Un método visual sensible para la detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para detectar bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno con un protocolo modificado utilizado para la precipitación de sulfuro de bismuto (BS). Las ventajas clave de este método son que es fácil de evaluar y no requiere equipo especializado.

Abstract

El sulfuro de hidrógeno (_H2S) es un gas tóxico producido por bacterias en la proteólisis de aminoácidos y proteínas que contienen azufre que desempeña un papel importante en la salud humana. La prueba de producción de_H2Ses una de las pruebas de identificación bioquímica bacteriana importantes. Los métodos tradicionales no solo son tediosos y lentos, sino que también son propensos a la inhibición del crecimiento bacteriano debido al efecto tóxico de las sales de metales pesados en el medio que contiene azufre, lo que a menudo conduce a resultados negativos. Aquí, establecimos un método simple y sensible para detectar_H2Sen bacterias. Este método es una versión modificada de la precipitación de sulfuro de bismuto (BS) que utiliza placas de microtitulación transparentes de 96 pocillos. El cultivo bacteriano se combinó con una solución de bismuto que contenía L-cisteína y se cultivó durante 20 min, al final de los cuales se observó un precipitado negro. El límite de detección visual para_H2Sfue de 0,2 mM. Sobre la base del cambio de color visual, se puede lograr la detección simple, de alto rendimiento y rápida de las bacterias productoras de_H2S. En resumen, este método se puede utilizar para identificar la producción de_H2Sen bacterias.

Introduction

Las bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno pueden utilizar aminoácidos y proteínas que contienen azufre para producir sulfuro de hidrógeno (_H2S). La producción de_H2Socurre generalmente en bacterias gramnegativas de la familia Enterobacteriaceae y también en miembros de Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. y Shewanella spp.1. Estas bacterias tienen la capacidad de reducir el sulfato en sulfuro de hidrógeno (_H2S) para obtener energía. El sulfuro de hidrógeno ha sido implicado en el desarrollo de resistencia bacteriana a los medicamentos. _H2Sprotege a las bacterias de la toxicidad de las especies reactivas de oxígeno (ROS), antagonizando así el efecto antibacteriano de los antibióticos ^2,3. _H2Stambién tiene un efecto fisiológico importante en el mantenimiento de la homeostasis. A niveles suprafisiológicos, se ha demostrado que el_H2Ses profundamente tóxico para el cuerpo. En el cuerpo humano,_H2Stiene otro papel como molécula de señalización de gas que está involucrada en una variedad de procesos fisiológicos y patológicos. _H2Spuede regular la función sistólica del corazón y desempeña un papel fisiológico importante en la relajación de los vasos sanguíneos, la inhibición de la remodelación vascular y la protección del miocardio ^4,5. El_H2Stambién juega un papel importante en la regulación del sistema nervioso y del tracto digestivo ^6,7. Se ha encontrado que, cuando se exponen a antibióticos bactericidas, las bacterias producen especies letales reactivas de oxígeno (ROS) que conducen a la muerte celular 8,9,10,11.

Como una prueba bioquímica común en cursos de laboratorio microbiológico, la prueba de sulfuro de hidrógeno es un experimento importante en la identificación de bacterias, especialmente bacterias de la familia Enterobacteriaceae. En la actualidad, la prueba de sulfuro de hidrógeno generalmente se realiza en una gran cantidad de aminoácidos que contienen azufre y medio de acetato de plomo inoculados con las bacterias a probar. Después de un período de incubación (2-3 días), los resultados se juzgan observando si el medio de cultivo o la tira de papel de acetato de plomo se ennegrece debido a la producción de acetato de plomo¹¹. Sin embargo, estos métodos tradicionales no solo son tediosos y lentos, sino que también son propensos a la inhibición del crecimiento bacteriano debido al efecto tóxico de las sales de metales pesados en el medio que contiene azufre, lo que a menudo conduce a resultados negativos. Se ha establecido un método basado en bismuto para la detección de H2S^12,13. _H2Spuede reaccionar con el bismuto, formando precipitación de sulfuro de bismuto negro. Para llevar a cabo una reforma para esta prueba bioquímica, se debe establecer un método simple y rápido sin efectos secundarios sobre el crecimiento bacteriano. Aquí, establecimos un método simple para la detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno cultivadas en un ambiente in vitro utilizando sulfuro de bismuto como sustrato en un formato de placa de microtitulación de 96 pocillos.

Protocol

1. Cepas bacterianas

NOTA: Para este experimento, se utilizaron nueve cepas estándar, incluyendo Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigis y Klebsiella pneumoniae (Tabla 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa y Proteus vuigaris pueden producir_H2S, como se describe en la literatura previa¹.

1. Preparación de cultivo bacteriano
   1. Transferir una colonia bacteriana de Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 y Klebsiella pneumoniae de una placa de agar Luria-Bertani (LB) a 100 ml de medio LB y cultivar a 37 °C durante 12-16 h hasta que la concentración bacteriana sea de aproximadamente 1 x 10⁹ células/ml (como lo indica el OD₆₀₀ = 1).
   2. Transfiera una colonia bacteriana de Fusobacterium nucleatum y Proteus vuigaris de las placas de agar caldo de soja tripticasa (TSB) a 100 ml de medio TSB y cultive anaeróbicamente a 37 °C durante 24 h hasta que la concentración bacteriana sea de aproximadamente 1 x 10⁹ células/ml (como lo indica el OD₆₀₀ = 1).

2. Ensayo de detección de_H2S

1. Prueba de producción de sulfuro de hidrógeno
   1. Mezclar 100 μL de cultivo bacteriano con 100 μL de solución de bismuto recién preparada (pH 8,0; cloruro de bismuto (III) de 10 mM, trietanolamina-HCl 0,4 M, piridoxal 5-fosfato monohidrato de 20 mM, EDTA de 20 mM y L-cisteína de 40 mM) en las placas de microtitulación de 96 pocillos y cultivar durante 20 min a 37 °C. Para cada cepa bacteriana, realizar el análisis por triplicado.
   2. Después de 20 minutos, compruebe si hay cambio de color. Si el color de la solución cambia de amarillo claro a negro, esto indica que la bacteria es capaz de producir_H2S. Repita esta medición 3x.
2. Sensibilidad del método
   1. Determinar la sensibilidad del método utilizando diferentes concentraciones de hidrosulfuro de sodio (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM y 0 mM, mezclado con solución BS ¹⁴.
   2. Determinar la presencia de HS−/S²⁻ observando la formación de un precipitado negro de BS. Puntúe el color de los pozos utilizando una escala visual desde ninguna producción de color (-) hasta la producción de color negro más oscuro (++++++).

Results

Detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno
La realización de la prueba_H2Sse investigó utilizando cultivos puros de cepas bacterianas seleccionadas, como se indica en la Tabla 1. Los resultados indicaron que Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa y Proteus vuigaris pueden producir_H2Scon precipitado negro de BS, mientras que Salmonella paratyphi A, Staphy...

Discussion

La prueba de producción de sulfuro de hidrógeno es una de las pruebas fenotípicas convencionales para la identificación y diferenciación de cepas bacterianas. Muchas especies bacterianas pueden producir sulfuro de hidrógeno en su entorno natural, como el agua acuática. Estas especies bacterianas incluyen Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., algunas cepas de Klebsiella sp., Escherichia coli, y algunas especies de Clostridia^15...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro de bismuto (III)	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium  nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cisteína	Amresco	52-90-4
Proteus  vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus  aureus	ATCC	25923
Trietanolamina-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8