Este estudio presenta un procedimiento detallado para realizar experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) en receptores acoplados a proteínas G (GPCR) utilizando el etiquetado específico del sitio a través de la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA). El protocolo proporciona una guía paso a paso para la preparación de muestras smFRET, experimentos y análisis de datos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Visualización de la dinámica conformacional de los receptores de membrana utilizando FRET de molécula única
En este artículo
Resumen
Resumen
La capacidad de las células para responder a las señales externas es esencial para el desarrollo, crecimiento y supervivencia celular. Para responder a una señal del entorno, una célula debe ser capaz de reconocerla y procesarla. Esta tarea se basa principalmente en la función de los receptores de membrana, cuya función es convertir las señales en el lenguaje bioquímico de la célula. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la familia más grande de proteínas receptoras de membrana en humanos. Entre los GPCR, los receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) son una subclase única que funcionan como dímeros obligados y poseen un gran dominio extracelular que contiene el sitio de unión al ligando. Los avances recientes en los estudios estructurales de mGluRs han mejorado la comprensión de su proceso de activación. Sin embargo, la propagación de cambios conformacionales a gran escala a través de mGluRs durante la activación y modulación es poco conocida. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de una sola molécula (smFRET) es una técnica poderosa para visualizar y cuantificar la dinámica estructural de las biomoléculas a nivel de una sola proteína. Para visualizar el proceso dinámico de activación de mGluR2, se desarrollaron sensores conformacionales fluorescentes basados en la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA) que permitieron el etiquetado de proteínas específicas del sitio sin perturbar la estructura nativa de los receptores. El protocolo descrito aquí explica cómo realizar estos experimentos, incluido el novedoso enfoque de etiquetado UAA, la preparación de muestras y la adquisición y análisis de datos smFRET. Estas estrategias son generalizables y pueden extenderse para investigar la dinámica conformacional de una variedad de proteínas de membrana.
Introducción
La transferencia de información a través de la membrana plasmática depende en gran medida de la función de los receptores de membrana1. La unión del ligando a un receptor conduce a un cambio conformacional y a la activación del receptor. Este proceso es a menudo alostérico en la naturaleza2. Con más de 800 miembros, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son la familia más grande de receptores de membrana en humanos3. Debido a su papel en casi todos los procesos celulares, los GPCR se han convertido en objetivos importantes para el desarrollo terapéutico. En el modelo canónico de señalizaci....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El flujo de trabajo general del protocolo se describe en la figura 1.
1. Preparación de la cámara de muestras
- Limpieza de deslizamientos y cubreobjetos
NOTA: Estos pasos tienen como objetivo limpiar las superficies de los portaobjetos, así como los cubreobjetos y prepararlos para la aminosilanización. Un requisito crítico para realizar experimentos de fluorescencia de una sola molécula en moléculas atadas a la superficie es una superficie pasivada. La técnica de pasivación más confiable y reproducible consiste en unir covalentemente cadenas de polímero inerte a la superficie del vidrio como una....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Expresión y etiquetado fluorescente del sensor FRET basado en UAA
En este documento, se discuten resultados ejemplares de la inserción y etiquetado fluorescente de un UAA (AZP) dentro del CRD de mGluR2 (548UAA)11. Como se mencionó anteriormente, para insertar AZP en mGluR2, es necesaria la coexpresión de la maquinaria traslacional diseñada, que incluye una sintetasa de ARNt modificada y ARNt complementario (pIRE4-Azi), y mGluR2 que contiene un codón ámbar en la posición 548, cr.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los GPCR son proteínas que operan en la membrana celular para iniciar la transducción de señales. Muchos GPCR consisten en múltiples dominios, y la señalización depende de la interacción cooperativa entre los dominios. Para modular las propiedades de estos receptores de membrana, es esencial comprender el comportamiento dinámico de los múltiples dominios. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) es una técnica de fluorescencia que permite medir la conformación y dinámica de pr.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Reza Vafabakhsh por las discusiones. Este trabajo fue apoyado por la subvención R01GM140272 de los Institutos Nacionales de Salud (a R.V.), por The Searle Leadership Fund for the Life Sciences en Northwestern University, y por el Chicago Biomedical Consortium con el apoyo de Searle Funds en The Chicago Community Trust (a R.V.). B.W.L. fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (+)-L-ascorbato de sodio | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-fenilalanina | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Construcción transfectada | |
| Ácido acético | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetona | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algoritmo |
| Aminoguanidina (clorhidrato) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilano | Aldrich | 919-30-2 | |
| Baño Sonicador 2.8 L | Fisher Scientific | Baño ultrasónico 2.8 L | |
| Biotina-PEG | Laysan Bio Inc | Artículo# Biotina-PEG-SVA-5000-100mg | |
| Herramientas de química | BTTES | 1237-500 | |
| Sulfato de cobre (II) | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cubreobjetos | VWR | 16004-306 | Cámara de muestras |
| Cy3 Alkyne | Click Herramientas | de química TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Parte# D310 1 GM | Detergente |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Parte# D310-CH210 1 ML | Detergente con cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Filtro de muesca | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Cámara |
| ET542lp | Chroma | Filtro de emisión de paso largo | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Filtro dicroico | |
| de emisión FLAG-tag anticuerpo | Genscript | A01429 | |
| Perla fluorescente | Invitrogen T7279 | Microesferas TetraSpeck | Perla esférica |
| Portaobjetos de vidrio | Fisherfinest | 12-544-4 | cámara de muestras |
| Glutamato | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Línea celular |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Divisor de imágenes | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | Combinador láser de 4 líneas | |
| Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Reactivo de transfección |
| Metanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscopio | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q agua | Barnstead | Desionizador | |
| de agua m-PEG | Laysan Bio Inc | Artículo# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | dicroico | Semrock | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Medio de suero reducido |
| OptiMEM/Medio de suero reducido | Thermo Fisher | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Software de análisis de datos y gráficos |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plásmido # 105829 | Construcción transfectada |
| Hidrobromuro de poli-L-lisina | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Ácido protocatecuico (PCA) | Grupo HWI | 99-50-3 | |
| smCamera (Versión 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Cámara software | |
| Bicarbonato de sodio | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Filtro de jeringa | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 Filtración de | líquidos |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
Referencias
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
