Method Article

Mapeo de la densidad absoluta de ADN en núcleos celulares mediante microscopía de localización de una sola molécula

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe un método que mide las densidades absolutas de ADN dentro de los núcleos celulares adherentes utilizando la teselación de Voronoi de datos de microscopía de localización de una sola molécula, volumen conocido, tamaño del genoma y etapa del ciclo celular.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dentro del núcleo celular, los genes silenciosos generalmente se encuentran en áreas de cromatina de alta densidad llamadas heterocromatina, mientras que los genes activos se pueden encontrar principalmente en la interfaz entre la cromatina y el espacio intercromatina llamado eucromatina. En la actualidad, la caracterización de la eu- y la heterocromatina se basa principalmente en modificaciones epigenéticas de proteínas histonas a lo largo de la secuencia de ADN, mientras que se sabe poco sobre las densidades absolutas de ADN en el núcleo celular y sus implicaciones funcionales. Los modelos del núcleo basados únicamente en datos bioquímicos y suposiciones sobre la naturaleza de la cromatina como polímero aún difieren fundamentalmente de los datos de imágenes generados por microscopía de alta resolución. Esto indica que todavía falta información importante estructuralmente relevante. Creemos que las restricciones espaciales podrían estar involucradas en la regulación génica y, por lo tanto, hemos desarrollado un método que permite la medición de densidades absolutas de ADN en núcleos de células de mamíferos mediante la transformación de datos de localización de superresolución en mapas de densidad a escala real mediante teselación de Voronoi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desde los primeros días de la biología celular, el núcleo celular, el asiento de la información genética, ha fascinado a los biólogos. Después de aplicar métodos de tinción citológica desarrollados por él mismo, Emil Heitz descubrió, en 1928, áreas teñidas intensamente de manera diferente dentro del núcleo celular1. Llamó a las áreas densas y teñidas más intensamente "heterocromatina", mientras que llamó a las áreas menos densas y menos teñidas "eucromatina". Con el tiempo, se hizo evidente que los genes activos se encuentran principalmente en la eucromatina, mientras que se descubrió que las áreas más densas eran ricas en elementos repetitivos y genes silenciosos. Los términos heterocromatina y eucromatina han sobrevivido hasta nuestros días, aunque su definición ha cambiado de propiedades estructurales a moleculares (ver más abajo). Hoy sabemos que el núcleo celular se divide en dos fases principales. Un líquido (el compartimento de la intercromatina), que alberga los cuerpos nucleares, el compartimento de empalme y el nucleoplasma, y el otro sólido, similar a un hidrogel, el dominio de la cromatina, que incluye los territorios cromosómicos y los nucléolos2. En la interfaz con el espacio intercromatina, la cromatina es menos densa, y aquí es donde tienen lugar principalmente los procesos genéticamente activos, como la transcripción, la replicación y la reparación 3,4,5, mientras que adyacente a la lámina, alrededor de los nucléolos y cerca de los centrómeros, la cromatina muestra altos niveles de compactación y, en general, es transcripcionalmente bastante inactiva6.

A nivel molecular, la cromatina se construye a partir de ADN envuelto alrededor de nucleosomas (un octámero de proteínas histonas centrales). Las histonas poseen dominios de cola intrínsecamente desordenados que pueden modificarse postraduccionalmente agregando varios grupos químicos (metil-, acetilo, fósforo-, biotina), aminoácidos (arginina) o incluso proteínas (SUMO, Ubiquitina)7. Estas modificaciones pueden leerse y atraer otras proteínas (por ejemplo, remodelador de cromatina, HP1, proteínas de reparación, ARN) y, por lo tanto, definir el estado fisiológico de la secuencia de ADN (transcripcionalmente permisiva/restrictiva), sin cambiar directamente su secuencia (por lo tanto, "epi"genética)7. El tipo y el número de modificaciones en torno a una secuencia específica pueden diferir profundamente entre los tipos de células, son reversibles y pueden cambiar a lo largo del desarrollo, la senescencia y la enfermedad 8,9,10. Hay modificaciones de las colas de histonas que son más frecuentes en regiones altamente transcritas y modificaciones que predominan en regiones del genoma que tienen poca o ninguna actividad transcripcional.

Por ejemplo, las regiones altamente transcritas que son ricas en modificaciones de H3K4 o cuyas colas de histonas están acetiladas generalmente se describen como eucromatina, mientras que las áreas ricas en modificaciones represivas de histonas (H3K9me3, H3K27me3 o H4K20me3) se denominan heterocromatina, que se divide a su vez en heterocromatina constitutiva (transcripcionalmente inactiva en todas las células) (por ejemplo, H4K20me3) y heterocromatina facultativa (cromatina silenciada según el tipo de célula, por ejemplo, H3K27me3)6. Aunque los métodos bioquímicos y biológicos moleculares son muy adecuados para medir los cambios químicos a nivel de secuencia, es mucho más difícil usarlos para hacer declaraciones sobre propiedades espaciales en mesoescala utilizando estos métodos.

Por ejemplo, se han realizado intentos utilizando información de proximidad de experimentos Hi-C, que detectan y mapean proximidades cercanas de ADN entre regiones de secuencia, para reconstruir modelos espaciales del genoma11. Sin embargo, la comparación directa con imágenes de microscopía óptica y electrónica de alta resolución muestra que esto solo es posible de forma limitada (Figura 1). Aunque métodos como Hi-C12 pueden detectar territorios cromosómicos en células en interfase correctamente como entidades separadas, estos modelos son bastante "miopes", porque las proximidades de la secuencia de ADN por sí solas son ciegas para reflejar las relaciones espaciales entre partes más distantes del genoma y, por lo tanto, no son muy adecuadas para una reconstrucción adecuada del genoma en 3D. Por lo tanto, las diferencias de densidad tampoco pueden reflejarse adecuadamente en la información de frecuencia de contacto. Esto conduce a representaciones "espaguetizadas" del genoma en el núcleo (ver Figura 1B), que parecen ocurrir en una bola de bucles de lana de libre acceso.

Para allanar el camino hacia una imagen integradora y más realista del núcleo que combine información bioquímica con datos biofísicos y estructurales, es necesario desarrollar métodos que permitan generar datos sobre diferentes aspectos de la organización nuclear. Hasta hace poco, también ha sido difícil determinar las densidades absolutas de ADN en los núcleos celulares a partir de datos de imágenes. Las razones de esto fueron la resolución limitada de los microscopios ópticos convencionales, los problemas en microscopía electrónica para teñir específicamente el ADN y los pequeños volúmenes de observación en microscopía electrónica.

La resolución de los microscopios de fluorescencia convencionales está limitada por la difracción de la luz. La imagen de una fuente puntual de luz se extiende debido al límite de difracción y puede describirse mediante la función de dispersión puntual (PSF). Según la PSF, la imagen de un fluoróforo, que puede considerarse con buena aproximación como una fuente puntual de luz, ocupa un volumen de cierto tamaño alrededor de su fuente de origen (fluoróforo)13. Cuando muchos fluoróforos, ubicados mucho más cerca unos de otros que las dimensiones de sus imágenes limitadas por difracción, se excitan simultáneamente, las distribuciones de intensidad de la imagen se superponen y la ubicación de los fluoróforos individuales no se puede resolver. La emisión de luz estocástica secuencial de fluoróforos (parpadeo) permite el aislamiento óptico de moléculas individuales y, por lo tanto, encontrar sus ubicaciones exactas al determinar los centros de gravedad de intensidad de sus señales.

Esto se puede utilizar para reconstruir la información estructural de las muestras mediante la acumulación de datos de localización de fluoróforos a partir de muchas imágenes grabadas. Este método generalmente se conoce como microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) (para obtener más información, consulte14). Cuantos más fotones emita un fluoróforo durante su "tiempo", con mayor precisión se pueden determinar los centros de gravedad de intensidad. Las lentes astigmáticas en la trayectoria del haz transforman las señales de fluoróforos por encima o por debajo del plano focal óptico en elipses, que se pueden usar para determinar su posición a lo largo del eje óptico. Los ejes largos de las elipses que se originan a partir de señales fluorescentes por debajo del plano focal se giran a 90° en comparación con los ejes de las elipses que se originan en fluoróforos por encima del plano focal. Además, la relación de ejes de estas elipses permite determinar la posición de la molécula a lo largo del eje óptico en relación con el plano focal dentro de un rango de ±300 nm15.

La calidad de las imágenes de superresolución generadas por la reconstrucción de eventos de parpadeo estocásticos depende en gran medida de la densidad de etiquetado y el número de eventos de parpadeo. Estos últimos dependen de la fotoestabilidad de los fluoróforos y del número de eventos de parpadeo antes de que finalmente fallen (número de ciclos de encendido / apagado). El método descrito aquí para obtener imágenes de superresolución de la distribución de ADN intranuclear se denomina fBALM (microscopía de localización activada por unión asistida por fluctuación de la estructura del ADN). Se basa en fluoróforos que se intercalan transitoriamente en ácidos nucleicos y solo emiten fluorescencia una vez que se unen al ADN16,17. Debido a los residuos cargados de su columna vertebral de fósforo-diéster, el ADN es un polímero altamente cargado negativamente. La estabilización de las cadenas de ADN complementarias en las células vivas requiere la neutralización por proteínas cargadas positivamente (por ejemplo, histonas) e iones. Al disminuir el pH, la estabilidad del emparejamiento complementario de las bases se reduce para permitir que los tintes intercalados se difundan hacia adentro y hacia afuera16,17.

Dependiendo del tinte fluorescente intercalante, este estado se puede alcanzar dentro de un cierto rango de pH. Los tintes fluorescentes como YoYo-1 y SYTOX Orange solo emiten fluorescencia cuando se unen al ADN y debido a que los tintes intercalantes (a diferencia de los tintes que se unen al surco menor del ADN como Hoechst y 4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) generalmente se unen de manera independiente de la secuencia, son adecuados para mapear la distribución del ADN dentro de los núcleos celulares mediante microscopía de localización.

La teselación de Voronoi es un método matemático que permite la subdivisión del espacio en diferentes particiones en función de la ubicación de los puntos. En 2D-Space, el tamaño de las teselas resultantes refleja el inverso de la densidad de los puntos18. Debido a que la microscopía de localización reconstruye las imágenes como un conjunto de puntos que representan la ubicación de los fluoróforos, la teselación de Voronoi puede ayudar a determinar la densidad de las señales de localización (Figura 2). Por lo tanto, el uso de un tinte específico de ADN como fluoróforo permite medir las densidades del ADN.

El conocimiento a priori del contenido de ADN (número de pares de bases) y la dimensión espacial del núcleo permite transformar las densidades relativas de ADN en densidades absolutas de ADN. El siguiente protocolo muestra el mapeo de densidades absolutas de ADN en células adherentes utilizando SMLM a una resolución muy alta y demuestra que estas densidades están sujetas a grandes variaciones.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: La Figura 3 ofrece una descripción general del flujo de trabajo descrito en esta sección. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con los reactivos, materiales, equipos y software utilizados en este protocolo. El código utilizado para esta publicación se puede ver y descargar aquí: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Cultivo celular

  1. Cultivar células C3H10T1/2, HFB y HeLa en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 °C en una atmósfera humidificada suplementada con CO2 al 5%. Cuando las células están cerca de la confluencia, subcultive las células dividiéndolas en una proporción de 1:3 (C3H10T1/2, HFB) y 1:10 (HeLa), respectivamente.
  2. Un día antes de realizar las mediciones, siembre las células de cultivos de crecimiento exponencial en un plato cuadriculado de 35 mm. Asegúrese de que las placas de observación proporcionen una excelente calidad óptica para la microscopía de fluorescencia (fondo de vidrio con un grosor de 170 μm, # 1.5) y posean una rejilla para localizar células sin ambigüedades. Asegúrese también de que las células estén en una suspensión unicelular y que toda el área de la superficie del plato esté cubierta homogéneamente con células.
    NOTA: Se recomienda utilizar platos con una cuadrícula impresa para encontrar una vez más las celdas exactas que se asignaron a una determinada etapa del ciclo celular.
  3. Si el experimento lo requiere, añadir 100 nM de tricostatina A (TSA) al medio de cultivo celular e incubar las células en las condiciones descritas anteriormente en el paso 1.1.

2. Preparación de la muestra

  1. El día de la medición, lave las células una vez con 1x DPBS antes de fijarlas durante 30 min en paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x DPBS.
    NOTA: Para obtener resultados reproducibles, asegúrese de que se prepare una solución de PFA nueva cada vez y tenga especial cuidado de que la concentración de PFA sea precisa.
  2. Después de retirar el fijador, vuelva a lavar las células 2 veces con 1 DPBS antes de permeabilizarlas durante 20 minutos en 1 DPBS que contenga Triton X-100 al 0,4 %.
  3. Retire el tampón de permeabilización con una pipeta y realice un paso de lavado adicional con 1x DPBS antes de tratar las células con un cóctel de ARNasa (dilución 1:1.000 en 1x DPBS). Coloque las células en una incubadora durante 30 min a 37 °C en una cámara humidificada.
  4. Prepare la solución de tinción diluyendo la solución madre SYTOX Orange compatible con fBALM (5 mM en 1x DPBS a una dilución de 1:10.000).
  5. Retire el tampón de ARNasa con una pipeta y aplique un paso de lavado adicional con 1x DPBS antes de añadir la solución de tinción. Incube las células a temperatura ambiente en una cámara humidificada durante 5 min.
  6. Retire la solución de tinción SYTOX Orange de las células con una pipeta, lave con 1x DPBS y almacene las células en 1x DPBS, protegidas de la luz intensa.

3. Determinación citométrica del ciclo celular

NOTA: Para este paso, aquí se utilizó un microscopio de cribado invertido de alto contenido, pero se puede utilizar cualquier microscopio automatizado de fluorescencia de campo amplio inverso. La intensidad de todo el núcleo es una medida de su contenido de ADN; Por lo tanto, asegúrese de abrir completamente el orificio si usa un sistema confocal. Las lentes de aire de objetivo de apertura numérica (NA) de baja apertura son preferibles a las lentes de objetivo de inmersión en aceite.

  1. Coloque la placa con las células en un microscopio de fluorescencia inversa equipado con una platina motorizada y un software que permite la reconstrucción de grandes áreas de la muestra uniendo imágenes grabadas automáticamente.
  2. Elija una lente de objetivo que permita registrar suficientes células por campo de visión (al menos 900 núcleos individuales en total [para más detalles, consulte Roukos et al.19]) para que la adquisición de imágenes para la determinación del ciclo celular se pueda realizar en un tiempo razonable. Utilice una lente que no muestre grandes diferencias de intensidad entre el centro y los bordes. Si no se dispone de un objetivo de este tipo, aplique una corrección de campo plano a las imágenes (consulte el paso 7). Para seguir este protocolo, utilice un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con una lente de aire de 20x NA 0.4 con una profundidad de enfoque = 8 μm.
  3. Durante la adquisición de imágenes, cubra el área central del plato con filtros apropiados para el fluoróforo utilizado. Tome imágenes de campo claro en modo de luz transmitida.
    NOTA: Las imágenes de campo claro son importantes para la reubicación de celdas en la cuadrícula en el paso 4.6.
  4. Coloque el plato con las celdas en un refrigerador a 4 ° C hasta el paso 4.4.
  5. Reconstruya el área escaneada a partir de las imágenes individuales colocando en mosaico las imágenes individuales grabadas.
  6. Transfiera los datos de imagen de la tinción de ADN fluorescente a un ordenador que ejecute el software de código abierto CellProfiler4.2.120.
  7. Si es necesaria una corrección de campo plano de las imágenes de fluorescencia, genere una imagen de referencia del microscopio utilizado a partir de las imágenes grabadas. Abra la canalización Illumination Correction.cpproj (incluida como Archivo complementario 1); Observe que la canalización aparece como una secuencia en la pantalla en la que se puede hacer clic en diferentes pasos. Arrastre y suelte las imágenes en el campo designado en las imágenes del primer paso de la canalización.
    NOTA: Asegúrese de excluir todos los datos que no sean de imagen en los archivos enumerados utilizando las opciones de filtro en la parte inferior de la ventana.
  8. En el último paso de la canalización de corrección de iluminación, haga clic en Guardar imágenes para definir una ubicación donde se almacenarán las imágenes de referencia y luego haga clic en el botón Analizar imágenes .
  9. Abra la canalización CellCycleAnalysis.cpproj (incluido como archivo complementario 2). Arrastre y suelte las imágenes grabadas en el paso 3.3 (consulte la Figura 4A como ejemplo), incluida la imagen de referencia (paso 3.8), en el campo designado en el primer paso Imágenes de la canalización.
    NOTA: Asegúrese de excluir todos los datos que no sean de imagen en los archivos enumerados utilizando las opciones de filtro en la parte inferior de la ventana.
  10. En el paso CorrectIlluminationApply de la canalización, elija la imagen de referencia en el menú desplegable seleccionando la función Seleccionar la iluminación.
  11. En el último paso de la canalización del análisis del ciclo celular, defina una ubicación donde se almacenó la imagen de referencia en el paso 3.7 y haga clic en el botón Analizar imágenes para comenzar a medir de forma masiva las intensidades de fluorescencia integradas de todos los núcleos dentro de las imágenes registradas en el paso 3.3.
    NOTA: CellProfiler4.2.1 generará un archivo de texto "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt", que contiene los datos de cada núcleo medido (Imagen, ObjectID, intensidad de fluorescencia integrada, coordenadas de imagen) en formato CSV.
  12. Asegúrese de que el elemento DisplayHistogram de la canalización está activado como activo.
  13. Tenga en cuenta las intensidades de fluorescencia integradas en el histograma para los picos G1 y G2 (consulte la figura 4B como ejemplo) e introduzca los intervalos a su alrededor en los elementos FilteredObjects de la canalización. Active los elementos de canalización haciendo clic en las casillas de verificación.
  14. Active los elementos de canalización DisplayDataOnImage correspondientes para generar una imagen que resalte las celdas en la fase G1 o G2 y vuelva a ejecutar la canalización (consulte la figura 4C como ejemplo).
  15. Elija hasta cinco células que representen la fase del ciclo celular deseada de la imagen generada en el área marcada de la cámara de observación e intente reubicar las células en el microscopio SMLM.
    NOTA: Dado que aquí se utilizan dos líneas celulares con un tamaño de genoma desconocido, los tamaños del genoma se determinaron comparando los picos G1 de una línea celular de fibroblastos humanos con los picos G1 de HeLa y células C3H10T1/2. Los histogramas y la relación proporcional entre los tamaños de sus genomas se pueden ver en la Figura complementaria S1.

4. SMLM-fBALM

NOTA: Aunque la suma neta de oxígeno en estas reacciones bioquímicas combinadas es cero, se recomienda realizar la reacción en un plato que no esté sellado, ya que las concentraciones limitadas de oxígeno pueden ralentizar la producción de D-glucono-1,5-lactona. La concentración creciente de D-glucono-1,5-lactona reduce gradualmente el pH, lo cual es necesario ya que una disminución inmediata del pH alterará la ultraestructura de la muestra.

  1. Prepare 1 ml del tampón de imágenes mezclando los siguientes ingredientes: 900 μl de glucosa (1 g/ml de glucosa en 1x DPBS), 50 μl de glucosa oxidasa (0,5 mg/ml en 1x DPBS) y 50 μl de catalasa (40 μg/ml en 1x DPBS).
  2. Retire el DPBS 1x de la muestra con una pipeta y agregue 1 ml del tampón de imágenes en el plato que contiene las células.
  3. Monte el plato en la platina de un microscopio compatible con SMLM. Utilice una lente de objetivo de alta NA y un gran aumento óptico.
  4. Localice uno de los núcleos elegidos (del paso 3.15) utilizando el sistema de coordenadas del plato y céntrelo en el campo de visión de la cámara.
    NOTA: La reacción enzimática tarda ~60-180 min hasta que se alcanza el pH correcto para el método fBALM y facilita el parpadeo adecuado. Se recomienda montar el plato de observación lo antes posible para proporcionar tiempo suficiente para que la muestra se ajuste a la temperatura del instrumento, ya que los cambios de temperatura pueden provocar una deriva axial. Asegúrese de que la temperatura en la habitación que alberga el microscopio SMLM sea estable durante toda la medición.
  5. Determine la altura del núcleo cambiando el enfoque con el z-drive del microscopio y registrando la posición de los límites superior e inferior.
  6. En diferentes momentos, verifique el parpadeo adecuado producido por el proceso fBALM aumentando la potencia del láser. Una vez que la muestra muestra un parpadeo estocástico adecuado, comience la adquisición de la serie de imágenes necesaria para la reconstrucción del SMLM superresuelto.
    NOTA: El microscopio utilizado para fBALM debe estar equipado con láseres de excitación adecuados para excitar el fluoróforo utilizado y que puedan generar densidades de fotones suficientemente altas para garantizar un recuento suficiente de fotones por fotograma. Pruebe esto en un experimento piloto antes de todos los demás experimentos.
  7. Una vez que se haya asegurado el parpadeo adecuado del proceso fBALM, comience la adquisición de la serie de imágenes utilizando un tiempo de exposición de 50 ms, lo que da como resultado una velocidad de fotogramas de ~ 20 fps.
  8. Tome una pila z a través del núcleo (alrededor de la sección media) con intervalos de paso de 200 nm y solo 500 cuadros por sección óptica de luz. De vuelta en la sección media, tome una serie de imágenes de 50,000 cuadros para recopilar suficientes eventos parpadeantes para una buena reconstrucción de los detalles estructurales con alta precisión de localización (esto tomará ~ 45 min).
    NOTA: La pila z es importante para determinar la fracción de la señal de ADN de la sección media con respecto a todo el núcleo. Asegúrese de que el tamaño de píxel efectivo sea adecuado para SMLM22 y que la señal de la cámara no sature el sensor.
  9. Asegúrese de que se cumplan los siguientes requisitos
    1. Asegúrese de que el equipo de adquisición contiene suficiente espacio en disco, ya que, dependiendo del número y el tamaño de las imágenes de 16 bits, los tamaños de archivo de las pilas de imágenes pueden llegar a ser bastante grandes.
    2. Asegúrese de que el equipo que ejecuta el software de adquisición pueda manejar un sistema de archivos en el dispositivo de almacenamiento utilizado capaz de manejar archivos de gran tamaño (>4 GB) y que la velocidad de transferencia al dispositivo de almacenamiento sea lo suficientemente alta como para escribir los archivos en tiempo real al grabar directamente datos de imagen en el dispositivo de almacenamiento.
    3. Al guardar los datos después de la adquisición de imágenes, asegúrese de que el ordenador esté equipado con suficiente RAM (por ejemplo, 64 GB).

5. Preparación y registro de una placa con perlas fluorescentes para la calibración z del microscopio SMLM

NOTA: Para una calibración axial adecuada de las lentes astigmáticas del microscopio para asignar ubicaciones correctas a lo largo del eje óptico, se debe considerar el registro de pilas z de perlas fluorescentes de 100 nm.

  1. Diluya las perlas 1:10.000 en 1x DPBS y siembre las perlas de 100 nm en el mismo tipo de plato utilizado para las mediciones SMLM.
    NOTA: Utilice únicamente la mejor calidad óptica y especificaciones, como los cubreobjetos #1.5.
  2. Monte el plato de calibración en el microscopio; Grabe las pilas de imágenes a través del plano focal de las perlas (~ 1,5 μm en total; pasos de 10 nm utilizados aquí)15.
  3. Transfiera los datos al equipo de análisis de datos.
    NOTA: No almacene ni utilice las correderas de calibración durante mucho tiempo.

6. Tratamiento de datos SMLM

NOTA: El plug-in de ImageJ23 "ThunderSTORM"24 se utilizó para el registro de las localizaciones (por ejemplo, conversión de los puntos parpadeantes en la pila de imágenes en una lista que contiene coordenadas de localización, número de fotograma, etc.). ImageJ o Fiji25 se ejecuta en todos los principales sistemas operativos de escritorio (Linux / Windows / macOS) y se puede descargar y usar de forma gratuita.

  1. Para usar ThunderSTORM en Fiji, asegúrese de agregar el sitio de actualización del laboratorio de Hohlbein en AYUDA | Actualización | Administrar sitios de actualización, marque la casilla de verificación del laboratorio de Hohlbein y reinicie Fiji. Asegúrese de que el programa tenga acceso a suficiente memoria.
    NOTA: Los datos de la imagen deben estar en un formato de archivo que pueda ser leído por ImageJ/Fiji. Al registrar los datos en un sistema comercial estándar, abra directamente los datos utilizando el complemento Bio-Formats para ImageJ (que viene automáticamente con Fiji). En este caso, se utilizó un script de MATLAB h52tif.m (proporcionado en la página de GitHub mencionada al principio del protocolo) para convertir los datos registrados registrados por nuestra configuración personalizada del formato hdf5 al formato TIFF.
    1. Dependiendo de la cantidad de memoria disponible en el sistema utilizado y la cantidad de fotogramas que se grabarán, divida los datos en varias subpilas para evitar quedarse sin memoria.
      NOTA: A continuación, se utilizan los ajustes que se utilizaron para extraer los datos que se muestran en la sección de resultados. Para obtener una explicación más detallada de la configuración de ThunderSTORM, consulte los tutoriales de ThunderSTORM, que se pueden encontrar en línea.
  2. Optimice la configuración para la detección de señales parpadeantes adaptando la configuración de ThunderSTORM de acuerdo con las condiciones de grabación deseadas. Haga clic en ThunderSTORM | Ejecute Análisis, elija Configuración de cámara e introduzca el tamaño de píxel correcto de los datos de imagen, el recuento de A/D, la eficiencia cuántica de la cámara utilizada, el nivel base y la ganancia EM (para esta configuración, tamaño de píxel: 65 nm, recuento de A/D: 0,64, eficiencia cuántica: 0,8).
  3. A continuación, elija el algoritmo para determinar las coordenadas de localización ajustando las señales parpadeantes. En la sección Filtrado de imágenes , utilice el filtro Wavelet (B-Spline) con un orden B-Spline 3 y una escala B-Spline 2.0. Para las demás configuraciones, establezca Método de localización aproximada de moléculas en Máximo local, Umbral de intensidad máxima en 2*std(Wave.F1) y Conectividad en 8-vecindad. En la sección Localización de moléculas de subpíxeles , elija PSF: Gaussiano integrado, Radio de ajuste [px]: 3, Método de ajuste: Máxima verosimilitud y Sigma inicial [px]: 1,6.
  4. Ejecute el complemento para crear una tabla que contenga una entrada para cada localización detectada y sus propiedades. Guarde la tabla en el disco duro.
  5. Si es necesario analizar varias pilas de imágenes o si las pilas de imágenes deben dividirse en varias pilas (por ejemplo, para permitir el análisis de grandes conjuntos de datos o en caso de que no haya mucha memoria disponible en la computadora de análisis de datos), automatice la detección de localización ejecutando una macro.
  6. Si los datos de adquisición tuvieran que particionarse en varias pilas de imágenes, concatene las tablas de localización en ThunderSTORM importando un archivo tras otro. Asegúrese de que la opción Anexar a la tabla actual del menú Importar esté activada y de que se utilice el número inicial correcto para evitar sobrescribir las localizaciones en la tabla.
  7. Una vez que se haya generado la tabla de localización completa, verifique el resultado reconstruyendo la imagen a partir de las ubicaciones en la tabla de resultados. Presione el botón Visualización en la ventana de resultados de ThunderSTORM y espere a que aparezca la imagen reconstruida (por ejemplo, el histograma de las localizaciones).
  8. Verifique la imagen reconstruida en busca de problemas como deriva lateral y otros artefactos de imagen. Mida y corrija la deriva en el submenú Deriva determinando la correlación cruzada de las subsecciones sumadas de la pila de datos (utilizada aquí) o utilizando marcadores fiduciales en la muestra. Después de presionar el menú >> , ingrese 5 contenedores y el factor de aumento (6.5 en este protocolo). Espere a que aparezca una ventana que muestre la deriva x e y.
    NOTA: Las primeras imágenes después de la grabación aún pueden sufrir una fuerte fluorescencia de fondo (mientras llevan los fluoróforos al estado oscuro); por lo tanto, puede ser necesario excluir las primeras doscientas imágenes del análisis (por ejemplo, escriba "fotograma >500" en el campo Filtro en la ventana principal de ThunderSTORM).
  9. Para evitar el recuento excesivo de señales que son visibles en varios fotogramas consecutivos, aplique la fusión a los datos de localización utilizando un radio que considere la precisión de localización promedio (20 nm aquí), 1 fotograma oscuro y 0 fotogramas máximos (sin restricción en el tiempo máximo de encendido de una molécula).
  10. Si solo se debe analizar una sección ultradelgada óptica de luz delgada, excluya todas las localizaciones por encima y por debajo del plano focal del conjunto de datos. En primer lugar, busque el punto en z que contiene la mayor cantidad de localización presionando Trazar histograma en la ventana que contiene la tabla de resultados y, a continuación, descarte las localizaciones 50 nm por encima y por debajo de este punto mediante el comando de filtrado:
    z > "pico de histograma" - 50 y z < "pico de histograma" + 50
  11. Para determinar la fracción de ADN en la sección grabada, determine las localizaciones en cada plano de la pila de imágenes (espesor 200 nm; 100 nm en cada lado) registradas en el paso 4.7.1. Abra la primera tabla de resultados de localización de la pila seleccionando complementos | Tormenta de truenos | Importación/Exportación | Importe los resultados y filtre cada segmento registrado a 200 nm. Para ello, haga clic en Aplicar después de escribir en el campo de filtro:
    z > -100 y z < 100
  12. Haga clic en Visualización y elija la opción Histogramas para generar una imagen de cada rebanada. Guarde la imagen resultante en una carpeta en formato TIFF. Cierre todas las imágenes abiertas. Repita esto para todos los planos de la imagen.
  13. Abra todos los sectores y combínelos usando Imagen | Pilas | Imágenes para apilar. Elegir imagen | Pilas | Z-Project y elija la opción Suma . Abra el Administrador de ROI en ImageJ (Analizar | Herramientas | Gerente de ROI); luego, elija la herramienta Selección de polígonos de la barra de herramientas ImageJ en la ventana principal de ImageJ y delinee el núcleo. Haga clic en Agregar en el Administrador de ROI.
    1. Haga clic en Analizar | Establezca Medidas y seleccione Densidad integrada. Haga clic en Analizar | Medir. En ThunderSTORM, abra la tabla de resultados del plano central como se describe anteriormente y fíltrela a un espesor de 100 nm usando el siguiente comando en el campo de filtro:
      z > -50 y z < 50
  14. Genere un histograma de las localizaciones filtradas como se describe anteriormente, active el ROI definido seleccionándolo en el Administrador de ROI y haga clic en Analizar | Medir.
  15. Determine la fracción de las localizaciones en la sección media de 100 nm de espesor en relación con el número total de localizaciones dividiendo las densidades integradas medidas, el factor de conversión necesario en el paso 8.2 para calcular las densidades absolutas de ADN.
    NOTA: El contenido de ADN es proporcional al número de localizaciones. Por lo tanto, para estimar la fracción de ADN en la imagen de superresolución (sección media) es suficiente determinar el número total de localizaciones en todo el volumen de todo el núcleo y determinar el número total de localizaciones en la sección de interés. Esto se puede lograr generando histogramas 2D de las localizaciones.

7. Calibración Z del microscopio SMLM

  1. Abra las pilas de imágenes grabadas en la sección 5 en Fiji.
  2. En el menú del complemento ThunderSTORM, seleccione el submenú de calibración 3D | Calibración de lentes cilíndricas.
  3. Introduzca el tamaño de paso utilizado para registrar los datos de calibración (10 nm) y defina el área de la pila de imágenes que se utilizará para la calibración.
  4. Especifique una ubicación para guardar el archivo de calibración.
  5. Utilice los datos de calibración de la ventana de diálogo Ejecutar análisis seleccionando PSF: Gaussiano elíptico (astigmatismo 3D) en el panel Localización de moléculas de subpíxeles y ajustando la ruta del archivo al archivo de calibración creado en la sección 5.

8. Teselación de Voronoi

NOTA: Una vez que se haya generado y preparado la tabla de localización, continúe con el último paso del análisis de imágenes: la teselación de Voronoi. Utilice MATLAB 2021 para este paso; los scripts de MATLAB forman parte del paquete de software "Localization Analyzer for Nanoscale Distributions" (LAND) y se pueden descargar desde los enlaces de la tabla de materiales. Al igual que el registro de los datos y la generación de la tabla de localización, es importante utilizar un sistema que esté bien equipado con memoria y potencia de procesamiento. El sistema utilizado para generar las imágenes para esta publicación estaba equipado con 128 GB de RAM y una CPU Intel i9 de 9 núcleos.

  1. Convierta la tabla de localización de ThunderSTORM del formato .csv al formato Orte ejecutando el script de MATLAB "TS2Orte.m", que transforma la tabla de localización en una matriz de MATLAB y la guarda en el formato ".mat".
  2. Una vez que los datos estén en el formato correcto, comience los preparativos para el teselado de Voronoi y el cálculo de la densidad del ADN. Calcule el factor de conversión dividiendo el número de pares de bases en el núcleo por el número relativo de localizaciones en la sección de la imagen con respecto al volumen (consulte el paso 6.15). Vaya a la carpeta LAND-Voronoi y en la subcarpeta /coreAlgorithm , abra el archivo voronoiCluster.m y ajuste el factor de conversión para los cálculos de densidad absoluta en la línea 13.
    NOTA: Consulte la Figura 5 para ver un ejemplo del núcleo G1 HeLa; Se midió un factor de conversión de 265.
  3. Edite el script que inicia el análisis "VonoRoi.m". Ajuste la ruta del archivo a los datos de localización de Orte y la carpeta de salida de los archivos de resultados. En la lista de coordenadas, especifique las coordenadas que definen el área en la que se debe realizar la triangulación. Como la teselación de Voronoi puede tardar mucho tiempo en calcularse (según las especificaciones de la máquina utilizada), defina varias áreas para calcular dentro del mismo conjunto de datos de entrada.
  4. Después de ejecutar el script, busque la imagen que muestra las densidades absolutas de ADN junto con otros archivos que contienen gráficos que muestran el histograma de la distribución del área y un archivo "densities.mat" que contiene las densidades de cada celda de Voronoi calculada en la carpeta de salida.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El núcleo HeLa que se muestra en la Figura 5 se eligió de la tabla generada por CellProfiler4.2.1 en la sección 3 para tener una intensidad de fluorescencia integrada cercana al primer pico en el histograma que se muestra en la Figura 5 que representa los núcleos en la fase G1 . Dado su pequeño tamaño y su pronunciada estructura interna, es probable que sea un núcleo G1 temprano que todavía está en proceso ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe cómo medir las densidades absolutas de ADN en núcleos de células de mamíferos utilizando SMLM. Además, hemos demostrado cómo determinar la etapa del ciclo celular de las células cultivadas y cómo utilizar esta información para estimar la cantidad de ADN presente en una sección óptica ultradelgada ligera. También se describe en detalle la preparación de células adherentes para la microscopía fBALM SMLM y cómo procesar los datos de SMLM para generar imágenes microscó...

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Disclosures

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Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a la Dra. Sandra Ritz por permitirnos usar la instalación central de imágenes de IMB, al Dr. Shih-Ya Chen por permitirnos usar su microscopio SMLM personalizado, al Dr. Leonard Kubben (IMB) por proporcionar fibroblastos humanos, al Dr. Christof Niehrs (IMB) por proporcionar la línea celular C3H10T1/2 y al Dr. Jan Neumann por el MATLAB-Script que hemos modificado para este trabajo. También queremos agradecer a la Dra. Marion Cremer, al Dr. Thomas Cremer y al Dr. Christoph Cremer por sus fructíferas discusiones.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cultivo celular
Antena µ 35 mm, fondo de vidrio Grid-500 altoIbidi81168
C3H 10T1/2IMB (Niehrs Lab)
DMEMThermoFisher12320032
dPBSThermoFisher14190144
FBSTecnologías de la vida16000-044
HelaInstalación Núcleo de Microscopía (IMB)
HFBIMB (Laboratorio Kubben)
L-GlutaminaSigma-AldrichG7513
Aminoácidos no esenciales y vitaminas para HFB
Piruvato de sodioS8636
Preparación de muestras
CatalasaMerck2593710
GlucosaThermoFisher241922500
Glucosa oxidasaMerck49180
ParaformaldehidoSigma-Aldrich158127
Cóctel RNasaThermoFisherAM2286
SYTOX OrangeThermoFisherS11368
Kit de muestreo de microesferas fluorescentes TetraSpeckThermoFisherT7284
Triton X-100ThermoFisher327372500
Software
BioFormatosOpenMicroscopy.orgsoftware de código abierto https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgsoftware de código abierto https://cellprofiler.org
Fijinih.govsoftware de código abierto https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
TIERRAnih.govsoftware de código abierto https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021Matemáticas Funcionasoftware comercial - requiere "Caja de herramientas de procesamiento de imágenes"
R v.4.. 0.3r-project.orgsoftware de código abierto https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3software de código abierto https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Microscopios:
AF 7000Leica
Leica GSDLeica
Microscopio SMLMLaboratorio Cremerconstruido a medida por el Dr. S-Y. Chen

References

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