Method Article

Visualización de la dinámica conformacional de los receptores de membrana utilizando FRET de molécula única

DOI:

10.3791/64254

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August 17th, 2022

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1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta un procedimiento detallado para realizar experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) en receptores acoplados a proteínas G (GPCR) utilizando el etiquetado específico del sitio a través de la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA). El protocolo proporciona una guía paso a paso para la preparación de muestras smFRET, experimentos y análisis de datos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacidad de las células para responder a las señales externas es esencial para el desarrollo, crecimiento y supervivencia celular. Para responder a una señal del entorno, una célula debe ser capaz de reconocerla y procesarla. Esta tarea se basa principalmente en la función de los receptores de membrana, cuya función es convertir las señales en el lenguaje bioquímico de la célula. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la familia más grande de proteínas receptoras de membrana en humanos. Entre los GPCR, los receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) son una subclase única que funcionan como dímeros obligados y poseen un gran dominio extracelular que contiene el sitio de unión al ligando. Los avances recientes en los estudios estructurales de mGluRs han mejorado la comprensión de su proceso de activación. Sin embargo, la propagación de cambios conformacionales a gran escala a través de mGluRs durante la activación y modulación es poco conocida. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de una sola molécula (smFRET) es una técnica poderosa para visualizar y cuantificar la dinámica estructural de las biomoléculas a nivel de una sola proteína. Para visualizar el proceso dinámico de activación de mGluR2, se desarrollaron sensores conformacionales fluorescentes basados en la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA) que permitieron el etiquetado de proteínas específicas del sitio sin perturbar la estructura nativa de los receptores. El protocolo descrito aquí explica cómo realizar estos experimentos, incluido el novedoso enfoque de etiquetado UAA, la preparación de muestras y la adquisición y análisis de datos smFRET. Estas estrategias son generalizables y pueden extenderse para investigar la dinámica conformacional de una variedad de proteínas de membrana.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transferencia de información a través de la membrana plasmática depende en gran medida de la función de los receptores de membrana1. La unión del ligando a un receptor conduce a un cambio conformacional y a la activación del receptor. Este proceso es a menudo alostérico en la naturaleza2. Con más de 800 miembros, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son la familia más grande de receptores de membrana en humanos3. Debido a su papel en casi todos los procesos celulares, los GPCR se han convertido en objetivos importantes para el desarrollo terapéutico. En el modelo canónico de señalización GPCR, la activación de agonistas da lugar a cambios conformacionales del receptor que posteriormente activan el complejo heterotrimérico de proteína G a través del intercambio de GDP por GTP en el bolsillo de unión a nucleótidos de Gα. Las subunidades G α-GTP y Gβγ activadas controlan entonces la actividad de las proteínas efectoras aguas abajo y propagan la cascada de señalización 4,5. Este proceso de señalización depende esencialmente de la capacidad de los ligandos para cambiar la forma tridimensional del receptor. Una comprensión mecanicista de cómo los ligandos logran esto es fundamental para desarrollar nuevas terapias y diseñar receptores y sensores sintéticos.

Los receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) son miembros de la familia GPCR de clase C y son importantes para los efectos neuromoduladores lentos del glutamato y la sintonización de la excitabilidad neuronal 6,7. Entre todos los GPCR, los GPCR de clase C son estructuralmente únicos en el sentido de que funcionan como dímeros obligados. mGluRs contiene tres dominios estructurales: el dominio Venus atrapamoscas (VFT), el dominio rico en cisteína (CRD) y el dominio transmembrana (TMD)8. Los cambios conformacionales durante el proceso de activación son complejos e implican acoplamiento conformacional local y global que se propaga a una distancia de 12 nm, así como cooperatividad de dímeros. Se desconocen las conformaciones intermedias, el orden temporal de los estados y la tasa de transición entre estados. Al seguir la conformación de receptores individuales en tiempo real, es posible identificar los estados intermedios transitorios y la secuencia de cambios conformacionales durante la activación. Esto se puede lograr aplicando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia 9,10 (smFRET), como se aplicó recientemente para visualizar la propagación de cambios conformacionales durante la activación de mGluR2 11. Un paso clave en los experimentos FRET es la generación de sensores FRET mediante la inserción específica del sitio de los fluoróforos donantes y aceptores en la proteína de interés. Se adoptó una estrategia de incorporación de aminoácidos no naturales (UAA)12,13,14,15 para superar las limitaciones de las tecnologías típicas de etiquetado fluorescente específicas del sitio que requieren la creación de mutantes sin cisteína o la inserción de una gran etiqueta codificada genéticamente. Esto permitió observar el reordenamiento conformacional del enlazador alostérico compacto esencial, que se unió a los dominios de unión al ligando y señalización de mGluR2. En este protocolo, se presenta una guía paso a paso para realizar experimentos smFRET en mGluR2, incluido el enfoque para el etiquetado específico del sitio de mGluR2 con UAA para unir fluoróforos utilizando la reacción de ciclación de azida catalizada por cobre. Además, este protocolo describe la metodología para la captura directa de proteínas de membrana y el análisis de datos. El protocolo descrito aquí también es aplicable al estudio de la dinámica conformacional de otras proteínas de membrana.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El flujo de trabajo general del protocolo se describe en la figura 1.

1. Preparación de la cámara de muestras

  1. Limpieza de deslizamientos y cubreobjetos
    NOTA: Estos pasos tienen como objetivo limpiar las superficies de los portaobjetos, así como los cubreobjetos y prepararlos para la aminosilanización. Un requisito crítico para realizar experimentos de fluorescencia de una sola molécula en moléculas atadas a la superficie es una superficie pasivada. La técnica de pasivación más confiable y reproducible consiste en unir covalentemente cadenas de polímero inerte a la superficie del vidrio como una capa densa. El polietilenglicol (PEG) es el polímero más eficiente utilizado para la pasivación superficial16. Los detalles del procedimiento de pasivación utilizando PEG (PEGylation) se describen a continuación:
    1. Marque los orificios que se perforarán en las guías con un marcador (~6 mm de separación y lejos del borde). Use un Dremel para perforar agujeros pequeños (1 mm de diámetro) en el portaobjetos de vidrio. Sumerja los toboganes en agua durante el proceso de perforación.
    2. Lave las diapositivas con acetona para eliminar la tinta residual del marcador.
    3. Retire de la acetona y enjuague los portaobjetos con agua, luego microondas durante 5 minutos en agua a alta potencia (700 W).
    4. Limpie los portaobjetos con agua antes de colocarlos en un frasco de vidrio para que se sonicen. Coloque los cubreobjetos en un frasco de tinción diferente.
    5. Sonicar los portaobjetos y cubreobjetos en acetona durante 30 minutos en un sonicador de baño a 23 °C.
    6. Mientras tanto, limpie un matraz de vidrio para preparar la solución de aminosilanización utilizada durante el siguiente paso. Llenar el matraz con 1 M KOH, sonicar el matraz durante 30 minutos, enjuagar bien el KOH con agua y, a continuación, sonicar durante 30 minutos adicionales en metanol. Dejar el matraz en metanol hasta el momento de la etapa de aminosilanización.
    7. Mientras tanto, retire el aminosilano, el mPEG y la biotina-PEG del congelador (-20 °C) y deje que alcancen la temperatura ambiente (RT) en la oscuridad.
    8. Deseche la acetona de los frascos de portaobjetos y cubreobjetos en el recipiente apropiado para desechos químicos, enjuague bien con agua y luego sanice los portaobjetos en 5 M KOH durante 30 minutos.
    9. Enjuague los portaobjetos y cubreobjetos con agua, y luego sonicar en metanol durante 2 minutos (repetir dos veces). Deje los frascos llenos de metanol hasta la etapa de aminosilanización.
      NOTA: En este estudio, se utiliza agua desionizada a menos que se mencione lo contrario. Se utiliza un sonicador de baño que funciona a 23 °C.
  2. Aminosilanización
    NOTA: Este paso tiene como objetivo vincular covalentemente el aminosilano a la superficie limpia del portaobjetos y el cubreobjetos. La mPEG funcionalizada y la biotina-PEG se unirán covalentemente a esta superficie en el siguiente paso.
    1. Preparar una mezcla de aminosilanización en un matraz limpio (paso 1.6). Prepare la solución mezclando metanol (150 ml), ácido acético (7,5 ml, use pipeta de vidrio) y aminosilano (2,5 ml).
    2. Mezcle la solución suavemente en la campana extractora de humos químicos, luego viértala en los frascos de portaobjetos y cubreobjetos. Use 50 ml para los cubreobjetos y 100 ml para los portaobjetos. Asegúrese de que las guías y los cubreobjetos estén completamente inmersos en la solución.
    3. Incubar durante 10 minutos, luego sonicar los frascos durante 1 minuto (la sonicación elimina las impurezas de la superficie) e incubar durante otros 10 minutos.
    4. Deseche la solución de aminosilanización en el contenedor de recolección de residuos. Agregue metanol a los frascos, cierre los frascos con tapas y agite suavemente con la mano. Deseche el metanol y llene los frascos con agua.
    5. Devolver el frasco de aminosilano al congelador (-20 °C).
  3. PEGilación
    NOTA: Estos pasos describen el procedimiento de PEGilación.
    1. Durante la aminosilanización, prepare el tampón de pegilación. Pesar 84 mg de bicarbonato de sodio (NaHCO3) y añadirlo a 10 ml de agua (10 mM). Además, pese mPEG y biotina-PEG y déjelos a un lado. Para seis portaobjetos y cubreobjetos, use 96 mg de mPEG y 1.2-2.4 mg de biotina-PEG.
      NOTA: Es importante no agregar demasiada biotina-PEG, ya que puede aumentar el número de puntos de fondo. No disuelva la mezcla de PEG hasta justo antes de la aplicación en portaobjetos.
    2. Enjuague los portaobjetos con agua, séquelos con un suave soplo de aire y luego colóquelos en las cajas de ensamblaje humidificadas.
      NOTA: Es esencial utilizar una aerolínea limpia. Evite el uso de aire comprimido enlatado, que puede dejar residuos en el vidrio.
    3. Agregue tampón de pegilación a la mezcla de polvo de PEG y pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente varias veces para disolver. Agregue 55 μL de tampón de pegilación por portaobjetos (para seis portaobjetos, agregue 330 μL de tampón de pegilación).
    4. Centrifugar a 9.600 x g durante 1 min a 23 °C para precipitar partículas no disueltas. Recoja el sobrenadante para usarlo en el siguiente paso.
      NOTA: La biotina-PEG se hidroliza rápidamente debido a la presencia del grupo NHS. Es importante realizar los pasos de mezcla y centrifugación rápidamente.
    5. Aplique 60 μL de solución de PEGilación a cada portaobjetos y luego coloque el cubreobjetos en la parte superior de modo que la solución de PEGilación quede intercalada entre el portaobjetos y el cubreobjetos.
      NOTA: Evite introducir burbujas entre la corredera y el cubreobjetos, ya que esto reducirá la eficiencia de pasivación. Elimine las burbujas ajustando el cubreobjetos y la corredera con una punta de pipeta.
    6. Coloque las diapositivas en un cajón plano y oscuro. Las diapositivas se pueden almacenar durante la noche; Sin embargo, la incubación durante 4-6 h da como resultado una pasivación óptima.
      NOTA: Es esencial recordar qué lado está pegilado.
    7. Marque el lado no pegilado antes de almacenarlo. Después de la incubación, desmonte y enjuague suavemente los portaobjetos y cubreobjetos a fondo con agua
    8. Seque los portaobjetos y cubreobjetos soplando aire. Mantenga los portaobjetos y cubreobjetos en un tubo estéril (50 ml), con la superficie pegilada una frente a la otra. Conservar a -20 °C hasta el día del experimento.
      NOTA: Es mejor usar portaobjetos y cubreobjetos dentro de las 4 semanas posteriores a la preparación. Las superficies PEGiladas deben alejarse unas de otras. Almacenar los portaobjetos y cubreobjetos PEGylated en bolsas selladas al vacío puede aumentar su vida útil.

2. Expresión de mGluR2 con aminoácido no natural incorporado, etiquetado fluorescente y extracción

NOTA: Este protocolo describe la preparación, los reactivos y el tratamiento de las células para expresar mGluR2 que contienen la UAA 4-azido-L-fenilalanina (AZP). El procedimiento es para células HEK293T cultivadas en cubreobjetos de vidrio de 18 mm. El procedimiento se puede ampliar según sea necesario.

  1. Siembra
    NOTA: Mantener las células HEK293T en DMEM suplementado con suplementado con suero fetal bovino al 10% (v/v), 100 unidades·mL−1 de penicilina-estreptomicina y 15 mM de tampón HEPES (Archivo Suplementario 1) (pH 7.4) a 37 °C bajo 5% deCO2.
    1. Paso de las células con 0,05% de tripsina-EDTA. Semillas de células HEK293T en cubreobjetos de vidrio de poli-L/D-lisina (PLL/PDL) para que alcancen una confluencia del ≥80% durante el tiempo de transfección.
  2. Transfección
    1. Preparar una solución madre de 40 mM de AZP en NaOH 0,1 M.
    2. Prepare medios suplementados con AZP para el crecimiento de células y la expresión de mGluR2. Suplementar los medios estándar (+ FBS, pluma/estreptococo, 15 mM HEPES) utilizando una solución madre AZP de 40 mM. Llevar la concentración final de AZP a 0,6 mM. Añadir 1 M de solución HEPES (la mitad del volumen de 40 mM de solución madre AZP añadida). Por ejemplo, para preparar 10 ml de medio suplementado con AZP, combine 9,775 ml de medio patrón, 150 μL de solución madre de AZP de 40 mM y 75 μL de solución HEPES de 1 M.
    3. Filtrar (esterilizar) el medio con un filtro de jeringa (0,2 μm, PES).
    4. Reemplace el medio estándar con medios que contengan medios suplementados con AZP antes de la transfección.
      NOTA: Tenga cuidado de no secar las células durante el reemplazo del medio.
    5. Transfecte las células con reactivo de transfección (Tabla de materiales) siguiendo el manual del fabricante. Transfectar células HEK293T en un cubreobjetos de 18 mm utilizando un total de 2 μg de ADN (1000 ng de ARNt/sintetasa + 1000 ng de plásmido proteico que contiene codón ámbar). Consulte la Tabla 1 para conocer la concentración y el volumen de los componentes utilizados.
    6. Cambie el medio 24 h después de la transfección a medios frescos suplementados con AZP y permita que las células crezcan durante 24 h adicionales.
  3. Etiquetado con colorantes de alquinina cianina
    1. 20 minutos antes del etiquetado, lave los cubreobjetos con un tampón de grabación (RB) tibio (37 °C) (Archivo complementario 1) dos veces y muévalos a un soporte estándar caliente (37 °C) sin AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
    2. Prepare la solución de etiquetado que contiene Cy3-alquino, Cy5-alquino, BTTES, sulfato de cobre (II) (CuSO4), (+) L-ascorbato de sodio y aminoguanidina.
    3. Siga el orden de creación y adición de soluciones (Tabla 2):
      1. Preparar BTTES de 50 mM.
      2. Preparar 100 mM de aminoguanidina.
      3. Preparar 100 mM Na-ascorbato.
      4. Preparar 655,5 μL de RB.
      5. Agregue el colorante alquino Cy3/Cy5 (10 mM en stock DMSO) al RB.
        NOTA: Agregue aminoguanidina al RB.
      6. Preparar 20 mM CuSO4.
      7. Mezcle CuSO4 y BTTES en un tubo nuevo (la solución se volverá azul).
      8. Añadir la mezcla de CuSO4 y BTTES a RB (2.3.3.6.)
      9. Agregue el Na-Ascorbate.
      10. Siga el volumen indicado en la Tabla 2 a continuación para un cubreobjetos de 18 mm.
    4. Mezcle bien la solución e incube en hielo y en la oscuridad durante 10 minutos antes de etiquetar las células.
    5. Antes de agregar la solución de etiquetado a los cubreobjetos, retire el medio y lávelos con RB. Añadir la solución de etiquetado e incubar durante 15 min a 37 °C en condiciones de oscuridad.
    6. NOTA: Para mejorar el etiquetado, agregue glutamato (concentración final ~ 0.5 mM) después de 10 minutos e incube durante 5 minutos adicionales. El cobre es muy tóxico para las células, y la reacción de etiquetado no debe continuar durante más de 15 minutos in vivo. Prepare todos los componentes frescos. Agregue Na-Ascorbate al final. Mantenga la reacción a 4°C mientras prepara. Sin embargo, tras la adición de la solución de etiquetado, las células deben almacenarse a 37 ° C dentro de la incubadora.
  4. Recolección de las células y extracción de las proteínas (lisis celular)
    1. Retire la solución de etiquetado y lave el cubreobjetos (18 mm) que contiene las células transfectadas mGluR2 dos veces con el RB.
    2. Con una pipeta, lavar las células del cubreobjetos y volver a suspenderlas en RB (1 ml).
      NOTA: Minimice la exposición de la muestra a la luz tanto como sea posible después de este punto.
    3. Granular las células girando a 1.000 x g a 4 °C durante 5 min y retirar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 80-130 μL de la solución de lisis.
      NOTA: El pellet celular debe ser visible a simple vista. El volumen de lisis depende de la cantidad de muestra perdida durante el proceso de etiquetado y lavado.
    4. Mezclar suavemente pipeteando para romper el pellet. Envolver en papel de aluminio y colocar sobre el balancín a 4 °C durante 0,5-1 h para lisar las células.
    5. Granular la fracción insoluble por centrifugación a 20.000 x g y 4 °C durante 20 min. Transfiera el sobrenadante a un tubo frío fresco (la proteína lisada que contiene la proteína de interés marcada con fluorescencia) y guárdelo en hielo para experimentos.

3. Ensamblaje y funcionalización de la cámara de flujo de una sola molécula

  1. Retire el portaobjetos y el cubreobjetos del congelador y deje que se calienten a RT en la oscuridad (~30 min).
  2. Ensamble la cámara usando cinta de doble cara intercalando tiras de cinta de doble cara entre la corredera y el cubreobjetos. Asegúrese de que las superficies PEGylated formen el interior de la cámara de flujo.
  3. Con una punta de pipeta, presione el cubreobjetos para asegurarse de que la cinta esté haciendo contacto completo con el cubreobjetos y la corredera; Tenga cuidado de no romper el cubreobjetos. Aplique epoxi a los bordes de las diapositivas.
    NOTA: No agregue tanto que el epoxi rellene los orificios perforados.
  4. Coloque la cámara de flujo con el lado del cubreobjetos hacia abajo en una caja oscura humidificada para permitir que el epoxi se seque (~ 30 min).
    NOTA: Agregue el tampón T50 (archivo complementario 1) a través de los orificios perforados para evitar que el epoxi cubra los orificios (10-15 μL) durante el período de secado.
  5. Incubar cada carril de la cámara con 500 nM de Neutravidin (diluido en T50) aplicando lentamente ~40 μL a cada carril.
  6. Incubar a RT durante 2 minutos dentro de una caja oscura humidificada. Lavar con ~100 μL de tampón T50 por carril.
  7. Incubar cada carril de cámara con 20 nM de anticuerpos biotinilados11. La elección del anticuerpo depende de la etiqueta de la proteína.
    NOTA: Si el anticuerpo primario no está biotinilado, primero incubar con el anticuerpo secundario biotinilado durante 30 minutos y luego incubar con el anticuerpo primario.
  8. Incubar a RT durante 30 minutos dentro de una caja oscura humidificada. Lavar con ~200 μL de T50 por carril.
    NOTA: Asegúrese de que los carriles nunca se sequen durante el proceso de preparación.

4. Tampones de molécula única

  1. Búfer Trolox
    NOTA: El búfer Trolox es el búfer de inicio para crear un búfer de imágenes. Los componentes del tampón dependen del experimento y pueden variar dependiendo de la proteína de interés. El tampón utilizado en el protocolo descrito aquí incluye sales (NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl2), agente amortiguador (HEPES) y Trolox (pH ~ 7.35).
    1. Disolver 9-10 mg de Trolox en 10 ml de tampón de registro de molécula única (SRB, Archivo complementario 1)
      NOTA: Trolox hace que el tampón sea ligeramente ácido. Ajustar el pH en esta etapa con una solución de hidróxido de sodio (NaOH), 10 M (pH 7,35). El ajuste fino del pH se realizará después de que Trolox esté completamente disuelto; sin embargo, aumentar el pH en este punto aumenta la solubilidad del Trolox.
    2. Mezclar la solución en RT usando un balancín de sobremesa durante 4-8 h (envuelto en papel de aluminio) para disolver completamente el Trolox.
    3. Compruebe el pH y ajuste si es necesario.
    4. Asegúrese de que el Trolox esté completamente disuelto. Esterilizar la solución con un filtro de jeringa y conservar a 4 °C.
      NOTA: El tampón debe usarse después de 2-10 días de envejecimiento. Trolox ayuda a suprimir el parpadeo y se usa comúnmente en estudios de moléculas individuales17. Las propiedades antiparpadeo provienen de un derivado oxidado de Trolox18; por lo tanto, se recomienda mantenerlo en RT durante al menos unas horas para que madure. Además, la radiación UV de la solución fresca de Trolox acelera el proceso de oxidación y se puede utilizar para acelerar el "envejecimiento" del tampón Trolox18.
  2. Receta de tampón de imágenes: Mezcle el tampón Trolox + detergente (~ 2 veces el valor CMC del detergente) + 4 mM de ácido protocatecúico (PCA).
    NOTA: La concentración de detergente se mantiene cerca de CMC ya que las altas concentraciones de detergente pueden resultar en una mayor desnaturalización de proteínas. Por ejemplo, la siguiente mezcla se puede utilizar 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + colesterol (W%, 10:1) + 40 μL de solución madre de PCA de 100 mM. Aquí, el ACP actúa como un agente antioxidante y fue utilizado previamente en estudios smFRET19. DDM es no iónico, se usa comúnmente para solubilizar proteínas de membrana20,21 y se ha utilizado en estudios de moléculas individuales. DDM es un buen detergente de primera elección; Sin embargo, recomendamos probar varios detergentes y asegurarse de que los resultados sean consistentes.

5. Configuración del microscopio y adquisición de datos smFRET

  1. Encienda la computadora y el microscopio. Encienda los láseres para calentar (532 nm para la excitación Cy3 y 640 nm para la excitación Cy5).
    NOTA: Aquí se utilizó un microscopio invertido equipado con un objetivo TIRF de 100x (N.A. 1.49), divisor de imágenes y cámara EMCCD. La configuración está equipada con un combinador láser de cuatro líneas, un espejo dicroico, un filtro de emisión de paso largo, un filtro dicroico de emisión y un filtro de muesca.
  2. Encienda la cámara EMCCD y abra el software de la cámara. Espere 20 minutos para que la cámara alcance −69 °C y se estabilice.
  3. Monte la cámara de muestras en la etapa del microscopio. Agregue la muestra de proteína gradualmente para lograr ~ 400 moléculas por campo de visión (paso 2.4.5). Lave la cámara con 100 μL del tampón de imágenes.
  4. Ajuste la ganancia, la velocidad de adquisición y las potencias del láser de modo que se detecten señales de fluorescencia de una sola molécula tanto en el canal donante como en el aceptor. Ajuste la concentración de las proteínas dentro de la cámara de muestras si es necesario.
    NOTA: Con más de 400 moléculas en el campo de visión, distinguir moléculas individuales se vuelve más difícil y el ruido de fondo será mayor.
  5. Excitar al donante y adquirir trazas de tiempo hasta que al menos el 80% de las moléculas donantes en el campo de visión estén fotoblanqueadas.
  6. Al final de la película, encienda el láser de 640 nm para excitar directamente el aceptor hasta que algunas de las moléculas aceptoras se fotoblanqueen, facilitando la discriminación de una sola molécula del multímero.
  7. Desplácese a un campo de visión diferente y repita los pasos anteriores para recopilar al menos tres películas (réplicas técnicas) por condición.
    NOTA: Utilice la potencia láser más baja posible al seleccionar una nueva región de interés (ROI) y enfocar para minimizar el fotoblanqueo. Preste atención a la deriva de la etapa durante la adquisición. Si se observa una deriva notable después de pasar a un nuevo ROI, espere 3 minutos antes de comenzar la adquisición.

6. Análisis de datos

  1. Alineación de canales donantes y aceptores (mapeo de películas)
    1. Grabe las imágenes de perlas fluorescentes en los canales donante y aceptor.
    2. Generar el archivo de mapeo utilizando los datos del talón para correlacionar la fluorescencia donante y aceptor de cada molécula22,23.
      NOTA: La señal de emisión de una sola molécula se divide en señales donadoras y aceptoras por el filtro dicroico de emisión dentro del divisor de imagen. Las imágenes del donante y del aceptor se proyectan en la cámara una al lado de la otra. Para asociar con precisión las intensidades donante y aceptor de una sola molécula entre las dos áreas, a menudo se genera un archivo de mapeo utilizando muestras de perlas fluorescentes. Usando este archivo de mapeo, todas las moléculas que se detectan en los canales donante y aceptor se mapean entre sí. Luego, el análisis genera las trazas de tiempo, que son las intensidades donante y aceptor a lo largo del tiempo, para cada molécula.
  2. Selección de trazas FRET de molécula única (selección de partículas)
    NOTA: Las trazas de partículas individuales se examinan y seleccionan para el análisis posterior utilizando MATLAB. Los criterios de selección exactos dependen del sistema. Las pautas generales sobre lo que constituye una partícula de calidad se describen aquí. Todos los códigos modificados a medida están disponibles en GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Seleccione las trazas donde la intensidad total de las trazas (donante + aceptor) es estable en el tiempo. Seleccione las trazas con cambios anticorrelacionados en las intensidades del donante y aceptor.
    2. Seleccione las moléculas donante y aceptora que muestran fotoblanqueo en un solo paso. Seleccione las trazas que tengan una longitud de >5 s.
      NOTA: El fondo en cada canal después del blanqueo debe ir a cero. Las trazas no deben tener muchos eventos parpadeantes; Esto aumentará la dificultad del análisis.
    3. Calcule la eficiencia FRET utilizando la ecuación E = (I A− 0.088 × I D)/(I D + [I A− 0.088 × I D])24,25,26, donde I D e I A son intensidades donante y aceptora crudas, respectivamente.
      NOTA: La fuga de la emisión del donante en el canal aceptor se determina utilizando una muestra etiquetada solo con el donante excitada con un láser de 532 nm26. El factor de corrección de fugas, 0.088, puede diferir para diferentes configuraciones dependiendo de los conjuntos de filtros utilizados. Es importante tener en cuenta que la conversión cuantitativa y robusta de las eficiencias FRET a distancias absolutas requiere la corrección de las intensidades del donante y aceptor para múltiples factores y se ha discutido ampliamente antes de27.
  3. Identificar el estado conformacional mediante el modelado oculto de Markov (HMM)
    1. Ejecute el programa vbFRET28 en MATLAB e importe los seguimientos seleccionados para una condición determinada. Establezca las restricciones para el número de estados potenciales e iteraciones que se ejecutarán.
      NOTA: Sobre la base de los datos brutos de los resultados representativos, se planteó la hipótesis de que había hasta cuatro estados FRET discretos ocupados por el sensor conformacional; Por lo tanto, se designó un rango de uno a cuatro estados. Anteriormente, se determinó que las mejoras en el ajuste aumentaban insignificantemente con >25 iteraciones; Por lo tanto, se utilizaron 25 iteraciones para ajustar los datos representativos.
    2. Analice las trazas smFRET y exporte las trazas idealizadas y la sesión de análisis. Guarde las trazas idealizadas en una carpeta separada para el análisis posterior.
      NOTA: Los programas utilizados para extraer datos de transición de estado y tiempo de permanencia de trazas idealizadas fueron puestos a disposición en trabajos previamente publicados29.
    3. Utilizando programas de MATLAB, extraiga transiciones de estado y trácelas como un mapa de calor con la coordenada X que indica la conformación inicial y la coordenada Y que indica la conformación final.
      NOTA: Las transiciones se definen como cambios en el valor FRET >0.1 en los resultados representativos discutidos aquí. El umbral para las transiciones depende de los estados conformacionales hipotéticos que ocupa una proteína de interés (establecer el umbral de transición para que sea menor que la diferencia entre los estados FRET más cercanos), así como de la resolución permitida por la configuración experimental. El examen de mapas de calor para múltiples condiciones permite la identificación de los estados conformacionales más comunes a través de los cuales un sensor pasa y, por lo tanto, ocupa. Se identificaron cuatro estados FRET para los resultados representativos (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 y 0,89).
    4. Utilizando los programas de MATLAB, extraiga los tiempos de permanencia para cada estado conformacional identificado. Designe un rango de valores FRET que delineen cada estado y resolución de tiempo durante la adquisición de datos. Los rangos de FRET se dividen uniformemente por los estados FRET adyacentes. Exporte los tiempos de permanencia para las condiciones de tratamiento dadas.
      NOTA: En la mayoría de los casos, los datos de tiempo de permanencia se pueden estimar bien mediante una sola función de decaimiento exponencial. Este análisis se puede realizar en un software de análisis de datos y gráficos.
  4. Ajuste gaussiano de histogramas de población smFRET para cuantificar la ocupación del estado
    1. Importar histogramas FRET de población para condiciones de interés en el análisis de datos y software de gráficos para el análisis de ajuste de picos múltiples.
    2. Indique el número de picos presentes (cuatro picos o estados basados en el análisis HMM). El ajuste se realizó utilizando múltiples distribuciones gaussianas30 definidas como figure-protocol-1, donde A es el área del pico, xc es el centro del pico y w es el ancho del pico para cada pico.
    3. Restrinja los parámetros de ajuste como A > 0, xc = FRET ± 0,02 y 0,1 ≤ p≤ 0,24. Se ajustaron simultáneamente cuatro picos FRET para histogramas FRET de poblaciones individuales. Aplique las restricciones definidas para los accesorios de todas las condiciones.
    4. Calcule el estado de ocupación (porcentaje) como el área de pico de interés dividido por el área total, definida como la suma de todos los picos.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expresión y etiquetado fluorescente del sensor FRET basado en UAA
En este documento, se discuten resultados ejemplares de la inserción y etiquetado fluorescente de un UAA (AZP) dentro del CRD de mGluR2 (548UAA)11. Como se mencionó anteriormente, para insertar AZP en mGluR2, es necesaria la coexpresión de la maquinaria traslacional diseñada, que incluye una sintetasa de ARNt modificada y ARNt complementario (pIRE4-Azi), y mGluR2 que contiene un codón ámbar en la posición 548, cr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los GPCR son proteínas que operan en la membrana celular para iniciar la transducción de señales. Muchos GPCR consisten en múltiples dominios, y la señalización depende de la interacción cooperativa entre los dominios. Para modular las propiedades de estos receptores de membrana, es esencial comprender el comportamiento dinámico de los múltiples dominios. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) es una técnica de fluorescencia que permite medir la conformación y dinámica de pr...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Reza Vafabakhsh por las discusiones. Este trabajo fue apoyado por la subvención R01GM140272 de los Institutos Nacionales de Salud (a R.V.), por The Searle Leadership Fund for the Life Sciences en Northwestern University, y por el Chicago Biomedical Consortium con el apoyo de Searle Funds en The Chicago Community Trust (a R.V.). B.W.L. fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-L-ascorbato de sodioSigma AldrichCat # 11140-250G
4-azido-L-fenilalaninaChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw et al. 2021Construcción transfectada
Ácido acéticoFisher Chemical64-19-7
AcetonaFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Software, algoritmo
Aminoguanidina (clorhidrato)Cayman Chemical81530
AminosilanoAldrich919-30-2
Baño Sonicador 2.8 LFisher ScientificBaño ultrasónico 2.8 L
Biotina-PEGLaysan Bio IncArtículo# Biotina-PEG-SVA-5000-100mg
Herramientas de químicaBTTES1237-500
Sulfato de cobre (II)Sigma AldrichCat # 451657-10G
CubreobjetosVWR16004-306Cámara de muestras
Cy3 AlkyneClick Herramientasde química TA117-5
Cy5 AlkyneClick Chemistry ToolsTA116-5
DDMAnatraceParte# D310 1 GMDetergente
DDM-CHS (10:1)AnatraceParte# D310-CH210 1 MLDetergente con cholecterol
Defined Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635SemrockFiltro de muesca
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDAndorDU-897UCámara
ET542lpChromaFiltro de emisión de paso largo
FF640-FDi01SemrockFiltro dicroico
de emisión FLAG-tag anticuerpoGenscriptA01429
Perla fluorescenteInvitrogen T7279Microesferas TetraSpeckPerla esférica
Portaobjetos de vidrioFisherfinest12-544-4cámara de muestras
GlutamatoSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Línea celular
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Divisor de imágenesOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LaserOxxiusCombinador láser de 4 líneas
Lipofectamine 3000 Reactivo de transfecciónThermo Fisher ScientificL3000015Reactivo de transfección
MetanolFisher Chemical67-56-1
MicroscopioOlympusOlympus IX83
Milli-Q aguaBarnsteadDesionizador
de agua m-PEGLaysan Bio IncArtículo# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635dicroicoSemrock
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Medio de suero reducido
OptiMEM/Medio de suero reducidoThermo Fisher
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Software de análisis de datos y gráficos
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
pIRE4-AziAddgenePlásmido # 105829Construcción transfectada
Hidrobromuro de poli-L-lisinaSigma AldrichCat # P2636
Ácido protocatecuico (PCA)Grupo HWI99-50-3
smCamera (Versión 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Cámara software
Bicarbonato de sodioFisherBioReagents144-55-8
Hidróxido de sodio (NaOH)Sigma1310-73-2
Filtro de jeringaWhatman UNIFLOCat#9914-2502 Filtración delíquidos
TroloxSigma53188-07
Click Espejo Scientific

References

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