Los explantes retinianos obtenidos de macacos de tipo silvestre se cultivaron in vitro. La degeneración retiniana y la vía de señalización cGMP-PKG se indujeron utilizando el inhibidor de la PDE6 zaprinast. La acumulación de cGMP en los explantes a diferentes concentraciones de zaprinast se verificó mediante inmunofluorescencia.
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Artículo de método
Cultivos organotípicos de explante retiniano de mono macaco
En este artículo
Resumen
Resumen
La degeneración retiniana hereditaria (DR) se caracteriza por la muerte celular fotorreceptora progresiva. La sobreactivación de la vía de la proteína quinasa (PKG) dependiente de guanosina monofosfato cíclico (GMPc) en las células fotorreceptoras causa la muerte celular fotorreceptora, especialmente en modelos que albergan mutaciones en la fosfodiesterasa 6b (PDE6b). Estudios previos sobre RD han utilizado principalmente modelos murinos como ratones rd1 o rd10 . Dadas las diferencias genéticas y fisiológicas entre ratones y humanos, es importante entender hasta qué punto las retinas de primates y roedores son comparables. Los macacos comparten un alto nivel de similitud genética con los humanos. Por lo tanto, se seleccionaron macacos de tipo silvestre (de 1 a 3 años) para el cultivo in vitro de explantes de retina que incluyeron el complejo retina-epitelio pigmentario retiniano (EPR)-coroides. Estos explantes fueron tratados con diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast para inducir la vía de señalización cGMP-PKG y simular la patogénesis de la DR. La acumulación de cGMP y la muerte celular en explantes retinianos de primates se verificaron posteriormente mediante inmunofluorescencia y el ensayo TUNEL. El modelo retiniano de primates establecido en este estudio puede servir para estudios relevantes y efectivos sobre los mecanismos de DR dependientes de cGMP-PKG, así como para el desarrollo de futuros enfoques de tratamiento.
Introducción
La degeneración retiniana hereditaria (DR) se caracteriza por la muerte celular fotorreceptora progresiva y es causada por mutaciones en una amplia variedad de genes patógenos1. El resultado final de la RD es la pérdida de visión y en la gran mayoría de los casos la enfermedad sigue siendo intratable hasta el día de hoy. Por lo tanto, es importante estudiar los mecanismos celulares que conducen a la muerte de los fotorreceptores utilizando modelos que representen fielmente la condición de la enfermedad humana. Aquí, los modelos basados en primates son de particular interés debido a su cercanía con los humanos. En particula....
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Protocolo
El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Comité de Revisión Ética del Instituto de Zoología de la Academia China de Ciencias (IACUC-PE-2022-06-002), y la revisión de ética animal y protocolo animal de la Universidad de Yunnan (YNU20220149).
1. Preparación de explantes retinianos
- Obtener globos oculares de primates de macacos de tipo salvaje, de 1 a 3 años de edad, almacenar en solución de almacenamiento de tejidos y transportar en hielo dentro de las 3 h de la enucleación después de que los monos fueron sacrificados o después de la muerte natural.
- Para la preparación de la solución de protei....
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Resultados
En este estudio, se realizó un cultivo de explante retiniano de mono macaco utilizando explantes que contenían el complejo retina-EPR-coroides (Figura 1, Figura Suplementaria S1). En comparación con el cultivo in vitro de células retinianas que utilizan la retina sin el EPR y la coroides adjuntos, nuestro cultivo de explante facilita una mejor supervivencia celular y, en consecuencia, prolonga la supervivencia de las células fotorreceptoras.
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Discusión
La fototransducción visual se refiere al proceso biológico por el cual las señales de luz se convierten en señales eléctricas por las células fotorreceptoras dentro de la retina del ojo. Las células fotorreceptoras son neuronas polarizadas capaces de fototransducción, y hay dos tipos diferentes de fotorreceptores denominados bastones y conos después de las formas de sus segmentos externos. Los bastones son responsables de la visión escotópica y los conos son responsables de la visión fotópica y de alta agudeza. La DR her.......
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Divulgaciones
Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81960180), la Fundación del Patrimonio Zinke y la Fundación Charlotte y Tistou Kerstan, Centro Médico Clínico de Enfermedades Oculares de Yunnan (ZX2019-02-01). Agradecemos al Prof. Longbao Lv (Instituto de Zoología, Academia China de Ciencias, Kunming, China) por compartir los globos oculares de mono utilizados en este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | B2064 | Solución bloqueante |
| Corticosterona | Sigma | C2505 | Suplementos de |
| Medio Completo DL-tocoferol | Sigma | T1539 | Suplementos de Medio Completo |
| Burro anti ovejas, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Anticuerpo secundario de cGMP |
| Solución de etanol-ácido acético | Shyuanye | R20492 | Líquido fijador |
| Suero fetal bovino | Gemini | 900-108 | Solución de |
| bloqueo Microscopio de fluorescencia | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Imágenes de inmunofluorescencia |
| Glutamina | Sigma | G8540 | Suplementos de Medio Completo |
| Glutatión | Sigma | G6013 | Suplementos de Kit de Detección de |
| Muerte Celular In Situ de Medio Completo, TMR rojo | Roche | 12156792910 | Ensayo TUNEL |
| Insulina | Sigma | 16634 | Suplementos de |
| L-cisteína de Medio Completo HCl | Sigma | C7477 | Suplementos de Medio Completo |
| Ácido linoleico | Sigma | L1012 | Suplementos de Medio Completo |
| MACS Almacenamiento de tejidos Solución | Miltenyi | 130-100-008 | Almacenamiento optimizado de muestras frescas de órganos y tejidos |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Solución bloqueante |
| Paraformaldehído (PFA) | Biosharp | BL539A | Agente fijador |
| PEN. / STREP. 100&veces; | Millipore | TMS-AB2-C | Penicilina / Estreptomicina |
| Tampón de fosfato solución salina (PBS) | Solarbio | P1010 | Solución tampón |
| Povidona yodada | Shanghailikang 310411 | Agente desinfectante | |
| Progesterona | Sigma | P8783 | Suplementos de |
| Proteinasa K | Millpore | 539480 | Proteína de descomposición |
| R16 medio | Life technologies corporation | 074-90743A | Medio básico |
| Retinol | Sigma | R7632 | Suplementos de Medio Completo |
| Acetato de retinilo | Sigma | R7882 | Suplementos de Medio Completo |
| Ovino anti-cGMP | Jan de Vente, Universidad de Maastricht, Países Bajos | Anticuerpo primario de cGMP | |
| Sacarosa | GHTECH | 57-50-1 | Agente deshidratante |
| T3 | Sigma | T6397 | Suplementos de Medio |
| Completo Medio Tissue-Tek (Compuesto O.C.T.) | SAKURA | 4583 | Medio de inclusión |
| Acetato de tocoferilo | Sigma | T1157 | Suplementos de Medio Completo |
| Transferrina | Sigma | T1283 | Suplementos de Medio Completo |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cultivo de células / tejidos |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Tampón de bloqueo |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Agente tensioactivo |
| VECTASHIELD Medio con DAPI | Vector | H-1200 | Medio de montaje |
| Vitamina B1 | Sigma | T1270 | Suplementos de Medio Completo |
| Vitamina B12 | Sigma | V6629 | Suplementos de Medio |
| Completo Vitamina C | Sigma | A4034 | Suplementos de Medio Completo |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | Inhibidor de PDE6 |
| Zeiss Imager M2 Microscopio | Zeiss, Oberkochen,Alemania | microscopio vertical | |
| LSM 900 Airyscan microscopio | de barrido láser de alta resolución | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Alemania | cámara digital | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San José, CA) | |||
| Globos oculares de primates de macacos de tipo salvaje | INSTITUTO DE ZOOLOGÍA | DE KUNMINGSYXK ( ) K2017 -0008 | |
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japón | |||
| Solución del kit TUNEL (REF12156792910, Roche, Alemania), |
Referencias
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).
- Paquet-Durand, F.,....
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Reimpresiones y permisos
