Reconstitución y caracterización de compuestos de actina-microtúbulos con dinámica y mecánica accionada por motor sintonizable

Resumen

Este artículo presenta protocolos para la ingeniería y caracterización de redes compuestas tridimensionales sintonizables de filamentos de actina coentrelazados y microtúbulos. Los compuestos experimentan una reestructuración activa y movimiento balístico, impulsado por motores de miosina II y quinesina, y están sintonizados por las concentraciones relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras y reticulantes pasivos.

Resumen

El citoesqueleto compuesto, que comprende redes interactivas de filamentos de actina semiflexibles y microtúbulos rígidos, reestructura y genera fuerzas utilizando proteínas motoras como la miosina II y la quinesina para impulsar procesos clave como la migración, la citocinesis, la adhesión y la mecanodetección. Si bien las interacciones actina-microtúbulos son clave para la versatilidad y adaptabilidad del citoesqueleto, la comprensión de su interacción con la actividad de la miosina y la quinesina aún es incipiente. Este trabajo describe cómo diseñar redes compuestas tridimensionales sintonizables de filamentos de actina coentrelazados y microtúbulos que experimentan una reestructuración activa y movimiento balístico, impulsados por motores de miosina II y quinesina, y están sintonizados por las concentraciones relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras y reticulantes pasivos. También se detallan los protocolos para el etiquetado de fluorescencia de los microtúbulos y filamentos de actina para visualizar de manera más efectiva la reestructuración y el movimiento de los compuestos utilizando imágenes confocales multiespectrales. Finalmente, se presentan los resultados de los métodos de análisis de datos que se pueden utilizar para caracterizar cuantitativamente la estructura, la dinámica y la mecánica del no equilibrio. Recrear e investigar esta plataforma biomimética sintonizable proporciona información valiosa sobre cómo la actividad motora acoplada, la mecánica compuesta y la dinámica de filamentos pueden conducir a innumerables procesos celulares desde la mitosis hasta la polarización y la mecano-sensación.

Introducción

El citoesqueleto es una red compuesta dinámica de biopolímeros que interactúan y proporciona soporte estructural y mecánico a las células. Los motores moleculares asociados y las proteínas de unión reestructuran y adaptan el citoesqueleto para permitir que las células crezcan, cambien de forma, se endurezcan, se muevan e incluso se autorrequen, lo que permite innumerables procesos celulares que van desde la migración y la división hasta la mecanodetección ^1,2. Más allá de su importancia en la biofísica celular, el citoesqueleto es también un ejemplo por excelencia de materia activa con posibles aplicaciones de materiales que van desde la cicatrización de heridas y la administración de fármacos hasta la filtración y la robótica blanda 1,3,4,5,6,7,8,9.

Las dos características clave que dotan al citoesqueleto de su diversidad estructural y mecánica única y multifuncionalidad son: 1) su naturaleza compuesta, que comprende múltiples filamentos proteicos que interactúan, como filamentos de actina semiflexibles y microtúbulos rígidos, así como sus proteínas asociadas de unión y reticulación 3,5,10; y 2) su capacidad para reestructurar, mover, engrosar y realizar continuamente el trabajo a través de motores que consumen energía, como miosinas y quinesinas, empujando y tirando de las proteínas filamentosas 1,7,11,12,13. Si bien esta elegante complejidad permite al citoesqueleto mediar procesos tan diversos como la motilidad celular, la citocinesis y la cicatrización de heridas 3,6,7,11^, dificulta la capacidad de los investigadores para reproducir las características distintivas in vivo del citoesqueleto en sistemas reconstituidos in vitro.

Los esfuerzos actuales de reconstitución de fronteras se centran en compuestos de filamentos de actina entrelazados y reticulados y microtúbulos 3,10,14,15,16,17, redes de actomiosina generadoras de fuerza ^{2,8,18,19,20,21} y nemática activa impulsada por microtúbulos de quinesina. interacciones 22,23,24,25,26. Se ha demostrado que los compuestos actina-microtúbulos en estado estacionario muestran propiedades mecánicas emergentes^15,16,27, como una mayor movilidad del filamento y una mayor rigidez en comparación con los sistemas de un solo componente ²⁷. Los estudios sobre sistemas de actomiosina in vitro han reportado una amplia gama de propiedades estructurales y dinámicas que dependen de las concentraciones de actina, miosina y reticulantes 28,29,30,31. Por ejemplo, con suficiente reticulación, las redes de actomiosina sufren contracción a gran escala y engrosamiento 2,28,30,32,33,34,35,36, mientras que sin reticulantes, las redes muestran un flujo rápido y desestabilizador y ruptura ^19,29 . Se ha informado que la nemática activa basada en microtúbulos reconstituida que utiliza grupos de motores de quinesina para reticular y tirar de haces de microtúbulos exhibe flujos turbulentos de larga duración, extensión, pandeo, fracturación y curación 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41^, 42,43,44,45,46,47.

Más recientemente, se ha demostrado que los compuestos de actina-microtúbulos impulsados por minifilamentos de miosina II conducen a una contracción más ordenada y a la integridad de la red en comparación con el flujo desordenado y la ruptura de la red que exhiben las redes de actomiosina sin reticulantes 17,26,48. Además, la combinación de robustez compuesta y generación de fuerza se optimiza cuando la actina y los microtúbulos están presentes en concentraciones comparables. Las características emergentes clave en esta región del espacio de formulación incluyen una mayor resistencia mecánica 26, movimiento coordinado de actina y microtúbulos²⁶, contracción sostenida constante y reestructuración de mesoescala¹⁷.

Aquí, se describen protocolos para diseñar y ajustar compuestos entrelazados y reticulados de microtúbulos y filamentos de actina que son empujados fuera de equilibrio por minifilamentos de miosina II y grupos de quinesina que actúan sobre filamentos de actina y microtúbulos, respectivamente (Figura 1). La dinámica, la estructura y la mecánica de esta clase de compuestos pueden ajustarse mediante las concentraciones relativas de los filamentos, motores y reticulantes para exhibir un rico espacio de fase de flujo advectivo y turbulento, contracción isotrópica, aceleración, desaceleración, desmezcla, rigidez, relajación y ruptura. El enfoque de este trabajo es preparar y ajustar esta clase de compuestos citoesqueléticos activos. Sin embargo, para ayudar a los investigadores en la evaluación comparativa y caracterización de los compuestos activos descritos, también se detallan los métodos de imagen efectivos que utilizan microscopía confocal multiespectral. Finalmente, se presentan los resultados de los métodos clave de análisis computacional que se pueden utilizar para medir la dinámica, la estructura y la mecánica de los compuestos. Se alienta a los investigadores a adoptar estos métodos, que incluyen microscopía dinámica diferencial (DDM), autocorrelación de imágenes espaciales (SIA) y velocimetría de imagen de partículas (PIV), ya que han sido optimizados para caracterizar la dinámica compleja y la diversidad estructural de los compuestos 17,26,49.

Los pasos que se describen a continuación se centran en la preparación de los compuestos y la obtención de imágenes mediante microscopía confocal. Los protocolos que describen el análisis de datos posteriores a la adquisición y las mediciones de pinzas ópticas se pueden encontrar en trabajos anteriores 17,26,48,50^, y se proporcionan a pedido. Todos los materiales se enumeran en la Tabla de materiales proporcionada.

Protocolo

1. Prepare cubreobjetos silanizados y portaobjetos de microscopio para evitar la adsorción de proteínas a las superficies de la cámara

NOTA: Este es un proceso de 2 días. Los portaobjetos silanizados se pueden preparar hasta 1 mes antes de su uso.

1. Coloque los cubreobjetos n.º 1 (24 mm x 24 mm) y los portaobjetos de microscopio (1 pulgada x 3 pulgadas) en un bastidor designado que quepa en el limpiador de plasma. Coloque el bastidor en un limpiador de plasma y ejecute durante 20 minutos.
2. Transfiera los cubreobjetos y portaobjetos a un nuevo bastidor designado solo para su uso con silano y colóquelo en un recipiente de vidrio para limpiar los vidrios como se describe a continuación.
   1. Sumerja los cubreobjetos y portaobjetos en acetona al 100% durante 1 h. Sumerja los cubreobjetos y portaobjetos en etanol al 100% durante 10 minutos.
   2. Sumerja los cubreobjetos y toboganes en agua desionizada (DI) durante 5 min. Repita los pasos de limpieza dos veces más.
   3. Sumerja los cubreobjetos y toboganes en KOH de 0,1 M recién preparados durante 15 min. Sumerja los cubreobjetos y las diapositivas en DI fresco durante 5 minutos. Repita este paso dos veces más.
3. Secar al aire los cubreobjetos y correderas durante 10 min. Trate los cubreobjetos y portaobjetos limpios con silano para producir superficies hidrófobas como se describe a continuación.
   NOTA: Complete los siguientes pasos en una campana extractora.
   1. Sumerja los cubreobjetos y portaobjetos secos en silano al 2% (disuelto en tolueno) durante 5 min. Use un embudo para verter silano nuevamente en su botella designada para reutilizarlo hasta cinco veces.
   2. Sumerja los cubreobjetos y portaobjetos en etanol al 100% durante 5 min. Reemplace el etanol con etanol fresco. Sumerja los cubreobjetos y toboganes durante 5 minutos.
   3. Sumerja los cubreobjetos y las diapositivas en DI fresco durante 5 minutos. Repita el paso de lavado de etanol y DI dos veces más usando etanol fresco y DI cada vez. Secar al aire los cubreobjetos y correderas durante 10 min.

2. Preparación de compuestos activos de actina-microtúbulos impulsados por minifilamentos de miosina

1. Elimine la miosina inactiva a través de la unión del filamento de actina y realice la extracción hacia abajo mediante ultracentrifugación como se describe a continuación.
   1. Polimerizar la actina en filamentos. Utilizando una micropipeta de precisión y puntas de pipeta estériles, combinar en un tubo de microcentrífuga: 1,87 μL de DI, 1,3 μL de tampón G 10x, 1,3 μL de tampón F 10x, 1,63 μL de 4 M KCl, 4,53 μL de actina (47,6 μM) y 1,08 μL de faloidina de 100 μM.
      NOTA: Para asegurar una polimerización suficiente, la concentración de actina y la relación molar actina:faloidina deben ser de 18,4 μM y 2:1, respectivamente.
   2. Pipetear suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar y luego colocar en hielo en la oscuridad durante ≥1 h. Enfriar la ultracentrífuga a 4 °C. Retirar la alícuota de miosina a -80 °C y poner en hielo.
      NOTA: Complete el paso 2.2 en este punto mientras la actina se polimeriza.
   3. Después de ≥1 h de polimerización de actina, añadir 1,3 μL de 10 mM de ATP y 2 μL de miosina de 19 μM a la actina polimerizada.
      NOTA: La relación molar actina:miosina debe ser >5 para asegurar la eliminación suficiente de los motores de miosina inactivos (es decir, cabezas muertas).
   4. Pipetea suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Transfiera a un tubo de grado ultracentrífugo.
      Centrifugadora a 4 °C y 121.968 x g durante 30 min.
2. Prepare una red compuesta co-entrelazada de filamentos de actina y microtúbulos como se describe a continuación.
   NOTA: Comience 30 minutos antes de la centrifugación de la miosina (paso 2.1.4).
   1. Ajuste un bloque de calor a 37 °C. Utilice una micropipeta de precisión y puntas de pipeta estériles para añadir lo siguiente a un tubo de microcentrífuga: 13,9 μL de PEM, 3 μL de Tween20 al 1%, 1,55 μL de actina 47,6 μM, 0,36 μL de actina R de 34,8 μM, 0,3 μL de ATP de 250 mM, 0,87 μL de faloidina de 100 μM, 1,91 μL de 5-488-tubulina, 0,3 μL de GTP de 100 mM, y 0,75 μL de 200 μM de Taxol, hasta un volumen total de 23 μL.
      NOTA: Las concentraciones de actina y tubulina enumeradas son para un compuesto con 2.9 μM de actina y 2.9 μM de tubulina. La concentración total de proteína es c = c A + c T = 5.8 μM y la fracción molar de actina es c A / (c_A + c _T) = Φ_A = 0.5. Consulte el paso 2.5 para ajustar estos valores.
   2. Pipetear suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar y colocar en un bloque de calor a 37 °C protegido de la luz durante 1 h.
3. Prepare cámaras de muestra para experimentos de imágenes confocales como se describe a continuación.
   NOTA: Complete los pasos 2.1.4 y 2.2.2 durante los períodos de espera.
   1. Coloque dos portaobjetos silanizados uno al lado del otro en una placa caliente (apagada), coloque dos tiras de película de sellado termoplástica a través de las guías a una distancia de ~ 3 mm y coloque dos cubreobjetos silanizados sobre la película de sellado termoplástica para formar una cámara de muestra.
   2. Gire la placa caliente en ajuste bajo hasta que los cubreobjetos se unan firmemente a las guías con una película de sellado termoplástica fundida (~ 1-2 min). Presione hacia abajo con una presión uniforme para garantizar la unión mientras mantiene un espacio de ~ 100 μm entre las dos superficies.
   3. Retire las cámaras y apague la placa caliente. Cámaras de etiquetas con (+) y (-). La cámara (+) será para la muestra activa (con miosina) y la cámara (-) será la cámara de control (sin miosina). Asegúrese de que cada cámara pueda acomodar ≤10 μL de líquido.
4. Prepare muestras para la imagen como se describe a continuación.
   Nota : es importante completar este paso inmediatamente después de completar los pasos 2.1 y 2.2.
   1. Extraer con cuidado la muestra de miosina-actina de la ultracentrífuga (paso 2.1.4) e inmediatamente pipetear los 7,5 μL superiores del sobrenadante y transferirla a un nuevo tubo de microcentrífuga.
   2. Retire la muestra de actina-microtúbulos del bloque térmico y mezcle suavemente 1,5 μL de 10x D-glucosa, 1,5 μL de 10x GOC y 1,5 μL de 1 mM de blebbistatina. Dividir la solución en dos alícuotas de 13,7 μL y etiquetar como (+) y (-).
   3. Mezclar 1,28 μL del sobrenadante desde la etapa 2.4.1 hasta (+) alícuota. Mezclar 1,28 μL de DI a la (-) alícuota. Hacer fluir lentamente cada solución hacia la cámara correspondiente (paso 2.3) por acción capilar. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en el canal.
   4. Selle los dos extremos abiertos de cada canal con pegamento epoxi o UV de secado rápido. Asegúrese de que el adhesivo esté completamente seco antes de colocarlo en el microscopio. Imagen inmediatamente como se describe en el paso 3.
      NOTA: El pegamento UV es ventajoso porque se cura casi instantáneamente tras la exposición a los rayos UV. Sin embargo, debido a que la blebbistatina es sensible a los rayos UV, es importante iluminar localmente el pegamento (en los bordes de la cámara de muestra) con una pequeña varita UV para evitar desactivar la blebbistatina.
5. Opcional: variar las concentraciones de proteínas para ajustar la dinámica y la estructura de los compuestos.
   NOTA: Los siguientes pasos son alteraciones sugeridas a los pasos anteriores para variar las concentraciones de actina, microtúbulos y miosina si se desea.
   1. Siga los pasos descritos anteriormente, excepto las siguientes modificaciones en los pasos 2.2.1 y 2.4.3.
   2. Para variar las concentraciones de actina y microtúbulos, ajustando así c y Φ_A, aumentar o disminuir el volumen de actina, R-actina y 5-488-tubulina utilizados en el paso 2.2.1, según se desee²⁶. Al variar la concentración de actina, ajuste las concentraciones molares de R-actina y faloidina proporcionalmente para mantener las mismas proporciones molares con actina. Ajustar el volumen de PEM de forma que el volumen final de la mezcla permanezca en 23 μL. Todos los demás volúmenes y concentraciones de componentes siguen siendo los mismos.
   3. Para variar la concentración de miosina, ajustar el volumen de miosina añadido a la (+) alícuota en el paso 2.4.3 según se desee. Ajuste el volumen DI añadido a la alícuota (-) en consecuencia. Ajustar el volumen de PEM en el paso 2.2.1 para tener en cuenta el aumento o la disminución del volumen de miosina (+) y DI (-), asegurando que el volumen final de cada muestra ((+) y (-)) sea de 14,98 μL.

3. Obtención de imágenes y caracterización de compuestos activos mediante microscopía confocal

1. Para obtener imágenes de compuestos de actomiosina-microtúbulos preparados en el paso 2, use un microscopio confocal de barrido láser (LSCM) o un microscopio similar, con un objetivo de inmersión en aceite de 60x 1.4 NA. Para visualizar simultáneamente filamentos de actina y microtúbulos en canales de fluorescencia separados, use un láser de 561 nm con filtros de excitación/emisión de 565/591 nm y un láser de 488 nm con filtros de excitación/emisión de 488/525 nm.
2. Coloque la cámara de muestra en el microscopio de tal manera que el canal de control se coloque directamente sobre el objetivo. Asegúrese de que haya una interfaz de aceite entre el objetivo y el cubreobjetos.
3. Utilice los controles de escenario para enfocar el compuesto de control y, a continuación, busque ambas superficies de la cámara de muestra. Mueva la posición z al centro de la cámara de muestra. Compruebe la presencia de redes filamentosas transparentes como se muestra en la Figura 2.
4. Aún visualizando la cámara de control, ajuste la intensidad de cada láser para permitir la visualización simultánea de filamentos de actina y microtúbulos. Mantenga la intensidad láser más baja posible para evitar el fotoblanqueo (más frecuente en el canal de actina) y el sangrado (generalmente de los microtúbulos al canal de actina).
5. Para caracterizar la muestra de control inactiva, recopile tres series temporales (vídeos) de imágenes de 256 x 256 píxeles cuadrados (213 μm x 213 μm) a 2,65 fps para un total de ≥1000 fotogramas. Recoger cada serie temporal en una región diferente de la cámara de muestras separada por ≥500 μm. Asegúrese de que haya un movimiento detectable mínimo y que no haya flujo ni reestructuración.
6. Apague el láser de 488 nm y utilice los controles del escenario para desplazarse a la cámara (+).
7. Usando el láser de 568 nm, visualice los microtúbulos en el canal (+) para asegurar la formación adecuada de la red (Figura 2) e identifique el centro axial de la cámara de muestra (que puede ser diferente a la posición z central de la cámara de control).
8. Encienda el láser de 488 nm y repita el paso 3.5 anterior con las siguientes modificaciones. Recopile series temporales durante un máximo de 45 minutos, deteniendo la adquisición cuando la muestra se mueva fuera del campo de visión, se rompa o fotoblanquea. Registre de 5 a 10 series temporales y lleve un registro de la hora en que comienza cada serie temporal en relación con el inicio de la primera serie temporal.
9. Analice los datos utilizando DDM, SIA y PIV como se describe en la Figura 3, Figura 4, Figura 5 y anteriormente^17,48,50,51.
   NOTA: El láser de 488 nm activa localmente la actividad de la miosina ATPasa desactivando la blebbistatina, por lo que solo debe activarse al inicio de la adquisición de datos, de modo que t = 0 esté al comienzo de la serie temporal. Estos parámetros de adquisición están optimizados para el análisis de microscopía dinámica diferencial (DDM) como se hizo anteriormente²⁶.

4. Preparación de compuestos activos de actina-microtúbulos accionados por motores de kinesina

NOTA: Los siguientes pasos crean compuestos de actina-microtúbulos que se desequilibran mediante motores de quinesina o una combinación de quinesina y miosina⁵⁰.

1. Prepare los motores de kinesina y miosina como se describe a continuación.
   1. Si incorpora miosina, siga el paso 2.1.
   2. Para formar grupos motores de quinesina que se unen y ejercen fuerzas entre pares de microtúbulos, use una micropipeta y puntas de pipeta estériles para agregar lo siguiente a un tubo de microcentrífuga estéril de 1.5 ml: 1.16 μL PEM, 2.74 μL 8.87 μM dímeros de quinesina, 7.29 μL 83.3 μM NeutrAvidin, 0.81 μL 2mM DTT . Mezclar suavemente pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo e incubar protegida de la luz (utilizar un tubo de microcentrífuga negro o envolver en papel de aluminio) durante 30 min a 4 °C.
      NOTA: La relación molar de los dímeros de quinesina a NA es de 1:25.
2. Siga el paso 2.3 para preparar cámaras de muestra y hacer tres cámaras en lugar de dos. Realizar este paso durante la incubación de quinesina (paso 4.1.2) y la ultracentrifugación de miosina (paso 4.1.1).
3. Preparar una red compuesta co-entrelazada de filamentos de actina y microtúbulos.
   1. Ajuste el bloque de calor a 37 °C. Utilice una micropipeta y puntas de pipeta estériles para agregar lo siguiente a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml: 3,21 μL PEM, 4,5 μL de Tween20 al 1%, 2,18 μL de actina 47,6 μM, 3,46 μL de 5-R-tubulina, 4,5 μL de ATP de 100 mM, 4,5 μL de GTP de 10 mM, 1,13 μL de Taxol de 200 μM y 1,57 μL de 20 μM 488-faloidina. Asegúrese de que el volumen total sea de 25 μL.
   2. Pipetear suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar y colocar en el bloque de calor de 37 °C protegido de la luz durante 1 h. Retire el tubo del bloque térmico y use una micropipeta para mezclar suavemente 0,84 μL de faloidina de 100 μM. Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      NOTA: La adición de faloidina en este paso, en lugar de en el paso 4.3.1, mejora el etiquetado de fluorescencia de los filamentos de actina, ya que la 488-faloidina no tiene que competir con la faloidina no marcada para los sitios de unión a la actina.
4. Prepare compuestos activos para imágenes confocales.
   1. Añadir 1,13 μL de blebbistatina de 200 μM, 1,35 μL de 10x Glu, y 1,35 μL de 10x GOC a la solución del paso 4.3.2 y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Dividir la solución en tres alícuotas de 10 μL y etiquetar como (K), (K+M) y (-).
   2. Mezclar 2,54 μL de miosina desde el paso 2.1.4 hasta la alícuota (K+M). Mezclar en 2,54 μL PEM a (K) y (-) alícuotas.
   3. Utilice una micropipeta y puntas de pipeta estériles para añadir 2,5 μL de racimos de quinesina desde el paso 4.1.2 hasta las alícuotas (K) y (K+M). Pipet arriba y abajo para mezclar. Mezclar 2.5 μL PEM a (-) usando la misma técnica.
      NOTA: Las concentraciones de actina y tubulina enumeradas son para un compuesto con 2,32 μM de actina y 3,48 μM de tubulina. La concentración total de proteínas es c = c_A + c T = 5.8 μM y la fracción molar de actina es c A / (c A + c_T) = Φ _A = 0.4. Las concentraciones de quinesina y miosina son 0,35 μM y 0,47 μM, respectivamente. Consulte el paso 2.5 para obtener instrucciones generales para ajustar c A, c_T, c y Φ_A.
   4. Con una micropipeta, hacer fluir lentamente cada solución hacia el canal correspondiente de las cámaras de muestra preparadas (paso 4.2) por acción capilar. Empuje hacia abajo muy lenta y suavemente la pipeta para no introducir burbujas de aire en el canal.
   5. Selle los dos extremos abiertos de cada canal con epoxi de secado rápido o pegamento curable por UV. Asegúrese de que el adhesivo esté completamente seco antes de colocarlo en el microscopio.
      NOTA: Es importante que este paso se realice rápidamente para minimizar el tiempo que la kinesina está actuando sin ser monitoreada. Por esta razón, se recomienda epoxi que cura en 1 minuto (en lugar de 5 o 10 minutos). El pegamento curable por UV es ventajoso en este sentido porque se cura casi instantáneamente tras la exposición a los rayos UV.
5. Las muestras preparadas por la imagen inmediatamente, siguiendo el paso 3, excepto las siguientes modificaciones importantes. Debido a que la quinesina no se controla mediante la activación de la luz, comienza a funcionar inmediatamente después del paso 4.4.3, así que marque este tiempo como t = 0. Para obtener una imagen del compuesto lo más cerca posible del estado inactivo inicial (t = 0), cree primero una imagen de los canales (K) y (K + M) y anote el tiempo transcurrido entre el paso 4.4.3 y el comienzo de la adquisición de datos (paso 3.8). En la práctica, este tiempo transcurrido es ~ 5 min.

5. Incorporación de reticulantes pasivos en compuestos activos

NOTA: Estos pasos describen cómo usar las subunidades biotiniladas de actina y tubulina y NeutrAvidina (NA) para reticular pasivamente actina a actina (A-A) o microtúbulos a microtúbulos (M-M) en los compuestos activos descritos en el paso 4.

1. Preparar complejos reticulantes A-A o M-M con proteínas biotiniladas (biotina-actina o biotina-tubulina), NA y biotina en una proporción de 2:2:1 biotina-actina/tubulina:biotina:NA. Inicie este proceso antes del paso 4.
   1. Para los reticulantes A-A, use una micropipeta y puntas de pipeta estériles para agregar 2 μL de 11.6 μM de biotina-actina, 1.39 μL de 8.33 μM NA, 2.27 μL de biotina 1.02 μM y 4.34 μL de PEM a un tubo de microcentrífuga. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   2. Para los reticulantes M-M, use una micropipeta y puntas de pipeta estériles para agregar 1.86 μL de 4.55 μM biotina-tubulina, 1.11 μL de 8.33 μM NA, 1.82 μL de 1.02 μM biotina y 5.21 μL de PEM a un tubo de microcentrífuga. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   3. Envuelva los tubos de los pasos 5.1.1 y/o 5.1.2 en una película de sellado termoplástica para crear un sello hermético. Colocar en una balsa de flotación en un baño sonicador con temperatura controlada a 4 °C.
   4. Sonicar durante 90 min a 4 °C. En la práctica, es mejor colocar el sonicador en una habitación fría y agregar bolsas de hielo al baño de sonicación para mantener la temperatura baja.
2. Para incorporar complejos de reticulación en muestras para imágenes, siga el paso 4.3, modificando el paso 4.3.1 como se describe a continuación para la reticulación A-A (paso 5.2.1) o la reticulación M-M (paso 5.2.2).
   1. Para la reticulación A-A, combine lo siguiente en un tubo de microcentrífuga: 1,94 μL de PEM, 4,50 μL de Tween20 al 1%, 2,18 μL de actina 47,6 μM, 3,46 μL de 45,5 μM 5-R-tubulina, 1,13 μL de reticulantes A-A (paso 5.1.1), 4,50 μL de ATP de 100 mM, 4,50 μL de GTP de 10 mM, 1,13 μL de Taxol de 200 μM, y 1,57 μL de 20 μM 488-faloidina. Asegúrese de que el volumen total sea de 25 μL.
   2. Para la reticulación M-M, combinar lo siguiente en un tubo de microcentrífuga: 1,97 μL de PEM, 4,50 μL de Tween20 al 1%, 2,18 μL de actina 47,6 μM, 3,76 μL de 45,5 μM 5-R-tubulina, 1,13 μL de dilución 1:4 de reticulantes M-M (paso 5.1.2), 4,50 μL de ATP de 100 mM, 4,50 μL de GTP de 10 mM, 1,13 μL de taxol de 200 μM, y 1,57 μL de 20 μM 488-faloidina. Asegúrese de que el volumen total sea de 25 μL.
3. Siga los pasos 4.3.2-4.5 con las concentraciones específicas para una relación molar reticulante:actina de R_A = 0.02 y una relación molar reticulante:tubulina de R_T = 0.005. Estos valores de R A y_R T dan como resultado longitudes similares entre reticulantes a lo largo de filamentos de actina y microtúbulos (d A 60 nm y d MT 67 nm), estimadas utilizando d A = I monómero/2R _A, donde I monómero es la longitud de un_monómero de actina, y d _MT =_{I anillo}/26R_T, donde I anillo es la longitud de un_anillo de 13 tubulinas ^{15, 17}.

Resultados

Para determinar la preparación exitosa de compuestos activos (Figura 1) y caracterizar su dinámica y estructura, se utiliza un microscopio de fluorescencia de barrido láser con al menos dos canales de fluorescencia para visualizar los filamentos de actina y los microtúbulos simultáneamente (Figura 2 y Figura 6). Todos los filamentos de actina y microtúbulos en los compuestos están escasamente marcados, en lugar de dopaje en filamentos brillantes trazadores, como se hace a menudo en estudios in vitro . Este método garantiza que la dinámica y la estructura medidas sean representativas del compuesto en sí en lugar de los trazadores que se forman en condiciones diferentes a las de los compuestos. Por esta razón, los filamentos de actina individuales y los microtúbulos normalmente no se pueden resolver, sino que las imágenes representan la estructura de la red de mesoescala (Figura 2 y Figura 6).

Este enfoque de etiquetado se optimizó para la autocorrelación de imágenes espaciales (SIA) y los análisis de microscopía dinámica diferencial (DDM) que examinan la dinámica y la estructura en el espacio recíproco de Fourier (Figura 4, Figura 5 y Figura 8)^52,53,54,55. La velocimetría de imagen de partículas (PIV) también se puede usar para representar y caracterizar la dinámica y los campos de flujo (Figura 3 y Figura 7), pero requiere agrupación de píxeles (resolución espacial más baja) e incrementos de tiempo de retraso más grandes (resolución temporal más baja) que SIA y DDM para eliminar los vectores erróneos que surgen del ruido en las imágenes densas y de baja señal. Sin embargo, se recomienda la PIV para el examen cualitativo de los campos de flujo y la corroboración de los resultados de DDM (Figura 4 y Figura 8)^26,50.

La caracterización de muestras de las redes descritas utilizando estos análisis (es decir, DDM, SIA, PIV) se proporciona para ayudar a los investigadores a adoptar análisis similares para comparar y caracterizar sus muestras. Sin embargo, las descripciones detalladas de estas técnicas están fuera del alcance de este trabajo. Para obtener descripciones detalladas de cómo realizar DDM en estos y otros sistemas similares, incluido el código Python fácil de usar, consulte los trabajos anteriores 17,26,49,50 y las referencias que contienen. Para obtener detalles sobre cómo realizar SIA y PIV en los sistemas descritos aquí, el lector se dirige a trabajos anteriores ^17,50.

Se deben realizar varios controles, que se describen a continuación, para garantizar que los compuestos funcionen como se espera. Un compuesto sin miosina o kinesina debe aparecer esencialmente estático con fluctuaciones térmicas mínimas o deriva. Los filamentos de actina y los microtúbulos deben aparecer coentrelazados y distribuidos homogéneamente, con un agrupamiento, agregación o separación de fases mínimo de actina y microtúbulos a lo largo de un campo de visión de ~200 μm x 200 μm (Figura 2, extremo izquierdo)¹⁷. Se debe esperar un resultado similar para los compuestos que contienen miosina pero no están expuestos a la luz de 488 nm (para desactivar la blebbistatina).

Tras la incorporación de miosina y la exposición a luz de 488 nm, los compuestos sufren una contracción que es en gran parte isotrópica y similar para la actina y los microtúbulos, como se ve en las imágenes de microscopio tomadas antes y después de la actividad de la miosina (Figura 2), así como los campos de flujo PIV correspondientes para tiempos variables durante la actividad (Figura 3). Para determinar si el movimiento es balístico, difusivo, subdifusivo, etc., el tiempo de descorrelación característico τ(q) determinado a partir de DDM se evalúa en función del vector de onda (es decir, el espacio recíproco). Ver como se describe en detalle anteriormente 17,26,49. La Figura 4 también muestra cómo usar DDM para caracterizar estos compuestos. La escala de la ley de potencia τ(q)~1/vq β, con β = 1, indica movimiento balístico con velocidad v. Como referencia, β = 2 representa la dinámica difusiva siendo v el coeficiente de difusión. Todos los compuestos activos exhiben incrustaciones balísticas (Figura 4A) con velocidades que se ajustan por las concentraciones de actina y miosina (Figura 4B), y que pueden variar en el tiempo durante la actividad, ya sea acelerando o desacelerando (Figura 4C, D).

La reestructuración y agrupamiento de la red, visible en la Figura 2 y más evidente para concentraciones más altas de actina y miosina, se puede caracterizar utilizando SIA, como se muestra en la Figura 5, y se describe anteriormente 17,48,50. Brevemente, una longitud de correlación ξ, que es una medida del tamaño característico de las entidades en una imagen, se puede determinar ajustando cada curva de autocorrelación de intensidad espacial g (r) a una función exponencial de la distancia r entre píxeles. Los picos g(r) más grandes que persisten durante distancias más largas indican características estructurales más grandes (es decir, agrupación, agrupación de los filamentos individuales). Como se muestra en la Figura 5, para fracciones de actina y concentraciones de miosina más altas, la reestructuración y agregación significativas se reflejan en el aumento de ξ a lo largo del tiempo.

Las propiedades viscoelásticas y la respuesta mecánica no lineal de los compuestos activos también se pueden medir utilizando microrreología de pinzas ópticas (OTM). Sin embargo, los protocolos y los resultados representativos de estos experimentos están fuera del alcance de este trabajo. Los lectores interesados son referidos a trabajos anteriores^48,56 que describen a fondo cómo realizar mediciones OTM y los resultados esperados.

Utilizando el mismo programa de herramientas experimentales y de análisis descrito anteriormente, la siguiente sección describe cómo cambian la dinámica y la estructura cuando los motores de quinesina y los reticulantes de biotina-NA se incorporan a los compuestos (Figura 6, Figura 7 y Figura 8). La Figura 6 muestra imágenes confocales representativas de compuestos impulsados por quinesina sola (K) o quinesina y miosina (K + M), con y sin reticulación pasiva (XL) de filamentos de actina o microtúbulos.

La incorporación de kinesina en compuestos inicialmente da como resultado una dinámica y reestructuración similares a las de los compuestos impulsados por miosina, como se ve en la fila superior de la Figura 7 (Clase 1). Sin embargo, la dinámica típicamente pasa a flujo anisótropo a gran escala (Figura 7 fila central, Clase 2), aceleración y desaceleración (Figura 7 fila inferior, Clase 3). Estas características se combinan con la agrupación y agregación de mesoescala después de 5-30 min (Figura 6 y Figura 8B). Los campos de flujo generados por PIV y los mapas de color temporales que se muestran en la Figura 7 muestran ejemplos de reestructuración isotrópica (Clase 1, panel superior), flujo dirigido (Clase 2, paneles medios) y aceleración bidireccional (Clase 3, paneles inferiores).

Las velocidades de actina y microtúbulos en diferentes puntos de tiempo durante la actividad, determinadas mediante ajustes a curvas τ(q), ilustran la aceleración seguida de la desaceleración (Figura 8), que depende de la reticulación. Como también se muestra en la Figura 8, cuando se incorporan ambas proteínas motoras, la dinámica es en realidad más lenta que los compuestos de quinesina sola, y hay un inicio tardío del flujo de mesoescala. La miosina también apoya una interpenetración más homogénea de las redes de actina y microtúbulos a lo largo de la duración de la actividad, así como una menor agregación y reestructuración. Estos efectos se pueden ver en las imágenes de la Figura 6 y se cuantifican por las longitudes de correlación variables en el tiempo calculadas a través de SIA, que generalmente son más pequeñas en presencia de miosina (Figura 8B).

Figura 1. Diseño y caracterización de compuestos activos actina-microtúbulos con múltiples motores generadores de fuerza y reticulantes pasivos. (A) Los monómeros de actina y los dímeros de tubulina se copolimerizan a concentraciones molares c A y c T de 0.73-11.6 μM y fracciones molares de actina Φ A = c A / (c A + c _T) = 0, 0.25, 0.5, 0.75 y 1, para formar redes coentrelazadas de filamentos de actina (verde) y microtúbulos (rojo). La reticulación pasiva se logra utilizando NA para unir filamentos de actina biotinilados (Actina XL) o microtúbulos (MT XL) en relaciones molares reticulante:proteína de R _A = 0.01-0.08 y R_MT = 0.001-0.01 para actina y microtúbulos, respectivamente. Los minifilamentos de miosina II (púrpura) y los grupos de kinesina (naranja), en concentraciones de c M = 0.12 - 0.48 _μM y c_K = 0.2 - 0.7 μM, empujan y tiran de los filamentos para expulsar a los compuestos del estado estacionario. (B) Esquema del espacio de formulación. Los minifilamentos de miosina II (M), los grupos de quinesina (K) o ambos motores (K + M) se incorporan en compuestos sin reticulantes pasivos (No XL), enlaces cruzados actina-actina (Actin XL) y enlaces cruzados microtúbulos-microtúbulos (MT XL). No todas las caricaturas están dibujadas a escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Imágenes confocales de dos colores de compuestos de citoesqueleto impulsados por miosina con concentraciones variables de miosina c_M y fracciones molares de actina Φ_A. (A) Las imágenes de microscopía confocal de dos colores de 256 x 128 píxeles cuadrados (212 x 106 μm²) muestran cómo los compuestos de filamentos de actina (verde) y microtúbulos (rojo) se reorganizan a través de la actividad motora de la miosina. No hay motores de kinesina ni reticulantes pasivos. En cada panel, se muestran imágenes tomadas al principio (izquierda, antes) y al final (derecha, después) de la activación de miosina de 45 min (a través de iluminación con luz de 488 nm para desactivar la blebbistatina). Los paneles se ordenan aumentando la concentración molar de miosina (c_M), yendo de izquierda a derecha, y aumentando la fracción molar de actina (Φ_A), yendo de arriba a abajo. Los colores que delinean cada panel coinciden con el código de colores utilizado en la Figura 4 y la Figura 5. Las barras de escala son de 50 μM. Para capturar mejor la dinámica y la estructura para el análisis, utilizamos velocidades de fotogramas de 1-5 fps, ROI con lados de 50-250 μm y duraciones de series temporales de 5-45 min, dependiendo de la tasa de contracción y reorganización. Los paneles en los que las imágenes de antes y después se ven similares indican una reestructuración mínima, como se ve en los paneles rosa, magenta y cian. La agrupación a pequeña escala, evidenciada por el aumento de la heterogeneidad y la presencia de características punteadas brillantes, se puede ver en los paneles naranja, verde y rojo. La contracción a gran escala, vista como una red que se reduce uniformemente, es evidente en los paneles azules y púrpuras. Esta cifra ha sido modificada de la referencia¹⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. La velocimetría de imágenes de partículas (PIV) muestra que la actividad de la actomiosina desencadena una dinámica contráctil coordinada de actina y microtúbulos en compuestos coentrelazados. Campos de flujo PIV para actina (fila superior) y microtúbulos (fila inferior) en un compuesto impulsado por miosina con (Φ_A, c_M) = (0.5, 0.24) en tiempos crecientes durante una serie de tiempo de 6 minutos. Los campos de flujo se generaron utilizando el complemento PIV Fiji/ImageJ con un tiempo de retraso de 20 s y agrupación de 2 píxeles x 2 píxeles. Tanto la actina como los microtúbulos muestran un movimiento constante dirigido hacia la región central del campo de visión a lo largo de la duración de la película. Las barras de escala en todas las imágenes son de 50 μm. Los diferentes colores de flecha corresponden a diferentes velocidades como se indica en la escala de colores a la derecha de los campos vectoriales. Esta cifra ha sido modificada de la referencia²⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. La microscopía dinámica diferencial (DDM) resuelta en el tiempo mide la velocidad y el tipo de movimiento de la actina y los microtúbulos en compuestos activos. (A) La DDM se realiza en los canales de microtúbulos (símbolos superiores, abiertos) y actina (símbolos inferiores, llenos) de series temporales para determinar los tiempos de decaimiento característicos τ frente al número de onda q tanto para actina (símbolos llenos) como para microtúbulos (símbolos abiertos) como se describió anteriormente^17,26. Todas las curvas siguen τ ~ q-1 escala, lo que indica movimiento balístico, con velocidades v que se determinan mediante ajustes a τ (q) = (vq) ^-1. Las velocidades más rápidas corresponden a valores τ(q) más pequeños para cualquier q dado. Los colores y formas de los símbolos corresponden a las combinaciones (Φ A, c_M) que se muestran en B. (B) Las velocidades de contracción v se determinan mediante ajustes a las curvas τ(q) que se muestran en _A, que se promedian en todos los tiempos de retraso durante cada serie temporal de 45 minutos. (C) DDM de resolución temporal (trDDM) cuantifica cómo varía la dinámica con el tiempo evaluando τ (q) para actina (símbolos llenos, izquierda) y microtúbulos (símbolos abiertos, derecha) para intervalos consecutivos de 6 minutos (denotados por diferentes tonos del mismo color) durante el tiempo de activación de 45 minutos. trDDM se realiza para cada combinación (Φ_A, c_M) (denotada por diferentes símbolos y colores) como se describe en la leyenda en la parte inferior derecha. Las curvas τ(q) mostradas en C siguen escalas y tendencias similares a las de A, pero también muestran dependencia temporal para ciertas composiciones (Φ _A, c_M), especialmente para Φ_A= 0.75. (D) Las velocidades de contracción para filamentos de actina (símbolos cerrados) y microtúbulos (símbolos abiertos) se determinan a partir de ajustes a las curvas τ (q) correspondientes. Las barras de error en todos los gráficos representan el error estándar de los valores de tres a cinco réplicas. Esta cifra ha sido modificada de la referencia¹⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. El análisis de autocorrelación de imágenes espaciales (SIA) cuantifica la reestructuración motora de compuestos citoesqueléticos activos. (A) Autocorrelación g(r) para los microtúbulos al principio (izquierda, t = 0 min, tonos oscuros) y al final (derecha, t = 42 min, tonos claros) del experimento para las formulaciones (Φ_A, c_M) enumeradas en la leyenda. Recuadro: ejemplo de ajustes de datos a los tiempos inicial y final para (Φ_A, c_M) = (0.75, 0.12). (B) Longitudes de correlación promedio ξ para actina (símbolos cerrados) y microtúbulos (símbolos abiertos) para cada (Φ A, c_M) determinada a través de ajustes exponenciales de cada curva g (r), como se muestra en el recuadro en _A. Los datos se dividen en aquellos que exhiben una reestructuración mínima (izquierda) versus sustancial (derecha). Las barras de error en A y B representan el error estándar en tres a cinco réplicas. Esta cifra ha sido modificada de la referencia¹⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Incorporación de motores de kinesina y reticulantes pasivos en compuestos activos para aumentar la programabilidad y ampliar el espacio de fase de la dinámica y la estructura. (A) Las imágenes confocales de dos colores de actina (verde) y microtúbulos (rojo) en compuestos activos muestran una reestructuración compleja dependiente de la formulación a lo largo del tiempo (enumerada en min). Las cinco imágenes en cada fila corresponden a cinco fotogramas de una serie temporal de 2000 fotogramas adquirida para un compuesto impulsado por quinesina (K, filas 1, 3, 5) o quinesina y miosina (K+M, filas 2, 4, 6), e incluyendo reticulantes pasivos (No XL, filas 1, 2), enlaces cruzados actina-actina (Actina XL, filas 3, 4), o enlaces cruzados microtúbulos-microtúbulos (MT XL, filas 5 y 6). Las barras de escala son todas de 50 μm. Los colores del contorno coinciden con la combinación de colores de la figura 8. (B) Los canales separados de fluorescencia de actina y microtúbulos para los compuestos de solo quinesina muestran estructuras variadas con colocalización actina-MT y separación de microfases. Las imágenes mostradas son para compuestos con c A = 2.32 μM, c _T = 3.48 μM, c _K = 0.35 μM, c M = 0.47 _μM (filas 2, 4, 6), R _A = 0.02 (filas 3, 4) y R_MT = 0.005 (filas 5, 6). Todos los compuestos comienzan con redes interpenetrantes uniformemente distribuidas de actina y microtúbulos (columna 1). Los compuestos impulsados por kinesina sin reticulantes (fila 1) forman grupos amorfos vagamente conectados que son ricos en MT. La actina se co-localiza en los centros de estos agregados inicialmente, pero luego se exprime fuera de las regiones ricas en MT que continúan contrayéndose y desconectándose entre sí. La reticulación actina-actina (fila 3) dificulta esta separación actina-MT a microescala, y en su lugar los agregados ricos en MT están conectados a través de largas hebras de actina. La reticulación de actina también permite una absorción lenta de actina en las regiones ricas en MT, de modo que el compuesto se convierte en una red conectada de grupos de actina y MT colocalizados. La reticulación de microtúbulos (fila 5) conduce a una agrupación amorfa de MT que se fusionan con el tiempo, lo que resulta en una separación de fase a mayor escala de actina y MT. La adición de miosina (filas 2, 4, 6) reduce la desmezcla y reestructuración impulsada por la quinesina. Sin reticulantes (fila 2), los compuestos muestran poca reorganización a lo largo de las horas. La reticulación aumenta la reestructuración y la colocalización de actina y microtúbulos (filas 4, 6). Específicamente, cuando los microtúbulos están reticulados (fila 6), hay una interpenetración y reorganización significativas en redes de fibras similares a una red. Esta cifra ha sido modificada de la referencia⁵⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. PIV muestra que los compuestos activos exhiben tres clases de campos de flujo espaciotemporalmente distintos. (A) Campos de flujo PIV para el primer (t _i) y el último (t_f) fotogramas de tres series temporales representativas, mostrando las diferentes clases dinámicas que exhiben los compuestos mostrados en la Figura 6. Campos de flujo PIV para microtúbulos (arriba) y actina (abajo) para videos de ejemplo de clase 1 (superior, púrpura), clase 2 (medio, naranja) y clase 3 (abajo, magenta), con colores de flecha correspondientes a la escala de velocidad universal en la parte inferior, y el mapa de colores en escala de grises que muestra la distribución de velocidad espacial, normalizada por separado para cada campo de flujo de acuerdo con la escala que se muestra en la parte inferior. Las barras de escala son todas de 50 μM. (B) Distribuciones angulares de vectores de velocidad de A (en unidades de radianes) con desviaciones estándar iniciales y finales enumeradas σ _i y σ_f. (C) Los mapas temporales de color para los videos analizados en A y B muestran la posición fotograma a fotograma de cada píxel en relación con su punto de partida. Los mapas de clase 1 muestran movimiento aleatorio a pequeña escala; Los mapas de clase 2 representan un movimiento unidireccional rápido con una variación espacial o temporal mínima; Los mapas de clase 3 exhiben características de clase 1 y 2. Esta cifra ha sido modificada de la referencia⁵⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. DDM y SIA miden la dinámica variable en el tiempo y la estructura de los compuestos de actina-microtúbulos de dos motores. (A) Las velocidades para los compuestos descritos en la Figura 6 y la Figura 7, medidas mediante DDM, muestran la aceleración y desaceleración de los compuestos, programadas por reticulación y actividad de miosina. Las velocidades de los microtúbulos (MT, círculos cerrados) y actina (A, círculos abiertos) se representan en función del tiempo de actividad en compuestos sin reticulación (superior, azul), reticulación de actina (medio, verde), reticulación de microtúbulos (inferior, rojo), sin miosina (K, tonos más oscuros) y con miosina (K + M, tonos más claros). Para los casos de clase 3, que tienen dos velocidades, la velocidad más lenta se indica con una estrella. Los puntos de datos encerrados por círculos negros discontinuos corresponden a la velocidad máxima v_maxpara cada formulación. Las barras de error (la mayoría demasiado pequeñas para ver) son el error estándar sobre los ajustes de la ley de potencia de la τ (q) correspondiente. (B) Longitudes de correlación estructural ξ, determinadas mediante SIA, versus tiempo de actividad, para el mismo conjunto de series temporales evaluadas en A. Cada punto de datos es un promedio de las longitudes de correlación determinadas para el primer y último fotograma de la serie temporal correspondiente. En general, ξ aumenta en el tiempo tanto para la actina como para los microtúbulos en todos los sistemas compuestos, y los compuestos impulsados únicamente por quinesina tienen mayores longitudes de correlación que aquellos en los que la miosina también está presente. Los puntos de datos en A y B que corresponden a las tres series temporales analizadas en la Figura 7 están marcados en el color de clase correspondiente (1 = púrpura, 2 = naranja, 3 = magenta). Esta cifra ha sido modificada de la referencia⁵⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Un avance clave del sistema reconstituido descrito anteriormente es su modularidad y capacidad de ajuste, por lo que se alienta a los usuarios a modificar las concentraciones de proteínas, motores, reticulantes, etc. para adaptarse a los resultados deseados, ya sea para emular un proceso celular en particular o diseñar un material con funcionalidad específica o propiedades mecánicas. Las limitaciones en el rango de concentración de actina y tubulina se establecen en el límite inferior por la concentración crítica necesaria para polimerizar actina (~0.2 μM)^57,58,59 y tubulina (~3 - 4 μM)60, y en el límite superior por la transición a la alineación nemática de filamentos de actina (~90 μM)^61,62 o microtúbulos (~35 μM)⁶³ . Los monómeros de actina y los dímeros de tubulina deben polimerizarse en filamentos juntos, en lugar de mezclarse después de la polimerización, para garantizar que formen redes percoladas homogéneamente interpenetrantes que se apoyen sinérgicamente entre sí. La dinámica novedosa que exhiben los compuestos se basa en esta interacción. Si bien generalmente es importante seguir todos los pasos descritos en el protocolo para reproducir con éxito los resultados mostrados, algunos pasos son más exigentes, mientras que otros tienen espacio para modificar y ajustar para adaptarse a las necesidades específicas y los recursos disponibles.

Por ejemplo, un paso importante para garantizar resultados reproducibles es preparar y almacenar adecuadamente los reactivos siguiendo las pautas proporcionadas en la Tabla de materiales. Las proteínas citoesqueléticas (actina, tubulina, miosina, cinesina) son lábiles y deben ser alícuotas, congeladas rápidamente con nitrógeno líquido y almacenadas a -80 °C en alícuotas de un solo uso. Una vez retirados a -80 °C, las alícuotas deben conservarse en hielo. Las proteínas citoesqueléticas no conservan de manera confiable la función después de ciclos adicionales de congelación-descongelación.

Los microtúbulos son más sensibles a la despolimerización y desnaturalización que la actina. Una vez retirado de -80 °C, la tubulina debe mantenerse en hielo antes de la polimerización y utilizarse en un plazo de 12 h. Una vez polimerizados, los microtúbulos deben mantenerse a temperatura ambiente. También es fundamental estabilizar los microtúbulos con taxol para prevenir la despolimerización. La estabilización de la faloidina de los filamentos de actina también es importante para suprimir la cinta de correr de actina que consume ATP y que compite con la actividad de la miosina y la quinesina.

La ultracentrifugación de los motores de miosina es otro paso crítico, ya que elimina las cabezas muertas de miosina inactivas. No eliminar los monómeros enzimáticamente inactivos da como resultado la reticulación pasiva de la red de actina y la pérdida de actividad. Para prolongar la actividad ATPasa de los motores, se puede incorporar un sistema de regeneración de ATP como fosfato de creatina y creatina fosfoquinasa⁶⁴ .

Finalmente, mantener la actividad compuesta requiere inhibir la adsorción de filamentos y motores a las paredes de la cámara de muestra, lo que se puede lograr mediante la pasivación de los cubreobjetos y portaobjetos del microscopio. Las proteínas motoras son particularmente propensas a la adsorción, lo que hace que el compuesto sea arrastrado a la superficie de la cámara de muestra, se mueva fuera del campo de visión, colapse a 2D y ya no se someta a actividad. La silanización de los cubreobjetos y portaobjetos es una forma eficaz de pasivar las superficies y evitar la adsorción (ver paso 1). Un método alternativo de pasivación utilizado eficazmente en experimentos de citoesqueleto in vitro es recubrir la superficie con una bicapa lipídica, similar a la membrana celular¹⁸. Este método es ventajoso si se desea atar proteínas a la superficie o introducir otras interacciones específicas proteína-superficie, porque la bicapa puede ser funcionalizada. Para los experimentos de pinzas ópticas, la pasivación de las microesferas también es crítica, y se puede lograr recubriendo microesferas carboxiladas con BSA o PEG a través de la química del reticulante carbodiimida⁴⁸.

Hay algunos aspectos de los protocolos presentados que los investigadores pueden considerar alterar para satisfacer sus necesidades. En primer lugar, los investigadores pueden optar por reemplazar los reticulantes no nativos de biotina-NA con reticulantes biológicos, como la alfa-actinina o MAP65 que reticulan la actina y los microtúbulos, respectivamente 28,65,66. El uso de reticulantes no nativos en los compuestos descritos aquí está motivado por su reproducibilidad, estabilidad y sintonizabilidad mejoradas en comparación con los reticulantes nativos. Debido al fuerte enlace biotina-NA, se puede suponer que los reticulantes son permanentes, en lugar de la mayoría de los reticulantes nativos que se unen transitoriamente con tasas de rotación de amplio alcance. La dinámica de la reticulación transitoria complica el análisis de las contribuciones de los reticulantes y motores a la dinámica. Además, los enlazadores de biotina-NA se pueden usar de forma versátil para entrecruzar actina y microtúbulos, así como actina de reticulación a microtúbulos. De esta manera, se puede hacer una comparación inequívoca entre los motivos de reticulación, manteniendo todas las demás variables (por ejemplo, tamaño de reticulación, afinidad de enlace, estequiometría, etc.) fijas. Finalmente, los reactivos necesarios para incorporar enlazadores de biotina-NA están ampliamente disponibles comercialmente, bien caracterizados y comúnmente utilizados en muchos laboratorios de biofísica. Sin embargo, una de las fortalezas clave de la plataforma in vitro descrita aquí es su modularidad, por lo que los investigadores deberían poder reemplazar sin problemas los enlazadores de biotina-NA con vinculadores nativos si así lo desean.

En segundo lugar, en el protocolo actual, los monómeros de actina y los dímeros de tubulina se polimerizan en filamentos juntos en un tubo de centrífuga antes de agregarlos a la cámara de muestra. El flujo de la solución de proteínas filamentosas entrelazadas en la cámara de muestra puede causar la alineación del flujo, especialmente de los microtúbulos, lo que rompe la isotropía deseada y la homogeneidad de los compuestos. De hecho, un avance importante en el trabajo previo sobre compuestos de actina-microtúbulos en estado estacionario fue la capacidad de copolimerizar actina y microtúbulos in situ (en la cámara de muestra) para asegurar la formación de redes isotrópicas interpenetrantes de actina y microtúbulos^15,16,27. Sin embargo, extender este enfoque a los compuestos activos requeriría agregar los motores a la muestra antes de la polimerización de actina y tubulina y hacer que toda la muestra se incube a 37 ° C antes de los experimentos. Las pruebas de esta variación del protocolo han dado como resultado una polimerización de actina reducida y ninguna actividad motora discernible, probablemente debido a la actividad competidora de la ATPasa y la incubación prolongada de 37 ° C de los motores. Afortunadamente, no hay una alineación de flujo discernible de los compuestos cuando se siguen los protocolos actuales, como se puede ver en la Figura 2, Figura 3 y Figura 6. Sin embargo, se alienta a los investigadores a diseñar protocolos que permitan la formación in situ de compuestos activos.

Otro punto a considerar es el esquema de etiquetado de fluorescencia, que implica etiquetar escasamente todos los filamentos de actina y microtúbulos en la red. Este enfoque de etiquetado se optimizó para visualizar directamente la estructura de la red en lugar de inferir estructura y dinámica a través de filamentos trazadores o microesferas. Sin embargo, la desventaja es que los filamentos individuales no están brillantemente etiquetados y se pueden resolver. Un enfoque que los investigadores podrían adoptar tanto para resolver filamentos individuales como para visualizar la estructura de la red es doparse en filamentos preformados etiquetados con otro fluoróforo, de modo que tanto la red circundante como los filamentos individuales puedan visualizarse simultáneamente. Sin embargo, cuando se usan más de dos fluoróforos y canales de excitación / emisión, el sangrado entre canales a menudo es difícil de eliminar, por lo que se debe tener cuidado al elegir los fluoróforos, filtros e intensidades de láser.

Una limitación relacionada es la incapacidad de visualizar los motores de miosina o quinesina en los compuestos. Los monómeros de actina marcados con fluorescencia y los dímeros de tubulina utilizados están disponibles comercialmente, mientras que la visualización de miosina o quinesina en compuestos requiere un etiquetado interno. Se anima a los investigadores a dar el siguiente paso para etiquetar los motores, como se hizo anteriormente^18,67, para poder vincular inequívocamente la actividad motora y la unión a la dinámica y las estructuras que exhiben nuestros compuestos.

Finalmente, es importante tener en cuenta que, en el protocolo actual, el inicio y la duración de la actividad de la kinesina no están controlados. Debido a que la actividad de la miosina se controla mediante la fotodesactivación de la blebbistatina, como se describió anteriormente, para incorporar una activación similar de la kinesina, se puede incorporar ATP activado por la luz.

Para aumentar la complejidad de los diseños descritos aquí, para imitar mejor las condiciones celulares y ampliar el espacio de parámetros dinámico-estructura-función, el trabajo futuro se centrará en incorporar filamentos intermedios, como la vimentina^68,69, así como otros motores como la dineína^13,70. Gelsolin también se incorporará en diferentes concentraciones para controlar la longitud de actina¹⁴, así como la proteína tau para controlar la rigidez de los microtúbulos.

En resumen, los protocolos presentados describen cómo diseñar, crear y caracterizar la dinámica, estructura y mecánica de los sistemas de materia activa inspirados en citoesqueletos, que contienen dos componentes generadores de fuerza activa separados que actúan sobre diferentes sustratos en un solo sistema. Esta plataforma sintonizable y modular lleva los esfuerzos de reconstitución un paso más cerca de imitar el citoesqueleto celular y ofrece la capacidad única de programar sus propiedades en un amplio espacio de fase mediante la incorporación, eliminación y ajuste independientes de los diferentes componentes. Además, todos los componentes de este versátil sistema están disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales), excepto los dímeros de quinesina que se purifican en el Ross Lab, como se describió anteriormente⁵⁰, y están disponibles bajo pedido. Finalmente, todo el código de análisis está disponible gratuitamente a través de GitHub⁴⁹ y se basa en lenguajes de programación y software libres (Python y Fiji). Se espera que la difusión transparente de protocolos para diseñar estos sistemas haga que esta plataforma sea más accesible para un grupo diverso de usuarios con diferentes experiencias, antecedentes, afiliaciones institucionales y objetivos de investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(-)-Blebbistatin   Abreviatura utilizada en papel: blebbistatina	Sigma Aldrich	B0560	Concentración de stock: 200 μ M en DMSO Storage: desecado, en DMSO, -20º C Recetas de caldo y experimentos: disolver 1 mg de polvo a 200 μ M en DMSO Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: vida útil limitada, generalmente deja de funcionar de manera confiable después de 3-4 meses. Compre y prepare una nueva solución cada 3 meses.
1:20 488-tubulina:mezcla de tubulina   Abreviatura utilizada en papel: 5-488-tubulina	NA	NA	fuerte>Concentración de stock: 5 mg/ml en PEM Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> mezcle tubulina y 488-tubulina en una proporción de 20: 1, congelación instantánea con LN2 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas:< / fuerte> cada alícuota se puede usar hasta por 12 horas almacenado en hielo a 4º C, proteger de la luz
1:20 R-tubulina:mezcla de tubulina   Abreviatura utilizada en papel: 5-R-tubulina	NA	NA	fuerte>Concentración de existencias: 5 mg/ml en PEM Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> mezcle tubulina y rodamina tubulina en una proporción de 20: 1, congelación instantánea con LN2 < BR / > < fuerte> Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: < / fuerte> cada alícuota se puede usar hasta por 12 horas almacenado en hielo a 4º C, proteger de la
luz actina (biotina): músculo esquelético   Abreviatura utilizada en papel: biotina-actina	Citoesqueleto	AB07	Concentración de existencias: 1 mg/ml en tampón G Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> reconstituya a 1 mg / ml en tampón G, congelación instantánea con LN2 < BR / > < fuerte> Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: < / fuerte> (1) inmediatamente antes de usar diluir a 0,5 mg / ml en PEM, (2) una vez retirado de -80º C, tienda  alícuota en el hielo a 4º C hasta por 1 semana
actina (rodamina): músculo esquelético de conejo   Abreviatura utilizada en papel: Citoesqueleto de R-actina		AR05	Concentración de stock: 1,5 mg/ml en tampón G Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> reconstituya a 1.5 mg / ml en tampón G, congelación instantánea con LN2 Almacenamiento, manejo, solución de problemas Notas:< / fuerte> una vez eliminado de -80º C, tienda  alícuota en el hielo a 4º C, se puede utilizar hasta por 1 semana
trifosfato de adenosina   Abreviatura utilizada en el papel: ATP	Thermo Fisher Scientific	A1048	Concentración de stock: 100 mM Almacenamiento: en solución (pH 7), -20º C Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> reconstituir en DI H2< / sub>0, llevar el pH a 7 con NaOH Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas:< / fuerte> verifique rutinariamente el pH y ajuste según sea necesario, hidroliza con el tiempo, reemplace cada ~ 6-12 meses
AlexaFluor488 Phalloidin   Abreviatura utilizada en el papel: 488-faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379	Concentración de stock: 100 μ M DMSO Almacenamiento: protegido de la luz, desecado, -20º C Recetas de caldo y experimento: reconstituir a 100 μ M con DMSO Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: inmediatamente antes de usar diluir a 20 μ M en PEM (1 μ L en 4 μ L PEM)
AlexaFluor488– Etiquetado Actina   Abreviatura utilizada en papel: 488-actina	Thermo Fisher Scientific	A12373	Concentración de existencias: 1,5 mg/ml en tampón G Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos: reconstituir a 1,5 mg/ml en tampón G, congelación instantánea con LN2 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: este artículo ha sido descontinuado
Limpiador de plasma básico   Abreviatura utilizada en papel: limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Bemis  Película de envoltura de laboratorio Parafilm M   Abreviatura utilizada en papel: película transparente	Thermo Fisher Scientific	13-374-5
D-(+)-Glucosa   Abreviatura utilizada en el papel:	Thermo Fisher Scientific	A1682836	Concentración de existencias: 100x Almacenamiento: almacene a concentración de existencias (100x) o concentración 10x, desecado, a -20º C Stock y recetas de experimentos: reconstituir el polvo a 4,5 mg/ml en DI H20 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: concentración final en solución debe 45 μ g/mL
D-Biotina   Abreviatura utilizada en el papel: biotina	Fisher Scientific	BP232-1	Concentración de stock: 1,02 mM en PEM Almacenamiento: desecado, 4º C
Agua nanopura desionizada   Abreviatura utilizada en papel: DI
Dimetildiclorosilano   Abreviatura utilizada en papel: silano	Thermo Fisher Scientific	D/3820/PB05	Concentración de stock: 2% disuelto en toulene
Dithiothreitol   Abreviatura utilizada en el papel: DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861	Concentración de stock: 1 M en DMSO Almacenamiento: desecado, -20º C Stock y Recetas de Experimento: diluir a 2 mM en PEM inmediatamente antes de cada experimento
DMSO Anhidro   Abreviatura utilizada en el papel: DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345
F-Buffer   Abreviatura utilizada en el papel: Tampón F	NA	NA	fuerte>Concentración de existencias: 10x Almacenamiento: desecado, -20º C Recetas de caldo y experimento: 10 mM de Imidazol (pH 7,0), 50 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, 0,2 mM de ATP
G-Buffer   Abreviatura utilizada en papel: Tampón G	NA	NA	fuerte>Concentración de existencias: 10x Almacenamiento: desecado, -20º C Stock y recetas de experimento: 2,0 mM Tris (pH 8), 0,2 mM ATP, 0,5 mM DTT, 0,1 mM CaCl2. Almacene a -20 ° C.
portaobjetos para microscopio de vidrio   Abreviatura utilizada en el papel: portaobjetos	Thermo Fisher Scientific	22-310397
Glucosa oxidasa + catalasa + β-mercaptoetanol   Abreviatura utilizada en el papel: GOC	Sigma Aldrich	G2133-250KU, C1345, 63689	Concentración de existencias: 100x Almacenamiento: almacene a concentración de existencias (100x) o concentración 10x, desecado, a -20º C Recetas de caldo y experimentos: Para 100x: 4,3 mg/ml de glucosa oxidasa, 0,7 mg/ml catalasa, 0,5% v/v  β-mercaptoetanol en DI H20 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: concentración final en solución debe ser: 0.005% β-mercaptoetanol, 43 μ g/mL de glucosa oxidasa, 7 μ g/mL
sistema de eliminación de oxígeno catalasa glu-GOC   Abreviatura utilizada en papel: glu-GOC	NA	NA	fuerte>Concentración de existencias: 100x Almacenamiento: preparar fresco cada vez Recetas de caldo y experimento: mezcle partes iguales de Glu y GOC y agregue a 1/100 del volumen de muestra final inmediatamente antes de la imagen Almacenamiento, Manejo, solución de problemas Notas:< / fuerte> prepare de Glu y GOC inmediatamente antes de obtener imágenes de
trifosfato de guanosina   Abreviatura utilizada en el papel: GTP	Thermo Fisher Scientific	R0461	Concentración de stock: 100 mM Almacenamiento: 100 μ L alícuotas en -20º C
Instant Mix 1 minuto epoxi   Abreviatura utilizada en papel: epoxi	Loctite	1366072
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS   Abreviatura utilizada en el papel: kinesina	Preparado en el Laboratorio JL Ross de la Universidad de Syracuse	NA	fuerte>Concentración de stock: 8.87 μ M en PEM Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas:< / fuerte> los dímeros biotinilados forman grupos de kinesina, cada alícuota se puede usar hasta por 12 horas almacenado en hielo a 4º C
NeutrAvidin   Abreviatura utilizada en papel: NA	Thermo Fisher Scientific	31000	Concentración de stock: 5 mg/ml en PEM Almacenamiento: desecado, -20º C Recetas de caldo y experimentos: reconstituir el polvo a 5 mg/ml en PEM
Nº 1. cubreobjetos de vidrio (24 mm x 24 mm)   Abreviatura utilizada en el papel: cubreobjetos	Thermo Fisher Scientific	12-548-CP
Paclitaxel    Abreviatura utilizada en el papel: Taxol	Thermo Fisher Scientific	P3456	Concentración de stock: 2 mM en DMSO Almacenamiento: protegido de la luz, desecado, -20º C Recetas de caldo y experimento: reconstituir a 2 mM con DMSO Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: inmediatamente antes de usar diluir a 200 μ M en DMSO (0.4 μ L en 3.6 μ L DMSO)
PEM-100   Abreviatura utilizada en papel: PEM	NA	NA	fuerte>Concentración de existencias: 1x Almacenamiento: temperatura ambiente (RT) Recetas de caldo y experimentos: 100 mM K-PIPES (pH 6,8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: use KOH para ajustar el pH a 6.8, vuelva a verificar el pH con frecuencia y ajuste en consecuencia
phalloidin Abreviatura utilizada en papel:< / fuerte> faloidina	Thermo Fisher Scientific	P3457	Concentración de stock: 100 μ M en DMSO Almacenamiento: protegido de la luz, desecado, -20º C, se adhiere estrechamente a las condiciones de almacenamiento / manipulación Recetas de caldo y experimento: < / fuerte> reconstituir a 100 μ M con DMSO Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: susceptible a impurezas en su preparación y desnaturalización, identificable como grandes agregados amorfos de actina en muestras
tubulina cerebral porcina   Abreviatura utilizada en papel: tubulina	Citoesqueleto	T240	Concentración de stock: 5 mg/ml en PEM Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> reconstituya el polvo a 5 mg / ml en PEM, congelación instantánea con LN2 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: < / fuerte> cada alícuota se puede usar hasta por 12 horas almacenado en hielo a 4º C
Cloruro de potasio   Abreviatura utilizada en el papel: KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	Concentración de stock: 4 M Almacenamiento: RT
Rabbit skeletal actin   Abreviatura utilizada en papel: actina	Citoesqueleto	AKL99	Concentración de stock: 2 mg/ml en tampón G Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> reconstituya a 2 mg / ml en tampón G, congelación instantánea con LN2 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas:< / fuerte> una vez retirado de -80º C, tienda  alícuota en el hielo a 4º C, se puede utilizar hasta 1 semana
Miosina esquelética de conejo II   Abreviatura utilizada en papel: miosina	Citoesqueleto	MY02	Concentración de stock: 10 mg/ml en PEM Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> reconstituya el polvo a 10 mg / ml en PEM, congelación instantánea con LN2 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas:< / fuerte> los monómeros forman minifilamentos a bajo KCl, cada alícuota se puede usar hasta por 12 horas almacenado en hielo a 4º C
Tubulina (biotina): cerebro porcino   Abreviatura utilizada en papel: biotina-tubulina	Citoesqueleto	T333P	Concentración de stock: 5 mg/ml en PEM Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación y descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> reconstituya el polvo a 5 mg / ml en PEM, congelación instantánea con LN2 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: < / fuerte> inmediatamente antes de usar diluir a 0.5 mg / ml en
PEM Tubulina (fluorescente HiLyte 488): cerebro porcino   Abreviatura utilizada en papel: 488-tubulina	Citoesqueleto	TL488M	Concentración de stock: 5 mg/ml en PEM Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> reconstituya el polvo a 5 mg / ml en PEM, congelación instantánea con LN2 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: < / fuerte> cada alícuota se puede usar hasta por 12 horas almacenado en hielo a 4º C, proteger de la
tubulina ligera (rodamina): cerebro porcino   Abreviatura utilizada en papel: Citoesqueleto de R-tubulina		TL590M	Concentración de stock: 5 mg/ml en PEM Almacenamiento: alícuotas de un solo uso, -80º C, evite los ciclos de congelación-descongelación Stock y recetas de experimentos:< / fuerte> reconstituya el polvo a 5 mg / ml en PEM, congelación instantánea con LN2 Almacenamiento, manipulación, solución de problemas Notas: < / fuerte> cada alícuota se puede usar hasta por 12 horas almacenado en hielo a 4º C, proteger de la luz
Tween 20   Abreviatura utilizada en el papel: Tween20	Thermo Fisher Scientific	J20605. AP	fuerte>Concentración de existencias: 1% v/v en DI H20 Almacenamiento: Microtubos
grado ultracentrífugo RT   Abreviatura utilizada en el papel: Beckman-Coulter Optima Max XP	Beckman Coultier	343776	Almacenamiento, Manejo, Solución de problemas Notas: 8x34 mm PC
Pegamento de curado con luz UV   Abreviatura utilizada en papel: pegamento UV	Pharda	SKG-2869