Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Satyaghosh Maurya; Vishwesh Haricharan Rai; Aditya Upasani; Saurabh Umrao; Diksha Parwana; Rahul Roy

doi:10.3791/64243

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Artículo de método

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

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DOI:

10.3791/64243

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19 de julio de 2022

Satyaghosh Maurya¹ , Vishwesh Haricharan Rai¹ , Aditya Upasani¹ , Saurabh Umrao¹^,² , Diksha Parwana¹ , Rahul Roy¹^,³

¹Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, ²Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, ³Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

En este artículo

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Resumen

Las membranas celulares son ambientes muy concurridos para las reacciones biomoleculares y la señalización. Sin embargo, la mayoría de los experimentos in vitro que investigan la interacción de proteínas con lípidos emplean membranas bicapa desnudas. Tales sistemas carecen de las complejidades del hacinamiento por proteínas y glicanos incrustados en la membrana y excluyen los efectos de volumen asociados encontrados en las superficies de la membrana celular. Además, la superficie de vidrio cargada negativamente sobre la que se forman las bicapas lipídicas impide la libre difusión de las biomoléculas transmembrana. Aquí, presentamos una membrana polimérico-lípida bien caracterizada como un imitador de membranas lipídicas abarrotadas. Este protocolo utiliza lípidos conjugados con polietilenglicol (PEG) como un enfoque generalizado para incorporar crowders en la bicapa lipídica soportada (SLB). En primer lugar, se presenta un procedimiento de limpieza de los portaobjetos microscópicos y cubreobjetos para realizar experimentos de una sola molécula. A continuación, se discuten los métodos para caracterizar los PEG-SLB y realizar experimentos de una sola molécula de unión, difusión y ensamblaje de biomoléculas utilizando el seguimiento de una sola molécula y el fotoblanqueo. Finalmente, este protocolo demuestra cómo monitorear el ensamblaje de nanoporos de la toxina formadora de poros bacteriana citolisina A (ClyA) en membranas lipídicas abarrotadas con análisis de fotoblanqueo de una sola molécula. También se incluyen códigos de MATLAB con datasets de ejemplo para realizar algunos de los análisis comunes, como el seguimiento de partículas, la extracción de comportamiento difusivo y el recuento de subunidades.

Introducción

Las membranas celulares son sistemas muy concurridos y complejos¹. El hacinamiento molecular puede tener un impacto considerable en la difusión de entidades unidas a la membrana como proteínas y lípidos ^2,3,4. Del mismo modo, las reacciones bimoleculares en las membranas lipídicas como la dimerización del receptor o la oligomerización de los complejos de membrana están influenciadas por el hacinamiento ^5,6,7. La naturaleza, configuración y concentración de los....