software de análisis de imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 5: Archivo representativo de lenguaje de marcado extensible (.xml) generado por el algoritmo Malleator. El archivo se puede importar al software de microdisección láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 6: Archivo de anotación .antación representativo de segmentos clasificados con IA particionada para colecciones enriquecidas con LMD. El archivo se puede importar a un software de análisis de imágenes. Abreviaturas: IA = inteligencia artificial; LMD = microdisección láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Si bien ha habido múltiples precedentes de estudios destinados a desarrollar y / o mejorar los flujos de trabajo para el enriquecimiento de subpoblaciones celulares objetivo a partir de FFPE y / o tejidos frescos congelados y metodologías para mantener la calidad de la muestra durante^{el procesamiento} 9,12,13,14,15, existe una necesidad sustancial de desarrollar estrategias automatizadas para preparar muestras de tejido clínico para análisis moleculares para disminuir la variabilidad y aumentar la reproducibilidad. Este flujo de trabajo describe un protocolo estandarizado y semiautomatizado que integra las herramientas de software de análisis de imágenes existentes (consulte la Tabla de materiales) para la recolección resuelta histológicamente de poblaciones de células discretas por LMD a partir de muestras de tejido clínico.

El enriquecimiento de LMD resuelto espacialmente de LOS ROI que capturan poblaciones celulares discretas representa un paso de procesamiento de tejidos de próxima generación antes de los análisis multiómicos para mejorar la caracterización e identificación molecular y facilitar el descubrimiento de biomarcadores selectivos celulares. Este protocolo mejora las metodologías existentes al reducir la exposición a menudo prolongada de las secciones de tejido al entorno ambiental que se asocia con la segmentación manual del ROI por parte de un histólogo (que puede tardar >1-2 h antes de la recolección de LMD). En cambio, este flujo de trabajo permite que el ROI se identifique previamente mediante clasificación y segmentación guiadas por IA. Limitar el tiempo de permanencia del tejido disminuirá las variaciones espurias en las evaluaciones de objetivos moleculares altamente lábiles, como fosfopéptidos y ARNm, o para técnicas analíticas basadas en anticuerpos que se basan en una proteína objetivo que se encuentra en su conformación nativa para su detección.

Cortar fiduciales de calibrador limpios en la diapositiva de membrana PEN que son claramente visibles en la imagen de diapositiva escaneada es uno de los componentes clave que permiten la integración del software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) con el flujo de trabajo de LMD. Asegurarse de que los calibradores tengan un punto preciso ("limpio") en la parte inferior de la forma de "V" permite seleccionar un punto preciso en el software de análisis de imágenes para las líneas del calibrador que se van a extraer, como se describe en los pasos 5.1.6 y 5.2.13. La alineación de estos puntos durante la importación en el software LMD es fundamental para superponer adecuadamente las anotaciones (facilitadas a través de la generación de un archivo .xml compatible utilizando los algoritmos "Malleator" y / o "Dapọ") en el ROI de tejido relevante en la diapositiva LMD física. Es necesario resaltar todas las formas y colectivamente "arrastrar y soltar" en su lugar, incluso cuando la alineación es precisa al importarla al software LMD para registrar la posición vertical (plano z) de la etapa de deslizamiento en el microscopio láser. También se pueden realizar ajustes menores en el posicionamiento de las anotaciones sobre el ROI del tejido durante este paso, si es necesario.

Una limitación de la versión actual del algoritmo Malleator es que no es compatible con las herramientas de forma de anotación predefinidas proporcionadas por el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales), aunque las futuras actualizaciones / versiones del algoritmo tendrán como objetivo mejorar esta compatibilidad. El archivo .annotation para las formas dibujadas con estas herramientas contiene sólo dos conjuntos de coordenadas x e y emparejadas para cada anotación, sin la orientación espacial completa alrededor de esos puntos. El uso actual de estas herramientas da como resultado que las anotaciones se conviertan en líneas rectas definidas por solo dos puntos durante el proceso de importación. Se requiere la definición manual de segmentos de ROI de tejido para una conversión exitosa a formato XML y la importación lmD. Esto se puede realizar definiendo manualmente cada ROI con anotaciones poligonales individuales a mano alzada específicas para el área objetivo o aplicando una anotación circular o rectangular aproximada en todos los segmentos de ROI de tejido, si se desea, y será compatible con este flujo de trabajo.

Si bien el flujo de trabajo presentado aquí se demostró para el análisis proteómico de muestras de tejido de cáncer humano recién congelado, este flujo de trabajo de LMD impulsado por IA se puede usar de manera equivalente con tejidos FFPE, tipos de tejidos no cancerosos y aquellos de fuentes no humanas. También puede admitir otros flujos de trabajo de perfiles moleculares posteriores, incluidos los análisis transcriptómicos, genómicos o fosfoproteómicos. Este flujo de trabajo también puede aprovechar otros usos del software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales), incluso con capacidades asociadas con el conteo de células u otros módulos analíticos, incluido el módulo "Multiplex IHC" o el "Tissue Microarray (TMA) Add-on". Las aplicaciones futuras de este flujo de trabajo también pueden beneficiarse de la predefinición del número de células por segmento de ROI, asegurando así entradas celulares equivalentes a través de múltiples colecciones, o mediante el uso de métodos alternativos para definir los ROI celulares de interés, como la inmunohistoquímica o la sociología celular.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema 1260 Infinity II	Agilent Technologies Inc		Sistema LC fuera de línea
96 MicroCaps (150uL) a granel	Pressure Biosciences Inc	MC150-96
96 MicroMortles a granel	Pressure Biosciences Inc	MP-96
96 MicroTubes a granel (sin tapas)	Pressure Biosciences Inc	MT-96
MS Certified Clear Screw Thread Kits	Fisher Scientific	03-060-058	Frasco de muestra para frationation LC fuera de línea y espectrometría de masas
Acetonitrilo, Optima LC/MS Grade	Fisher Chemical	A995-4	Disolvente de fase móvil
Aperio AT2	Leica Microsystems	23AT2100	Escáner de diapositivas
Axygen  Tubos de PCR con tapa plana de 0,5 mL	Fisher Scientific	14-222-292 Tubos de	muestra; el tamaño se adapta a los tubos de PCT y al termociclador
Barocycler 2320EXT	Pressure Biosciences Inc	2320-EXT	Barocycler
BCA Protein Assay Kit	Fisher Scientific	P123225
cOmplete, Mini, sin EDTA Inhibidor de la proteasa Cocktail	Roche	11836170001
Easy-nLC 1200	Cromatografía líquida Thermo Fisher Scientific
Kit de preparación de muestras EasyPep Maxi	Thermo Fisher Scientific	NCI5734	columna de limpieza de muestras después de la etiqueta
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75	Fisher Scientific	ES903	Columna analítica
Eosina Y Solución acuosa Sigma	Aldrich	HT110216
ácido fórmico, 99+ %	Thermo Fisher Scientific	28905	Aditivo de fase móvil
Versión ggplot2 3.3.5	CRAN	https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/
HALO	Indica Labs Software de análisis de		imágenes
IDLE ( Entorno integrado de desarrollo y aprendizaje)	Python Software Foundation
iheatmapr versión 0.5.1	CRAN	https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/
iRT Kit	Biognosys	Ki-3002-1	LC-MS QAQC Standard
limma versión 3.42.2	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html
Platina de escaneo LMD Ultra LMT350	Leica Microsystems	11888453	modelo de platina LMD equipado con soporte de tubo PCT
LMD7 (versión de software 8.2.3.7603)	Leica Microsystems		(microscopio, láser, cámara, PC, tableta)
Mascot Server	Matrix Science		Software de análisis
de datos Extracto de proteína humana compatible con especificaciones de masas, Digest	Promega	V6951	Estándar LC-MS QAQC Mayer
' s Solución de hematoxilina	Sigma Aldrich	MHS32
PEN Membrana Portaobjetos de vidrio Leica	Microsystems	11532918
Mezcla de calibración del tiempo de retención de péptidos	Thermo Fisher Scientific	88321	LC-MS QAQC
Cóctel de inhibidores de fosfatasa estándar 2	Sigma Aldrich	P5726
Cóctel de inhibidores de fosfatasa 3	Sigma Aldrich	P0044
Pierce LTQ Velos ESI Solución de calibración de iones positivos	Thermo Fisher Scientific	88323	Solución de calibración de instrumentos
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK	Fisher Scientific	164535	Descubridor de proteoma previo a la columna
	Thermo Fisher Scientific	OPTON-31040	Software de análisis de datos
Python	Python Software Foundation
Q Exactive HF-X	Thermo Fisher Scientific		Espectrómetro
de masas R versión 3.6.0	CRAN	https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/
RColorBrewer versión 1.1-2	CRAN	https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/
Kit de digestión inteligente soluble	Thermo Fisher Scientific	3251711	reactivo de digestión
TMTpro 16plex Label Reagent Set	Thermo Fisher Scientific	A44520	reactivos de etiquetado TMT isobáricos
Veriti Termociclador de 60 pozos	Applied Biosystems		4384638 Termociclador
Agua, Optima LC/MS Grade	Fisher Chemical	W6-4	Disolvente de fase móvil
ZORBAX Extend 300 C18, 2,1 x 12,5 mm, 5 &; m, cartucho de protección (ZGC)	Agilent Technologies Inc	821125-932	Columna trampa LC fuera de línea
ZORBAX Extend 300 C18, 2,1 x 150 mm, 3,5 µ m	Agilent Technologies Inc	763750-902	Columna analítica LC fuera de línea