Artículo de método

Una plataforma de vacuna de nanopartículas "plug-and-display" basada en vesículas de membrana externa que muestran el dominio de unión al receptor SARS-CoV-2

DOI:

10.3791/64213

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25 de julio de 2022

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1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

En este artículo

Resumen

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El presente protocolo describe la bioingeniería de vesículas de membrana externa como una plataforma de vacunas "Plug-and-Display", que incluye producción, purificación, bioconjugación y caracterización.

Resumen

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Las nanopartículas biomiméticas obtenidas de bacterias o virus han atraído un interés sustancial en la investigación y el desarrollo de vacunas. Las vesículas de membrana externa (OMV) son secretadas principalmente por bacterias gramnegativas durante el crecimiento promedio, con un diámetro de tamaño nanométrico y actividad autoadyuvante, que puede ser ideal para la administración de vacunas. Los OMV han funcionado como un sistema de administración multifacético de proteínas, ácidos nucleicos y moléculas pequeñas. Para aprovechar al máximo las características biológicas de los OMV, se utilizaron OMV derivados de Escherichia coli de bioingeniería como portador y el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 como antígeno para construir una plataforma de vacuna "Plug-and-Display". Los dominios SpyCatcher (SC) y SpyTag (ST) en Streptococcus pyogenes se aplicaron para conjugar OMV y RBD. El gen de la citolisina A (ClyA) se tradujo con el gen SC como una proteína de fusión después de la transfección de plásmidos, dejando un sitio reactivo en la superficie de los OMV. Después de mezclar RBD-ST en un sistema tampón convencional durante la noche, se formó una unión covalente entre los OMV y RBD. Por lo tanto, se logró una vacuna OMV de visualización multivalente. Al reemplazarla con diversos antígenos, la plataforma de vacunas OMV puede mostrar de manera eficiente una variedad de antígenos heterogéneos, lo que podría prevenir rápidamente las epidemias de enfermedades infecciosas. Este protocolo describe un método preciso para construir la plataforma de vacunas OMV, incluida la producción, purificación, bioconjugación y caracterización.

Introducción

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Como plataforma potencial de vacunación, las vesículas de membrana externa (OMV) han atraído cada vez más atención en los últimos años 1,2. Los OMV, secretados principalmente naturalmente por bacterias gramnegativas3, son partículas esféricas a nanoescala compuestas por una bicapa lipídica, generalmente en el tamaño de 20-300 nm4. Los OMV contienen varios componentes bacterianos parentales, incluidos antígenos bacterianos y patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), que sirven como potenciadores inmunes sólidos5. Beneficiándose de sus componentes únicos, estructura natural de vesículas y excelentes sitios de modificación de ingeniería genética, los OMV se han desarrollado para su uso en muchos campos biomédicos, incluidas las vacunas bacterianas6, los adyuvantes7, los medicamentos de inmunoterapia contra el cáncer8, los vectores de administración de medicamentos9 y los adhesivos antibacterianos10.

La pandemia de SARS-CoV-2, que se ha extendido por todo el mundo desde 2020, ha tenido un alto costo en la sociedad mundial. El dominio de unión al receptor (RBD) en la proteína espiga (proteína S) puede unirse con la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (ACE2), que luego media la entrada del virus en la célula11,12,13. Por lo tanto, RBD parece ser un objetivo principal para el descubrimiento de vacunas14,15,16. Sin embargo, el RBD monomérico es poco inmunogénico, y su pequeño peso molecular dificulta el reconocimiento del sistema inmunitario, por lo que a menudo se requieren adyuvantes17.

Con el fin de aumentar la inmunogenicidad de RBD, se construyeron OMV que mostraban RBD polivalentes. Los estudios existentes que utilizan OMV para mostrar RBD generalmente fusionan RBD con OMV para ser expresado en bacterias18. Sin embargo, RBD es una proteína derivada del virus, y es probable que la expresión procariota afecte su actividad. Para resolver este problema, se utilizó el sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivado de Streptococcus pyogenes, para formar un isopéptido covalente con OMV y RBD en un sistema tampón convencional19. El dominio SC se expresó con citolisina A (ClyA) como una proteína de fusión por Escherichia coli de bioingeniería, y ST se expresó con RBD a través del sistema de expresión celular HEK293F. OMV-SC y RBD-ST se mezclaron e incubaron durante la noche. Después de la purificación por ultracentrifugación o cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), SE OBTUVO OMV-RBD.

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Protocolo

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1. Construcción de plásmidos

  1. Inserte la secuencia SpyCatcher que codifica ADN (Archivo Suplementario 1) en un plásmido pThioHisA-ClyA resistente a la ampicilina (ver Tabla de materiales) entre los sitios BamH I y Sal I para construir el plásmido pThioHisA ClyA-SC siguiendo un informe previamente publicado20.
  2. Ligate el gen de fusión SpyTag-RBD-Histag sintetizado (Archivo Suplementario 1) en un plásmido pcDNA3.1 (ver Tabla de Materiales) entre los sitios BamH I y EcoR I para construir el plásmido pcDNA3.1 RBD-ST siguiendo un informe previamente publicado19.

2. Preparación OMV-SC

  1. Realice la transformación ClyA-SC siguiendo los pasos a continuación.
    1. Añadir 5 μL de solución plásmida pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) a 50 μL de cepa competente BL21, soplar suavemente y dejar enfriar en hielo durante 30 min.
    2. Colocar la solución durante 90 s en el baño maría a 42 °C, y luego poner inmediatamente la solución mezclada en hielo durante 3 min.
    3. Añadir 500 μL de medio LB a la suspensión bacteriana y, después de mezclar, cultivar a 220 rpm a 37 °C durante 1 h.
    4. Colocar toda la transformación en una placa de agar LB que contenga ampicilina (100 μg/ml, ver Tabla de materiales) y cultivar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: En experimentos posteriores, la ampicilina se mantuvo en la misma concentración en el medio. Si no, esto puede causar pérdida de plásmidos en las bacterias.
  2. Para la producción OMV-SC, realice los pasos a continuación.
    1. Aislar una sola colonia de la placa (paso 2.1.4.) a 20 ml de medio LB (resistente a la ampicilina) y cultivar durante la noche a 220 rpm a 37 °C.
    2. Inocular la solución bacteriana (a partir de la etapa 2.2.1.) en un medio de 2 L, cultivar a 220 rpm, 37 °C durante 5 h hasta la fase de crecimiento logarítmico (el DO600nm está entre 0,6 y 0,8).
    3. Cuando el OD a 600 nm de la solución bacteriana alcance 0.6-0.8, agregue isopropil-D-tiogalactopiranosido (IPTG, ver Tabla de materiales) para que la concentración final de la solución bacteriana sea de 0.5 mM, y luego cultive durante la noche a 220 rpm a 25 ° C.
  3. Realizar la purificación OMV-SC.
    1. Centrifugar la solución bacteriana a 7.000 g a 4 °C durante 30 min.
    2. Filtrar el sobrenadante con un filtro de membrana de 0,22 μm, luego concentrarlo usando una membrana de ultrafiltración de 100 kD o una columna de fibra hueca (ver Tabla de materiales).
    3. Filtrar el concentrado a través de un filtro de membrana de 0,22 μm, luego centrifugarlo a 150.000 x g a 4 °C durante 2 h con una ultracentrífuga (ver Tabla de materiales) y desechar el sobrenadante con una pipeta.
    4. Resuspender la precipitación con PBS y almacenarla a −80 °C. La solución puede mantener la estabilidad a largo plazo a -80 °C.

3. Preparación RBD-ST

  1. Realice la transfección RBD-ST siguiendo los pasos a continuación.
    1. Seleccione un sistema de expresión eucariota apropiado (por ejemplo, HEK293F) y cultive las células durante la noche a 130 rpm a 37 °C después de la recuperación.
    2. Añadir 20 μL de solución celular HEK293F en el contador celular automatizado (ver Tabla de materiales), registrar el número de células, ajustar la concentración a 1 x 106 células/ml y, a continuación, cultivar las células a 130 rpm a 37 °C durante 4 h.
    3. Filtrar el plásmido RBD-ST a través de un filtro de membrana de 0,22 μm y añadir 300 μg de plásmidos en el medio de cultivo celular (ver Tabla de materiales) hasta que el volumen final sea de 10 ml; Agitar durante 10 s.
    4. Calentar la IPE (1 mg/ml, ver tabla de materiales) a 65 °C en el baño maría, mezclar 0,7 ml de IPE con 9,3 ml de medio de cultivo celular y agitar intermitentemente durante 10 s.
      NOTA: No agite la solución vigorosamente. De lo contrario, las burbujas resultantes pueden afectar la eficiencia de la transfección.
    5. Añadir solución plásmida a la solución de PEI, agitar la mezcla intermitentemente durante 10 s e incubarla a 37 °C durante 15 min.
    6. Añadir la mezcla a 280 ml de medio de cultivo celular y cultivar a 130 rpm a 37 °C durante 5 días.
  2. Realizar la purificación RBD-ST.
    1. Centrifugar las células a 6.000 x g a 25 °C durante 20 min y utilizar una pipeta para recoger el sobrenadante.
    2. Llene la columna con 2 ml de agarosa Ni-NTA (consulte la Tabla de materiales) y lávela 3 veces con 3 PBS.
    3. Agregue imidazol (consulte la Tabla de materiales) en el sobrenadante celular para hacer la concentración final de 20 mM, y cargue el sobrenadante celular 2x.
    4. Agregue 3 volúmenes de columna (CV) de PBS que contengan 20 mM de imidazol para el lavado y recoja la fracción de lavado.
    5. Eluido de gradiente con 3 CV de PBS que contiene concentraciones bajas a altas (por ejemplo, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) de imidazol; Eluya 2x para cada concentración.
    6. Utilice SDS-PÁGINA21 para identificar el RBD-ST en diferentes gradientes de concentración.

4. Bioconjugación y purificación OMV-RBD

  1. Determinar la concentración de proteína por el método BCA (ver Tabla de materiales).
    1. Diluir en serie la solución estándar de proteína BSA de 2 mg/ml a 0,0625 mg/ml, diluir el OMV-SC purificado y RBD-ST 10x, luego mezclar las soluciones de trabajo BCA A y B (proporcionadas en el kit de ensayo) en una proporción de 50:1 (v/v).
    2. Añadir solución de proteína diluida (25 μL/pocillo) y mezclar con solución de trabajo BCA (200 μL/pocillo); incubar a 37 °C durante 30 min.
    3. Medir la absorbancia (OD) a 562 nm de cada pocillo y calcular la concentración de proteína a partir de la curva estándar22.
  2. Realice la bioconjugación de OMV-SC y RBD-ST siguiendo los pasos a continuación.
    1. Mezcle OMV-SC y RBD-ST en PBS en una proporción de 40:1 (w/w).
    2. Gire verticalmente para mezclar la mezcla durante la noche a 15 rpm a 4 °C.
      NOTA: Diferentes antígenos pueden reaccionar en diferentes proporciones. Se podrían probar diferentes relaciones de reacción basadas en las características del antígeno.
  3. Verifique la eficiencia de la reacción.
    1. Preparar 10 μL de OMV-SC, RBD-ST y el producto de reacción (paso 4.2.). Añadir 2,5 μL de tampón de carga 5x (véase la Tabla de materiales) y calentar las muestras a 100 °C durante 5 min. Cargue las muestras en el gel (10 μL/pocillo). Realizar electroforesis a 60 V durante 20 min y cambiar la condición a 120 V durante 1 h.
    2. Transfiera la proteína del gel a las membranas Western Blotting de PVDF (consulte la Tabla de materiales) a 100 V durante 70 min.
    3. Poner la membrana en leche en polvo sin grasa al 5% / TBST y agitar durante 1 h. Luego, lavar 3 veces con TBST durante 5 minutos por lavado con agitación.
    4. Coloque la membrana en anticuerpo His-Tag al 0,1% / TBST (consulte la Tabla de materiales) y agite durante 1 h, luego lave 3 veces con TBST durante 5 minutos por lavado con agitación.
    5. Coloque la membrana en anticuerpos IgG1 (HRP)/TBST anti-ratón al 0,02% (consulte la Tabla de materiales) y agite durante 40 minutos, luego lave 3 veces con TBST durante 5 minutos por lavado con agitación.
    6. Agregue una solución de quimioluminiscencia mejorada (consulte la Tabla de materiales) y exponga la membrana.
  4. Realizar la purificación de OMV-RBD.
    1. Diluir 1 ml de solución de OMV-RBD reaccionada a 10 ml y centrifugar la dilución a 150.000 g a 4 °C durante 2 h.
    2. Utilice una pipeta para desechar el sobrenadante y suspenda el residuo con 10 ml de PBS. Centrifugar la suspensión a 150.000 g a 4 °C durante 2 h.
    3. Desechar el sobrenadante y suspender el residuo con 1 mL de PBS.
      NOTA: Si la solubilidad del antígeno es mucho menor, se puede lograr el mismo efecto de separación mediante cromatografía de exclusión de tamaño19.

5. Caracterización

  1. Realizar dispersión dinámica de luz (DLS).
    1. Diluir las muestras a una concentración de 100 μg/ml y añadir 1 ml de muestra en la celda de muestra.
    2. Elija "Tamaño" para "Tipo de medición", "Proteína" para "Material de muestra", "Agua" para "Dispersante", "25 °C" para "Temperatura", y luego cargue muestras y mida automáticamente23.
  2. Capture imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
    1. Diluir las muestras a 100 μg/ml. Tome una rejilla de cobre de malla 200, agréguele 20 μL de muestra y deje que se absorba durante 10 minutos.
    2. Use papel de filtro para absorber la solución, agregue 20 μL de acetato de uranilo al 3% a la película de soporte y tiñe durante 30 s.
    3. Mecha el acetato de uranilo y seca la película naturalmente a temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Cargue las muestras en el sistema TEM (consulte Tabla de materiales) y capture imágenes a 80 kV.

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Resultados

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El diagrama de flujo para este protocolo se muestra en la Figura 1. Este protocolo podría ser un enfoque general para utilizar OMV como plataforma de vacunación; Solo hay que elegir los sistemas de expresión adecuados en función del tipo de antígenos.

La Figura 2 proporciona un esquema de diseño de plásmidos factible. El gen SC está conectado con el gen ClyA a través de un enlazador flexible, mientras que ST se conecta al terminal 5' ...

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Discusión

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Para crear una plataforma de vacuna de nanopartículas "Plug-and-Display", ClyA fusionado con SC se expresó en cepas BL21 (DE3), que es uno de los modelos más utilizados para la producción de proteínas recombinantes debido a sus ventajas en la expresión de proteínas24, de modo que habría suficiente fragmento SC en la superficie de los OMV durante el proceso de proliferación de bacterias. Al mismo tiempo, se preparó un antígeno diana fusionado con ST para el acoplamiento químico entre los antígenos ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) y el Proyecto de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31670936, 82041045).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ampicilina sódicaSangon BiotechA610028
Contador celular automatizadoBCA Countstar
cwbiocw0014s Sistema de
imagen táctil ChemiDocBio-rad
Dispersión de luz DanamicMalvernZetasizer Nano S90
Aparato de electroforesisCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Cabra pAb a ratón IgG1Abcamab97240
Centrífuga de congelación de alta velocidadBioridgeH2500R
His-Tag mAb de ratónTecnología de señalización celular2366s
Sangon Biotech
Isopropil beta-D-tiogalactopiranósidoSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Leche en polvo descremadaSangon BiotechA600669
OPM-293 medio de cultivo celular Opmbiosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plásmidoWuhan genecreat tecnología
tampón de fosfato solución salinaZSGB-bioZLI-9061
polietilenimina policiencias lineales23966-1
proteínas preteñidaThermo26616
pThioHisA plásmido ClyA-SCWuhan genecreat tecnología
PVDF Membranas de transferencia occidentalRoche
Sistemas de sobremesa Quixstand (columna de fibra hueca de 100 kD)Tampón
SDS-PAGE (5x)BeyotimeP0015
Cloruro de sodioSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (solución de quimioluminiscencia mejorada)Thermo34577
Instrumento de suspensiónLife TechnologyHula Mixer
Microscopio Electrónico de TransmisiónHitachiHT7800
TriptonaOxoidLP0042B
UltracentrífugaBeckman CoulterXPN-100
Espectrofotómetro ultravioletaHitachiU-3900
Extracto de levaduraSangon BiotechA610961
Kit de cuantificación de proteínas BioTech Imidazol A600277 de biológicaescalera debiológica03010040001 de carga GE healthcare

Referencias

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