Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación in ovo

Summary

Usando electroporación in ovo , ideamos un método para transfectar selectivamente el oído interno auditivo y el núcleo coclear en embriones de pollo para lograr una eliminación específica del grupo celular de la proteína de retraso mental X frágil durante períodos discretos de ensamblaje del circuito.

Abstract

La proteína de retraso mental X frágil (FMRP) es una proteína de unión al ARNm que regula la traducción local de proteínas. La pérdida o disfunción de FMRP conduce a actividades neuronales y sinápticas aberrantes en el síndrome X frágil (FXS), que se caracteriza por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y problemas de comunicación social. Los estudios de la función de FMRP y la patogénesis del FXS se han realizado principalmente con Fmr1 (el gen que codifica FMRP) knockout en animales transgénicos. Aquí informamos un método in vivo para determinar la función autónoma celular de FMRP durante el período de ensamblaje del circuito y la formación sináptica utilizando embriones de pollo. Este método emplea electroporación específica de etapa, sitio y dirección de un sistema vectorial inducible por fármaco que contiene ARN de horquilla pequeña Fmr1 (shRNA) y un reportero de EGFP. Con este método, logramos una eliminación selectiva de FMRP en el ganglio auditivo (AG) y en uno de sus objetivos del tronco encefálico, el núcleo magnocellularis (NM), proporcionando así una manipulación específica del componente dentro del circuito AG-NM. Además, el patrón de mosaico de la transfección permite controles dentro de los animales y comparaciones de neuronas / fibras vecinas para mejorar la confiabilidad y la sensibilidad en el análisis de datos. El sistema vectorial inducible proporciona control temporal del inicio de la edición de genes para minimizar los efectos acumulativos en el desarrollo. La combinación de estas estrategias proporciona una herramienta innovadora para diseccionar la función autónoma celular de FMRP en el desarrollo sináptico y de circuitos.

Introduction

El síndrome X frágil (SXF) es un trastorno del neurodesarrollo caracterizado por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y comportamientos autistas. En la mayoría de los casos, el SXF es causado por una pérdida global de la proteína X frágil de retraso mental (FMRP; codificada por el gen Fmr1) que comienza en las primeras etapas embrionarias¹. FMRP es una proteína de unión al ARN que normalmente se expresa en la mayoría de las neuronas y células gliales en el cerebro, así como en los órganos sensoriales ^2,3,4. En los cerebros de mamífe....

Protocol

Los huevos y los embriones de pollo se manejaron con cuidado y respeto de acuerdo con los protocolos animales aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jinan.

1. Preparación de huevos y plásmidos

1. Preparación del huevo
   1. Obtenga huevos de gallina fertilizados frescos (Gallus gallus) de la Universidad Agrícola del Sur de China y guárdelos a 16 ° C antes de la incubación. Para una viabilidad óptima, coloque todos los huevos para la incubación dentro de una semana de su llegada.
   2. Colocar los huevos horizontalmente e incubar a 38 °C durante 46-48 h hasta la etapa ....

Results

Al realizar electroporación in ovo en diferentes sitios y en diferentes etapas de desarrollo, logramos un knockdown selectivo de FMRP en la periferia auditiva o en el tronco cerebral auditivo.

Derribo de FMRP en NM
El ARN horquilla pequeño (shRNA) contra el pollo Fmr1 fue diseñado y clonado en el sistema vectorial Tet-On como se describió anteriormente²⁰. La configuración para la electroporación in ovo se muestra en la

Discussion

Para determinar la función autónoma celular de FMRP, es necesario manipular su expresión en grupos celulares individuales o tipos de células. Dado que una de las principales funciones de FMRP es regular la formación sináptica y la plasticidad, la manipulación selectiva de cada componente sináptico de un determinado circuito es un requisito previo para una comprensión completa del mecanismo FMRP en la comunicación sináptica. Usando electroporación in ovo de embriones de pollo, dem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubación de huevos
16 ° C frigorífico	MAGAT		Se utiliza para el almacenamiento de óvulos fecundados.
Incubadora de huevos	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Huevos fertilizados	Granja de la Universidad		Los huevos deben usarse en una semana para una viabilidad óptima.
Preparación de plásmidos
			trabajo al 0,1% en agua destilada y autoclave.
Kit de preparación Maxi-prep de plásmido	QIAGEN	12162	Disuelva el ADN del plásmido en tampón Tris-EDTA (TE); kit de preparación sin endotoxinas
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	S2889	Haga una solución de trabajo de 7,5 M en agua sin nuclasa.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
Jeringa de 1 mL / 5 mL	GUANGZHOU KANGFULAI
Microscopio de disección	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Utilice alícuotas frescas para cada dosis y almacene a -20 & deg;C.
Capilar de vidrio	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm * 100 mm
Parafilm de laboratorio	PARAFILM	PM996	película transparente
Extractor de pipetas	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Condición de tracción: 500 & deg; C para 15 s
Discos de platino	de		0,5 mm de diámetro, intervalo de 1,5 mm.
Tubo de goma	Sigma-Aldrich	A5177
Disección y fijación de tejidos
Pinzas	RWD	F11020-11 Tamaño de	la punta: 0,05 * 0,01 mm
Otras herramientas de cirugía	RWD
Paraformaldehído Sigma-Aldrich	158127		La solución de PFA al 4% recién hecha en solución salina tamponada con fosfato se puede almacenar en 4 & grados; C hasta por 1 semana.
SYLGARD 184 Kit de elastómero de silicona	DOW	01673921	Para placas de fondo negro, se aplica polvo de carbono de grado alimenticio.
SeccionamientoCriostato
	LEICA	CM1850
Gelatina	Sigma-Aldrich	G9391	De piel bovina.
Microtomo deslizante	LEICA	SM2010
Inmunotinción
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón	Abcam	ab150113	:500 dilución, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 cabra anti-conejo	Abcam	ab150078	1:500 dilución, RRID:
AB_2722519 DAPI	Abcam	ab285390	1:1000 dilución
Fluoromount-G medio de montaje	Southern  Biotech	Sb-0100-01
FMRP anticuerpo	Y. Wang, Universidad Estatal de Florida	#8263	dilución 1:1000, RRID: AB_2861242
Anticuerpo Islete-1	DSHB	39.3F7	dilución 1:100, RRID: AB_1157901
Placa Netwell	Corning	3478
Anticuerpo de neurofilamento	Sigma-Aldrich	N4142	dilución 1:1000, RRID: AB_477272
Anticuerpo contra la parvalbúmina	Sigma-Aldrich	P3088	dilución 1:10000, RRID:
AB_477329 anticuerpo SNAP25	Abcam	ab66066	dilución 1:1000, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	Software de edición	de imágenes ADOBE
Microscopio confocal	LEICA	SP8
Microscopio estereoscópico fluorescente	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		paquete de software de procesamiento de imágenes comerciales