Aquí se presenta un protocolo para la preparación y calibración tampón de extractos celulares de cepas knockout de exonucleasa V de Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD y ΔrecB). Este es un enfoque rápido, fácil y directo para la expresión en sistemas de síntesis de proteínas libres de células utilizando plantillas de ADN lineal.
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Artículo de método
Síntesis de proteínas libres de células a partir de extractos celulares deficientes en exonucleasa utilizando plantillas de ADN lineal
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En este artículo
Resumen
Resumen
La síntesis de proteínas libres de células (CFPS) se ha vuelto recientemente muy popular en el campo de la biología sintética debido a sus numerosas ventajas. El uso de plantillas de ADN lineal para CFPS permitirá que la tecnología alcance su máximo potencial, disminuyendo el tiempo experimental al eliminar los pasos de clonación, transformación y extracción de plásmidos. El ADN lineal puede ser rápida y fácilmente amplificado por PCR para obtener altas concentraciones de la plantilla, evitando la posible toxicidad de la expresión in vivo. Sin embargo, los moldes lineales de ADN son degradados rápidamente por exonucleasas que están naturalmente presentes en los extractos celulares. Hay varias estrategias que se han propuesto para abordar este problema, como la adición de inhibidores de nucleasa o la modificación química de los extremos lineales del ADN para la protección. Todas estas estrategias cuestan tiempo y recursos adicionales y aún no han obtenido niveles cercanos al plásmido de expresión de proteínas. Aquí se presenta un protocolo detallado para una estrategia alternativa para usar plantillas de ADN lineal para CFPS. Mediante el uso de extractos celulares de células knockout deficientes en exonucleasa, las plantillas de ADN lineal permanecen intactas sin requerir ninguna modificación final. Presentamos los pasos de preparación del lisado celular de la cepa Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lisis de sonicación y calibración de tampón para Mg-glutamato (Mg-glu) y K-glutamato (K-glu) específicamente para ADN lineal. Este método es capaz de alcanzar niveles de expresión de proteínas comparables a los del ADN plásmido en CFPS de E. coli.
Introducción
Los sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) se utilizan cada vez más como un método rápido, simple y eficiente para la ingeniería de biosensores, la fabricación descentralizada y la creación de prototipos de circuitos genéticos1. Debido a su gran potencial, los sistemas CFPS se utilizan regularmente en el campo de la biología sintética. Sin embargo, hasta ahora los sistemas CFPS dependen de plásmidos circulares que pueden limitar la tecnología de alcanzar su máximo potencial. La preparación del ADN plásmido depende de muchos pasos que consumen mucho tiempo durante la clonación y de grandes cantidades de aislamiento de ADN. Po....
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Protocolo
1. Preparación de medios y búferes
- Preparación de medio 2xYT+P (sólido y líquido)
- Prepare medios líquidos y sólidos como se describe en la Tabla 1, y luego esterilice en autoclave.
NOTA: Este protocolo requiere una placa de agar 2xYT+P que contenga cloranfenicol (10 μg/ml). El volumen de medios líquidos es proporcional al volumen del lisado requerido. Aquí, se utiliza un volumen inicial de 5 L de medios líquidos 2xYT+P. Sin embargo, el volumen se puede ajustar según sea necesario, sabiendo que 1 L del cultivo celular da como resultado 2 a 3 ml del lisado celular final.
- Prepare medios líquidos y sólidos como se describe en la Tabla 1, y luego esterilice en autoclave.
- Preparación de cloranfen....
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Resultados
Aquí se muestran resultados representativos después de la calibración del lisado para los niveles óptimos de Mg-glutamato y K-glutamato por separado para el ADN lineal y plásmido (Figura 1). La concentración óptima de Mg-glutamato es similar en los extractos de Δ recB y ΔrecBCD a 8 mM (Figura 1B). Sin embargo, la concentración óptima de K-glutamato para el ADN plásmido es de 140 mM, mientras que la concentración óptima de K-glutamato para el AD.......
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Discusión
Aquí, mostramos que el lisado celular preparado a partir de E. coli BL21 Rosetta2 con un knockout genómico para el operón recB o recBCD admite una alta expresión de proteínas a partir de plantillas de ADN lineal. Este protocolo elabora un procedimiento de calibración de lisado paso a paso específico para plantillas de ADN lineal (Figura 2), que es un paso crítico que conduce a la alta expresión de promotores σ70 en ADN lineal, alcanzando niveles cercanos al plásmid.......
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Agradecimientos
ACB y JLF reconocen el apoyo financiero de la subvención ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF y JB reconocen el apoyo financiero de la subvención ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA y JLF reconocen el apoyo financiero de la subvención ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB agradece el apoyo del ERC que comienza "COMPUCELL" (número de subvención 657579). El Centre de Biochimie Structurale agradece el apoyo de la Infraestructura Francesa de Biología Estructural Integrada (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK agradece el apoyo financiero del departamento MICA de INRAe, la Université Paris-Saclay, DIM-RFSI de la región de Ile-de-France (IdF) y ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Este tra....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caldo de 2 YT | Invitrogen | 22712020 | |
| 1,5 mL Tubos Safe-Lock | 30120086 | Eppendorf | de 1,5 mL |
| Microplaca de fondo cuadrado de 384 pocillos | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (Ácido D-(-)-3-fosfoglicérico disódico) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| junta de placa adhesiva | Thermo Scientific Nunc | ||
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosina 5'-trifosfato, sal disódica, hidrato) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck, Millipore | 71402 | |
| BL21, Rosetta2 y Delta; recB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 y Delta; recBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosina 3' 5'-monofosfato cíclico) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Cloranfenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (hidrato de coenzima A) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning Tubos de centrífuga PP de 15 mL, bastidor empaquetado con tapa CentriStar, tubo estéril | Corning | 430790 | 15 mL |
| Tubos de centrífuga Corning PP de 50 mL, fondo cónico con tapa CentriStar, tubo estéril | Corning | 430828 | 50 mL |
| CTP (citidina 5'-trifosfato, sal disódica hidrato) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Ditiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ácido folínico (sal cálcica sólida de ácido folínico) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosina 5?-Trifosfato, Sal disódica) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K fosfato dibásico (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K fosfato monobásico (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamato | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamato | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Unidad de filtro de jeringa, 0.22 y micro; m, polietersulfona | Merck Millipore | SLGP033RB | filtro de membrana 0,22 y micro; m |
| Monarch PCR & Kit de limpieza de ADN | NEB | T1030S | PCR & Kit de limpieza de ADN |
| Kit de minipreparación de plásmido monarca | NEB | T1010S | Kit de minipreparación de plásmidos |
| NAD (hidrato de dinucleótido de adenina y b-nicotinamida) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| Estándar FITC trazable al NIST | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Kit de Maxiprep de plásmido |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| lector de placas | Biotek | Synergy HTX | |
| Chromotek de proteína EGFP recombinante purificada | egfp-250 | eGFP recombinante | |
| Q5 de alta fidelidad 2X Master Mix | NEB | M0492S | ADN polimerasa |
| Q5 de alta fidelidad 2X Master Mix New | England Biolabs | M0492L | polimerasa |
| Qubit dsDNA BR Kit de ensayo | Thermo | Q32850 | con colorante de unión al ADN |
| RTS Muestreador de aminoácidos | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Espermidina | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Agua | Agua purificada del sistema Millipore RiOs 8, esterilizada en autoclave. | ||
| Tris base | productos de Ciencias de la Vida Cytiva | 17-1321-01 | |
| ARNt | Roche | 10109550001 | |
| Procesador ultrasónico Célula de vibración VC-505 | SONICS | VC505 | sonicador |
| UTP Na3 (Uridina 5'- trifosfato, hidrato de sal trisódica) | Acros Organics | ||
| Agua, sin nucleasas | Thermo | R0581 | Agua sin nucleasas |
Referencias
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expressi....
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Reimpresiones y permisos
