Evaluación y manipulación de la actividad neuronal mediante microscopía holográfica de dos fotones

Resumen

Desarrollamos un microscopio holográfico de dos fotones que puede visualizar, evaluar y manipular la actividad neuronal utilizando una alta resolución espaciotemporal, con el objetivo de dilucidar la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos que están asociados con la actividad neuronal anormal.

Resumen

Los avances recientes en bioimagen óptica y optogenética han permitido la visualización y manipulación de fenómenos biológicos, incluidas las actividades celulares, en animales vivos. En el campo de la neurociencia, ahora se ha revelado una actividad neuronal detallada relacionada con las funciones cerebrales, como el aprendizaje y la memoria, y se ha vuelto factible manipular artificialmente esta actividad para expresar las funciones cerebrales. Sin embargo, la evaluación convencional de la actividad neuronal mediante imágenes de Ca²⁺ de dos fotones tiene el problema de la baja resolución temporal. Además, la manipulación de la actividad neuronal por optogenética convencional a través de la fibra óptica solo puede regular simultáneamente la actividad de las neuronas con el mismo fondo genético, lo que dificulta el control de la actividad de las neuronas individuales. Para resolver este problema, recientemente desarrollamos un microscopio con una alta resolución espaciotemporal para aplicaciones biológicas mediante la combinación de optogenética con tecnología holográfica digital que puede modificar los rayos láser infrarrojos de femtosegundo. Aquí, describimos protocolos para la visualización, evaluación y manipulación de la actividad neuronal, incluida la preparación de muestras y el funcionamiento de un microscopio holográfico de dos fotones (Figura 1). Estos protocolos proporcionan información espaciotemporal precisa sobre la actividad neuronal, que puede ser útil para dilucidar la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos que conducen a anomalías en la actividad neuronal.

Introducción

La imagen de Ca²⁺ de dos fotones es una técnica útil para la evaluación de la actividad neuronal. Se puede utilizar para identificar no sólo la actividad neuronal requerida para el comportamiento y la memoria en animales normales^1,2 sino también una actividad neuronal anormal que ocurre en modelos de ratón de trastornos neuropsiquiátricos ^3,4. La técnica se ha utilizado para dilucidar las bases neuronales de las funciones cerebrales. Sin embargo, aunque puede proporcionar imágenes de alta resolución y alta calidad, su resolución temporal es inferior a la del método electrofisiológico ^1,3.

La optogenética ha ayudado a innovar la forma en que los neurocientíficos entienden la función cerebral⁵. Dadas las limitaciones técnicas, la mayoría de la investigación optogenética ha utilizado esquemas de activación con baja resolución espacial, limitando así los tipos de manipulaciones de la actividad neuronal que se pueden realizar en consecuencia. Sin embargo, la manipulación de la actividad neuronal a escalas espaciotemporales más finas puede ser potencialmente útil para una comprensión más completa de la computación neuronal y la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos. La tecnología holográfica espacialmente precisa que puede dar forma a los rayos láser infrarrojos cercanos de femtosegundos promete superar este desafío y abre varias clases experimentales nuevas que antes eran imposibles ^6,7. Esta tecnología permite a los neurocientíficos descubrir los aspectos fundamentales y las patologías de los códigos neuronales sensoriales, cognitivos y conductuales que han estado fuera de su alcance.

La proyección holográfica implica la generación de patrones de luz deseados para acceder selectivamente a células individuales y redes funcionales. Los experimentos in vivo requieren una transmisión óptima de la luz a las células diana en el cerebro vivo. La luz infrarroja penetra más profundamente en el tejido vivo y se puede utilizar para la excitación no lineal de dos fotones (2PE)^8,9,10. Por lo tanto, la microscopía holográfica de dos fotones, que combina proyección holográfica y 2PE, se puede utilizar para evaluar y manipular actividades neuronales para sondear redes celulares y funcionales in vivo. Las aplicaciones biológicas recientes de la microscopía holográfica de dos fotones han dilucidado la actividad neuronal y los circuitos necesarios para el aprendizaje en la corteza visual 11,12^, el bulbo olfatorio¹³ y el hipocampo¹⁴.

Numerosos laboratorios de todo el mundo han reportado resultados y mejoras emocionantes utilizando sus sistemas de estimulación holográfica 15,16,17,18,19,20,21,22,23. En el sistema descrito aquí, el sistema de estimulación holográfica se puede construir como un dispositivo adicional para un microscopio convencional. El modulador de luz espacial de solo fase (SLM) es el dispositivo clave para modular un frente de onda plano a cualquier forma, y el efecto de interferencia se utiliza para controlar la intensidad y la ubicación de los focos. La Figura 2 muestra la estimulación holográfica y las trayectorias de la luz de imágenes. La primera ruta de luz es para el modo de imagen de escaneo de puntos y consiste en un cabezal de escaneo y detectores de imágenes. La segunda trayectoria de luz es para estimulación holográfica con una longitud de onda de 1040 nm y consiste en un SLM1. La tercera trayectoria de luz es para iluminación holográfica con longitud de onda de 920 nm y consiste en un SLM2 y un sensor de imagen. El modo de imagen holográfica puede registrar intensidades de múltiples regiones de interés iluminando múltiples puntos de la muestra. De esta manera, la velocidad de grabación se puede aumentar a unos pocos cientos de fotogramas por segundo. Para lograr imágenes de escaneo puntual o imágenes de iluminación holográfica, el láser de 920 nm se dividió en dos caminos mediante un divisor de haz con una relación fija de 3: 7. Todos los elementos ópticos estaban alineados en una placa óptica con dimensiones de 600 mm × 600 mm. La luz modulada entró a través del puerto de luz en el lado del cuerpo microscópico, mientras que la luz de imagen de escaneo puntual entró a través del cabezal de escaneo en la parte superior del cuerpo microscópico. Estas luces se integraron justo encima de la lente del objetivo y crearon focos en el plano de la muestra. Además, el software hecho a medida permitió que el flujo de trabajo regular fuera simple y consistente.

En este artículo, se presenta un protocolo completo para el uso de la estimulación holográfica o la iluminación para medir la actividad neuronal y evaluar la conectividad funcional entre las neuronas. Para fines de demostración, describimos aquí una cirugía cerebral dirigida al área de las extremidades posteriores de la corteza somatosensorial primaria (S1HL) del cerebro del ratón y un método para evaluar y manipular la actividad neuronal utilizando microscopía holográfica de dos fotones. El procedimiento experimental se divide en cuatro partes. Primero, la placa de la cabeza se fijó al cráneo del ratón con cemento dental. En segundo lugar, un vector viral que expresa jGCaMP8f o GCaMP6m-P2A-ChRmine se inyectó estereotácticamente en el S1HL. En tercer lugar, se calibró el sistema de estimulación o iluminación holográfica. En cuarto lugar, después de la recuperación postoperatoria y la expresión de estas dos proteínas, se realizaron imágenes in vivo de Ca²⁺ para evaluar la actividad neuronal y la conectividad funcional entre neuronas con microscopía holográfica de dos fotones.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya (número de aprobación: M220295-003).

1. Implantación de la placa de la cabeza (Figura 1A)

1. Administrar el anestésico (una mezcla de 74 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina) por vía intraperitoneal para anestesiar al ratón. Compruebe el estado anestésico del ratón con frecuencia mediante la evaluación de los reflejos del pedal.
2. Después de la anestesia, coloque el ratón en un instrumento estereotáxico. Aplique un ungüento para los ojos (consulte la Tabla de materiales) para evitar que la córnea se seque cuando se implanta la placa frontal.
3. Afeite el área quirúrgica y desinfecte la piel con tres rondas alternas de exfoliantes de povidona yodada o clorhexidina seguidas de toallitas con alcohol al 70%. Exponga cuidadosamente el cráneo y límpielo con hisopos de algodón.
   NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados, y todos los procedimientos deben realizarse en consecuencia. Cualquier residuo restante (por ejemplo, cabello o sangre seca) causa reacciones inflamatorias. Por lo tanto, cualquier residuo debe eliminarse bajo un estereoscopio utilizando hisopos de algodón humedecidos con agua estéril o alcohol al 70%.
4. Utilice las coordenadas estereotácticas -anterior y posterior = 0,5 mm, medial y lateral = 1,5 mm de bregma- para encontrar el centro de la craneotomía y etiquetarla con un rotulador.
5. Coloque una placa de cabeza hecha a medida en el centro del cráneo. Luego, aplique cemento dental (consulte la Tabla de materiales) para fijarlo firmemente al cráneo. Aplique una ligera presión hasta que la placa de la cabeza haga contacto firme con la parte frontal y posterior del cráneo.
   NOTA: Este paso tarda aproximadamente 20 minutos en completarse y es fundamental para reducir los artefactos de movimiento en el cerebro durante las imágenes de dos fotones. Las dimensiones de la placa de cabeza son 20 mm × 40 mm × 1 mm con una abertura en forma de placa de inicio con un borde de 15 mm de largo, dos lados adyacentes de 3 mm de largo y los dos lados restantes de 10 mm de largo.
6. Mezcle un cemento de resina adhesiva dental a base de acrílico de la siguiente manera: media cucharada de polvo, tres gotas de líquido y una gota de catalizador (consulte la Tabla de materiales). Para evitar que se seque, aplique este cemento de resina adhesiva dental mixta a la superficie intacta del cráneo del ratón con la placa de la cabeza.
7. Coloque al ratón en una jaula caliente hasta que se haya recuperado de la anestesia. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.

2. Cirugía e inyección de virus adenoasociados (AAV) (Figura 1B)

1. Realice una craneotomía o inyección viral sin retirar el cemento de resina adhesiva dental del cráneo 1 día después de la implantación de la placa frontal.
   NOTA: Administre anestesia (una mezcla de 74 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina) por vía intraperitoneal al ratón durante este procedimiento.
2. Para evitar el edema cerebral, administrar fosfato sódico de dexametasona (1,32 mg/kg) por vía intraperitoneal 1 h antes de la cirugía.
3. Anestesiar al ratón con la placa de la cabeza con anestesia con isoflurano al 1% usando un vaporizador (sistema de administración de anestesia) mientras mantiene la temperatura corporal con una almohadilla térmica. Aplique un ungüento para los ojos para evitar el secado de la córnea.
4. Bajo un estereoscopio, realice una craneotomía circular de aproximadamente 2 mm de diámetro con un taladro dental. Para reducir el daño cerebral, opere el taladro dental cuidadosamente con un ligero movimiento constante y una ligera presión hacia abajo.
5. Retire los fragmentos de hueso varias veces utilizando un sistema de succión. Después de extraer los fragmentos óseos, use una solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) para eliminar y lavar cualquier residuo que quede en la superficie del cerebro. Repita este procedimiento de limpieza varias veces para suprimir las reacciones inflamatorias.
   NOTA: La solución de ACSF (140 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 5 mM de HEPES, 2,0 mM de CaCl 2 y 1,0 mM de MgCl₂) se almacenó a 4 °C durante 1 mes después de disolver y filtrar el reactivo (tamaño de poro = 0,22 μm).
6. Usando un sistema de inyección de presión (ver Tabla de materiales), ajuste la presión adecuada (aproximadamente 10 PSI en pulsos con una duración de 4 ms) para inyectar 500 nL de solución AAV a través de un capilar de vidrio con un diámetro de punta de 10-20 μm (preparado con un extractor de micropipetas) durante 10 min.
7. Determine si la solución de AAV se está administrando al cerebro verificando si el nivel de la solución de AAV en el capilar de vidrio disminuye gradualmente.
8. Deje el capilar de vidrio en su lugar durante 10 minutos adicionales para evitar el reflujo. Repita tres veces para administrar un total de 1,5 μL de solución AAV en el cerebro.
9. Para evaluar y manipular la actividad neuronal en células piramidales de capa 2/3 (L2/3), inyecte una solución AAV (para imágenes de Ca 2+: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE a 1,28 × 10 14 genomas vectoriales/ml, diluido 1:1 en solución salina; para imágenes de Ca²⁺ con optogenética: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE a 1,73 × 10¹⁴ genomas vectoriales/ml, diluidos 1:1 en solución salina) en el área de la pata trasera de la corteza somatosensorial primaria de ratones de tipo salvaje (S1, centrado a 0,5 mm posterior y 1,5 mm lateral desde el bregma, 150 μm de profundidad desde la superficie).
   NOTA: La solución de AAV debe inyectarse a las 2-3 semanas y 1-2 semanas antes de la obtención de imágenes para la expresión de jGCaMP8f y GCaMP6m-P2A-ChRmine, respectivamente.
10. Después de una aplicación de agarosa de bajo punto de fusión al 2% (p/v) en la superficie cerebral de S1 usando una micropipeta, coloque una ventana de vidrio sobre la craneotomía con dos gafas de cobertura. Fije los dos vidrios de cubierta (pequeño de 2,0 mm de diámetro y grande de 4,5 mm de diámetro; consulte la Tabla de materiales) con adhesivo curable UV.
11. Presione el vidrio de la cubierta contra la agarosa mientras aún está líquida; Esto evita la formación de burbujas de aire en la agarosa. Selle los bordes de la ventana craneal con cemento dental y resina adhesiva (Figura 1C).
12. Retire el ratón del instrumento estereotáxico y devuélvalo a su jaula. Coloque al ratón en una jaula caliente y no regrese a la jaula con otros animales hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia. Mantenga cuidadosamente las condiciones estériles durante la cirugía de supervivencia.
13. Durante las primeras 72 h después de la cirugía, verifique el estado de salud del ratón observando el comportamiento general. Si hay alguna anomalía en el comportamiento general, inyecte por vía subcutánea agentes antiinflamatorios y analgésicos.

3. Preparación para el sistema de estimulación o iluminación holográfica (Figura 3)

1. Calibre el sistema de estimulación holográfica colocando la superficie de un portaobjetos de fluorescencia roja (sustrato acrílico fundido) en el plano de la muestra. Coloque el microscopio en modo de imagen en vivo con una luz de excitación débil y ejecute el archivo calibration_GUI.m. Compruebe el panel de parámetros y haga clic en el botón Guardar .
2. Haga clic en el botón Z Scan en el panel del paso 1. Generará automáticamente tres puntos aleatorios en los 21 planos axiales, separados por 2 μm de cada plano.
3. Mueva la barra deslizante y compruebe la imagen en vivo. Encuentre un plano perfecto donde las manchas aparezcan más pequeñas y brillantes, y luego haga clic en el botón Guardar . Esto generará automáticamente un frente de onda esférico desplazado para el holograma digital.
   NOTA: Si no encuentra los puntos de fluorescencia más brillantes, cambie los valores mínimo y máximo del rango de escaneo e inténtelo de nuevo.
4. Haga clic en el botón Ir en el panel del paso 2 y, a continuación, haga clic en seis lugares en el cuadrado izquierdo. Comprueba la imagen en vivo. Si hay seis puntos de fluorescencia distinguibles, escriba sus ejes x e y en los cuadros de edición y haga clic en el botón Guardar . Esto generará automáticamente coeficientes de transformación afín para coordinar la calibración entre la estimulación holográfica y el sistema de imágenes.
   NOTA: El número de par de ejes y el número de spot en el que se ha hecho clic deben coincidir en orden. Si no está seguro, o si no hay puntos en su imagen, inténtelo de nuevo y genere un patrón de puntos único o elija un rango más pequeño alrededor del centro del campo de visión (FOV).
5. Haga clic en el botón Escanear en el panel del paso 3. Generará 441 hologramas digitales para realizar un escaneo de un solo punto a través del campo de visión en 21 × 21 pasos.
   1. Primero, verifique las imágenes mientras cambia los patrones en el cuadro de lista. Luego, ajuste la potencia del láser para obtener imágenes puntuales dentro del rango dinámico del dispositivo de imágenes (por ejemplo, para evitar imágenes demasiado saturadas).
   2. Posteriormente, ajuste el tiempo de intervalo en el cuadro de edición; El tiempo de intervalo debe ser más de dos veces el tiempo de intervalo de grabación. Finalmente, ponga el dispositivo de imagen en modo de grabación y haga clic en el botón Reproducir . Si se completa la reproducción, se mostrarán las cadenas "mostrar OK" en la ventana de comandos. Detenga la grabación y apile imágenes secuenciales grabadas utilizando el método de intensidad máxima.
6. Haga clic en Generar WM en el panel del paso 4 y elija una imagen apilada desde arriba. A continuación, cierre la ventana calibration_GUI. Generará automáticamente un mapa de peso para compensar la intensidad desequilibrada en cada punto.
   NOTA: Para una descripción más detallada, consulte ²; el código de Matlab se puede descargar desde aquí (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Imágenes de Ca²⁺ usando un sensor de imagen con iluminación holográfica (Figura 4)

1. Coloque el ratón inyectado con AAV con una placa de cabeza debajo del microscopio (Figura 1D).
   NOTA: Durante este procedimiento, el ratón está restringido en el estado de vigilia, pero es capaz de escapar de estímulos incómodos.
2. Realice imágenes de dos fotones (modo de escaneo puntual) utilizando un microscopio holográfico y un láser Ti:zafiro bloqueado en modo sintonizado a 920 nm con un objetivo de 25x (consulte la Tabla de materiales).
3. Encienda el software de imágenes comercial (consulte Tabla de materiales). En el modo de imagen en vivo, ajuste el voltaje del detector de imágenes (consulte Tabla de materiales) y la potencia del láser de imágenes para optimizar el brillo de las neuronas que expresan jGCaMP8f. Captura imágenes de las neuronas que expresan esta proteína.
   NOTA: La intensidad del láser de imagen (920 nm) es de 20-30 mW. El campo de visión fue de 512 μm × 512 μm a una profundidad de 100-150 μm de la superficie cortical.
4. Para iluminar neuronas específicas que expresan jGCaMP8f con iluminación holográfica, ejecute el archivo de script SLMcontrol.m. Haga clic en la imagen de referencia y elija la imagen adquirida arriba. Luego, haga clic en el botón Spot para elegir píxeles específicos en las neuronas de la imagen haciendo clic continuo del mouse (Figura 4A). Si la selección está completa, presione el botón Enter en el teclado para finalizarla.
   NOTA: El holograma digital se calcula automáticamente y se muestra en el SLM. Este patrón también se puede revisar haciendo clic en un cuadro de lista. La resolución espacial de un solo punto generado por el SLM fue de aproximadamente 1,2 μm a lo largo de la dirección transversal y ~8,3 μm a lo largo del eje óptico. Utilizamos una lente de objetivo de alta apertura numérica (1.1) para lograr una estimulación holográfica más localizada. La Tabla 1 resume los informes anteriores y este sistema con respecto a la resolución espacial de la estimulación holográfica.
5. Para detectar actividad neuronal con alta resolución temporal utilizando un sensor de imagen (consulte la Tabla de materiales), establezca el tiempo de exposición, el área de imagen y el binning (Figura 4B) antes de realizar la adquisición de imágenes (Figura 4C).
   NOTA: La intensidad del láser de iluminación holográfica (920 nm) que estimula continuamente una neurona es de 2 mW, que es suficiente para detectar la actividad neuronal. Por ejemplo, para lograr una velocidad de fotogramas de 100 Hz para la obtención de imágenes, el tiempo de exposición es de 9 ms, el área de imagen es de 400 μm × 400 μm y la agrupación es de 4.
6. Después del experimento, devuelva el ratón a su jaula doméstica.

5. Imágenes de dos fotones (modo de escaneo puntual) con optogenética utilizando un microscopio holográfico (Figura 2)

1. Repita los pasos 4.1 y 4.2.
2. Encienda el software de imágenes comercial (consulte Tabla de materiales). En el modo de imagen en vivo, ajuste el voltaje del detector de imágenes (consulte Tabla de materiales) y la potencia del láser de imágenes para optimizar el brillo de las neuronas que expresan GCaMP6m-P2A-ChRmine. Capturar imágenes de las neuronas que expresan estas proteínas (Figura 1E).
3. Repita el paso 4.4.
4. Para investigar la conectividad funcional dentro de las neuronas L2/3, use un SLM para generar patrones holográficos de estimulación optogenética (ChRmine; 1,040 nm) y combínelo con imágenes de Ca 2+ de dos fotones (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 píxeles, 2 Hz o 30 Hz, zoom digital^2x, modo de escaneo de puntos; Figura 4D-H).
   1. Para este protocolo, establezca la intensidad del láser de imágenes a 920 nm, a 10-20 mW, y el campo de visión como 256 μm × 256 μm medido a una profundidad de 100-150 μm desde la superficie cortical. Establezca el tiempo de permanencia de píxeles en 1,5 μs para 2 Hz o 100 ns para 30 Hz.
   2. Para ver si un solo estímulo holográfico causó una respuesta de calcio en las neuronas, use 2 Hz y 30 Hz como velocidad de fotogramas de imagen. Establecer la intensidad del láser de estimulación holográfica (1.040 nm) que estimula una sola neurona a 10 mW, que es suficiente para inducir la actividad neuronal (Figura 4D).
      NOTA: La resolución espacial de un solo punto generado por el SLM es de aproximadamente 1,2 μm a lo largo de la dirección transversal y ~8,3 μm a lo largo del eje óptico. El rango de volumen accesible en la dirección lateral es de alrededor de 500 μm × 500 μm y 100 μm en la dirección axial. Además, hemos confirmado con imágenes de Ca²⁺ a una velocidad de fotogramas de imagen de 2 Hz o 30 Hz que no solo una neurona, sino múltiples neuronas pueden ser estimuladas holográficamente simultáneamente (Figura 4E).
5. Realice la adquisición de imágenes con el siguiente protocolo: imagen simultánea de la respuesta Ca²⁺ a 920 nm con 10 estímulos holográficos a 1.040 nm con intervalos de 8 s (0,125 Hz) durante una duración de 50 ms después de un período de referencia de 10 s. Después de que se completan todos los experimentos, los ratones son sacrificados.
   NOTA: Los transitorios de Ca²⁺, si están presentes, fueron evocados por estimulación holográfica, con su pico apareciendo dentro de 1 s después de la estimulación (Figura 4F-H).

6. Análisis de imágenes y evaluación de la conectividad funcional (Figura 4)

1. Abra las imágenes RAW guardadas en los pasos 4.5 o 5.5 con ImageJ. Para compensar el desplazamiento del plano focal, utilice el plug-in ImageJ TurboReg.
   NOTA: Si la corrección con TurboReg no es suficiente, se recomienda utilizar CaImAn (http://github.com/simonsfoundation) para corregir el desplazamiento del plano focal.
2. Para evaluar la actividad neuronal, determine las regiones de interés (ROI) en L2/3 utilizando un algoritmo automatizado (CaImAn). Detectar y analizar transitorios de Ca²⁺ después de definir la intensidad de fluorescencia basal (F₀) y el valor umbral.
   NOTA: F₀ es el^{valor percentil} 35 de la intensidad de fluorescencia adquirida durante el período de imagen inicial. Los transitorios de Ca²⁺ se denotan por Δ F/F 0 (Δ F = F-F₀), donde F es la señal de fluorescencia instantánea. Si el valor de Δ F es superior a 2 S.D. de F₀, evaluamos un transitorio significativo de Ca²⁺.
3. Definir la conectividad funcional en neuronas L2/3, estimular las neuronas diana y medir las respuestas GCaMP6m en neuronas estimuladas y circundantes, en consecuencia (Figura 4F-H).

Resultados

Se presentan grabaciones representativas obtenidas utilizando el método descrito aquí. In vivo Las imágenes de Ca²⁺ con microscopía holográfica requieren de 2 a 4 semanas para completarse desde la implantación de la placa frontal y la inyección de AAV hasta la adquisición de datos. Por lo tanto, para obtener resultados estables, es importante reducir los artefactos de movimiento en el cerebro. La implantación de la placa de la cabeza (paso 1.5) y la colocación de la ventana craneal (paso 2.9) son pasos muy importantes en este proceso. Además, también es importante seleccionar un AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1) que exprese simultáneamente indicador de calcio y opsina en una sola neurona (paso 2.8).

La Figura 4A muestra un punto para la iluminación holográfica de una imagen neuronal adquirida utilizando un script de MATLAB personalizado. Si la iluminación holográfica iluminara con éxito las neuronas que expresan jGCaMP8f, se podrían obtener trazas de Ca²⁺ con un sensor de imagen (Figura 4B), como se muestra en la Figura 4C.

La conectividad funcional entre neuronas se evaluó mediante estimulación holográfica (Figura 4D), como se muestra en la Figura 4E. Debido a que la conectividad funcional entre neuronas es una de las propiedades de los circuitos neuronales que se altera en la patogénesis de un ratón modelo de dolor²⁴, describimos un procedimiento simple para evaluarlo. La Figura 4F muestra una imagen típica de las neuronas L2/3 en S1HL visualizada usando GCaMP6m. Cuando una neurona (círculo naranja) fue estimulada holográficamente, otra neurona (círculo rojo) estaba simultáneamente activa; por lo tanto, el número de conectividades funcionales entre neuronas fue uno (Figura 4G).

Figura 1: Esquema esquemático del procedimiento experimental. (A) Fijación de la placa de la cabeza al cráneo. (B) Inyección estereotáctica de AAV en el área de la pata trasera de la corteza somatosensorial primaria (S1HL). (C) Implantación de la ventana craneal. Para evaluar y manipular la actividad neuronal, se realizan imágenes de Ca²⁺ in vivo en ratones despiertos (D) con estimulación holográfica (E). Las marcas de destello indican estimulación holográfica o iluminación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Sistema utilizado para el microscopio holográfico. (A) Imágenes de las trayectorias de luz de estimulación e iluminación holográfica (izquierda) cerca del microscopio (centro) con un sensor de imagen (derecha). (B) Estas son imágenes ampliadas de estimulación holográfica y caminos de luz de iluminación alrededor de los SLM respectivos (izquierda y derecha) y un punto de exploración de la trayectoria de la luz alrededor de un cabezal de escaneo (centro y derecha). (C) Un esquema de las trayectorias ópticas de estimulación e imagen. Los SLM de solo fase se utilizan para mostrar hologramas digitales, y un expansor de haz (una combinación de L1 y L2) y un sistema de relé 4f (una combinación de L3 y L4 para estimulación holográfica y L4 y L5 para iluminación holográfica) se colocan antes y después de los SLM respectivos para asegurarse de que cada holograma digital se muestre en la pupila de salida de una lente objetiva de inmersión en agua. con un tamaño de imagen ligeramente subrelleno. Para suprimir los componentes residuales de orden cero, se coloca un bloque de viga en el plano intermedio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diagrama de flujo de cómo calibrar el sistema de estimulación o iluminación holográfica. Este diagrama de flujo describe los pasos para calibrar un sistema de estimulación o iluminación holográfica para el espacio de muestra y el sistema de imágenes. Visite el paso 3, preparación para el sistema de estimulación o iluminación holográfica, para obtener instrucciones detalladas y descargar un programa de muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resultados representativos de imágenes y conectividad funcional utilizando un microscopio holográfico . (A) Para iluminar neuronas específicas que expresan jGCaMP8f o GCaMP6m-P2A-ChRmine, se captura la imagen de las neuronas y luego se forma un punto en la neurona utilizando un script de MATLAB personalizado. (B) La configuración del sensor de imagen (tiempo de exposición, área de imagen y agrupación). (C) Imagen representativa y rastros de neuronas que expresan jGCaMP8f en imágenes de 100 Hz con iluminación holográfica y un sensor de imagen. (D) Este gráfico muestra la respuesta neuronal a la estimulación holográfica (1.040 nm) en cada potencia láser (datos de GCaMP6m-P2A-ChRmine que expresan neuronas a una velocidad de fotogramas de imagen de 2 Hz [n = 16]). Las barras de error indican el error estándar de la media. (E) Trazas representativas de Ca²⁺ durante la estimulación holográfica (líneas verticales azules) de 10 neuronas diferentes a velocidades de fotogramas de imagen de 2 Hz (izquierda) y 30 Hz (derecha). En trazas de 2 Hz y 30 Hz Ca²⁺ , el mismo color indica la misma neurona. (F) Diagrama esquemático que evalúa las conexiones funcionales entre neuronas. Cuando se estimula la neurona naranja, las neuronas rojas responden al mismo tiempo, lo que indica que existe conectividad funcional entre estas neuronas. (G) Una imagen típica de las neuronas S1HL que expresan GCaMP6m en WT. Barra de escala = 10 μm. (H) Trazas típicas de Ca²⁺ durante la estimulación holográfica (líneas verticales azules) a velocidades de fotogramas de imagen de 2 Hz (superior) y 30 Hz (inferior). La neurona estimulada está rodeada en naranja, las neuronas que responden están rodeadas en rojo y las neuronas que no responden están rodeadas en gris. La capacidad de respuesta neuronal a la estimulación holográfica se puede detectar a velocidades de imagen de 2 Hz y 30 Hz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	Nuestra puesta a punto 6	Prakash, R. et al. 25	Marshel, J. H. et al. 12	Robinson, N. T. M. et al. 14
Resolución lateral	1,2 μm	1,27 μm	―	2,22 μm
Resolución axial	8,3 μm	56,86 μm	15,5 μm	10,26 μm
Lente objetivo/Apertura numérica	25x/1.1	20x/0.5	16x/0.8	16x/0.8

Tabla 1: Resumen de informes anteriores y este sistema para la resolución espacial de la estimulación holográfica. Se describen la resolución lateral, la resolución axial y la lente del objetivo utilizada durante la medición.

Discusión

Para comprender la función cerebral, es necesario evaluar con precisión los circuitos neuronales subyacentes a la función cerebral extrayendo la dinámica de la actividad neuronal. Además, es esencial identificar cómo se altera este circuito neuronal para dilucidar la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos. De hecho, se sabe que la actividad neuronal está elevada en modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer⁴ y el síndrome X frágil²⁶ y ratones con deterioro de la función de la sustancia blanca³. Además, en un modelo de ratón de dolor inflamatorio, el aumento de la sincronización de la actividad neuronal y la conectividad funcional entre las neuronas se asocia con los síntomas²⁴. La microscopía holográfica de dos fotones nos permite observar simultáneamente la actividad de las neuronas individuales y las conexiones funcionales entre las neuronas, lo cual es necesario para comprender los circuitos neuronales. Utilizamos una lente objetivo 25x con apertura numérica = 1.1 con longitudes de onda de 1,040 nm. La función teórica de dispersión puntual es una distribución gaussiana con anchura completa a la mitad del máximo de 0,5 μm lateralmente y 1,7 μm axialmente. Sin embargo, la apertura numérica real es inferior a 1,1, y el tamaño del punto medido en un cordón de fluorescencia es de 1,2 μm lateralmente y de 8,3 μm axialmente. Dado que el diámetro de la neurona es de aproximadamente 15 μm y el error de calibración está dentro de 3 μm, la orientación es generalmente buena. Sin embargo, las células en la dirección axial pueden verse afectadas por el tamaño de punto más largo⁶. Aquí, describimos la inyección viral, la cirugía, la calibración de sistemas de estimulación o iluminación holográfica y los protocolos de imagen para evaluar y manipular la actividad neuronal en ratones vivos utilizando nuestro sistema de microscopía.

Se necesitan de 2 a 4 semanas para completar todos los procedimientos experimentales, desde la implantación de la placa frontal y la inyección de virus hasta la adquisición de datos para obtener imágenes de Ca²⁺ in vivo utilizando microscopía holográfica. El proceso es complejo y laborioso, y el éxito final del experimento depende de múltiples factores, incluida la condición de la ventana craneal, que se ve afectada por la inflamación postoperatoria, la elección adecuada del indicador Ca²⁺ y la opsina, y si los artefactos de movimiento en las imágenes adquiridas pueden corregirse. En particular, dos pasos son importantes para un resultado exitoso. El primero se refiere a la fijación de la placa de la cabeza y la cirugía; Es crucial que la placa de la cabeza esté firmemente fijada a la cabeza del ratón con cemento dental. Además, es importante limpiar repetidamente los fragmentos óseos y la sangre coagulada con ACSF frío durante la cirugía. Dado que la adherencia a este procedimiento reduce la inflamación, observamos con éxito la dinámica de la microglía, las células responsables del sistema inmune del cerebro, sin activar sus procesos y espinas o las microestructuras de las neuronas^27,28. La segunda cuestión es la evaluación y manipulación de la actividad neuronal. Elegimos AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 para expresar el indicador Ca²⁺ y la opsina en una neurona simultáneamente. Esto se debe a que es difícil infectar eficientemente una neurona con diferentes tipos de AAV. Otra razón para esta elección fue que ChRmine puede activar eficientemente la actividad neuronal a 1.040 nm utilizando un láser de dos fotones¹². Recientemente, se ha relatado que ChRmine, al mutar su estructura basada en información estructural obtenida por microscopía crioelectrónica, mejora su función²⁹, lo que se considera útil para el análisis de la función objetivo en el campo de la neurociencia. A la luz de estos problemas, es necesario compartir métodos efectivos para evaluar y manipular las neuronas al leer la actividad neuronal y escribir información utilizando microscopía holográfica.

Los avances recientes en imágenes y optogenética han revelado la actividad neuronal detallada involucrada en funciones cerebrales como el aprendizaje y la memoria, y es posible manipular artificialmente esta actividad neuronal para expresar las funciones cerebrales³⁰. Sin embargo, los métodos convencionales para la manipulación de la actividad neuronal son altamente invasivos debido a la inserción de fibras ópticas en el cerebro y porque un grupo de células que expresan opsinas se estimula simultáneamente, lo que hace imposible manipular la actividad neuronal con precisión temporal y espacial. Nuestro método puede manipular la actividad neuronal estimulando solo neuronas específicas en el cerebro, lo que permite la manipulación de la actividad neuronal con patrones de estimulación específicos y alta resolución espaciotemporal. Además, es importante señalar que la conectividad funcional entre neuronas sólo puede ser evaluada en un pequeño número de neuronas utilizando experimentos de corte cerebral³¹; Sin embargo, esta técnica permite la evaluación simultánea de múltiples neuronas en animales vivos.

Una de las principales limitaciones de los microscopios holográficos actuales es la necesidad de fijar la cabeza del ratón, lo que limita el comportamiento del ratón. Recientemente, se desarrolló un microscopio miniaturizado de dos fotones³², y con la miniaturización adicional del dispositivo, las imágenes in vivo de Ca²⁺ con estimulación holográfica pueden ser posibles en ratones que se mueven libremente. Además, el potencial de este microscopio podría ampliarse mejorando la resolución temporal de las imágenes y combinándolas con proteínas fluorescentes sensibles al voltaje^{altamente sensibles 33}.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
25x Objetivo	Nikon	N25X-APO-MP	Objetivo
A1MP	Nikon	A1MP	Microscopio
AnesII	Biomaquinaria	AnesII	Sistema de administración de anestesia
C2 plus	Nikon	C2 plus	Microscopio
DECADRON  Fosfato  Inyección	Aspen	21N024	Evita el edema cerebral
Taladro Dental	Jota	C1. HP.005	Taladro dental
Microinyector eléctrico	NARISHIGE	IM-31 Sistema de	inyección
a presión FEATHERS	FEARGER	FA-10	Afeitado
G-CEM ONE IMPRIMACIÓN POTENCIADORA DEL ADHESIVO GC			Cemento de resina imprimación para la adherencia dental
G-CEM ONE neo	GC	43093	Cemento de resina para la adherencia dental
Capilar de vidrio con Filamento	NARISHIGE	GDC-1	Capilar de vidrio
Detector de imagen	Hamamatsu	H10770PA-40	GaAsP fotocátodo fotomultiplicador tubo
Software de imagen	Nikon	NISelements
Solución de inhalación de isoflurano Pfizer		229KAR	Anestésicos
iXon Cámara EMCCD	Andor	iXon Life 888	Imagen
sensor Ketamina	daiitisannkyou	s9-018506	Anestésicos
Leica-M60	Leica	M60	Estereoscopio
	Linicon Linicon	LV-125	Bomba
de vacío Modo bloqueado Ti:zafiro Chameleon Ultra II láser		Coherente Chameleon Discovery NX	Láser de femtosegundo
Mos-Cure	U-VIX	mini 365	Fuente de luz UV LED portátil
PEN Bright	SHOFU INC.	PEN Bright	Unidad de fotopolimerización dental
Puller SUTTER	instaument	P-97	Puller
Instrumento estereotáxico (para ratones)	NARISHIGE	SR-6M-H	Instrumento estereotáxico
Micromanipulador estereotáxico	NARISHIGE	SM-15R	Micromanipulador estereotáxico
Super-Bond CATALYST V	SUN MEDICAL	8070	Cemento de resina adhesivo dental
Monómero de adhesivo dental Super-Bond	SUN MEDICAL	8071	Monómero de adhesivo dental
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder	SUN MEDICAL	145052000	Dientes polvo de polímero
de color Tarivid  Oftálmico  Pomada 0.3%	Santen Pharmaceutical	TRN3952	Ungüento para los ojos
UlTIMATE XL	NSK		Unidad de control de micromotores para laboratorio dental
Adhesivos ópticos de curado UV	THORLABS	NOA61	Adhesivos ópticos de curado UV
Xilacina Bayer		KP0F2BK	anestésicos