Purificación de polisomas a partir de nódulos simbióticos de soja

María  Martha Sainz; Carla Valeria Filippi; Guillermo Eastman; Mariana Sotelo-Silveira; C. Mauro Martinez; Omar Borsani; José Sotelo-Silveira

doi:10.3791/64269

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Artículo de método

Purificación de polisomas a partir de nódulos simbióticos de soja

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DOI:

10.3791/64269

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1 de julio de 2022

María Martha Sainz¹ , Carla Valeria Filippi¹ , Guillermo Eastman²^,³ , Mariana Sotelo-Silveira¹ , C. Mauro Martinez¹ , Omar Borsani¹ , José Sotelo-Silveira²^,⁴

¹Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, ²Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, ³Department of Biology, University of Virginia, ⁴Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos de soja intactos. Después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para identificar genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo.

Resumen

El objetivo de este protocolo es proporcionar una estrategia para estudiar el translatomo eucariota del nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este documento describe métodos optimizados para aislar polirribosomas derivados de plantas y sus ARNm asociados para ser analizados mediante secuenciación de ARN. En primer lugar, los lisados citoplasmáticos se obtienen mediante homogeneización en condiciones de preservación de polisomas y ARN a partir de nódulos de soja enteros congelados. Luego, los lisados se eliminan por centrifugación a baja velocidad, y el 15% del sobrenadante se usa para el aislamiento de ARN total (TOTAL). El lisado eliminado restante se utiliza para aislar polisomas por ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa de dos capas (12% y 33,5%). El ARNm asociado a polisomas (PAR) se purifica a partir de gránulos polisomales después de la resuspensión. Tanto TOTAL como PAR se evalúan mediante electroforesis capilar altamente sensible para cumplir con los estándares de calidad de las bibliotecas de secuenciación para RNA-seq. Como ejemplo de una aplicación posterior, después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para obtener genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo. En resumen, este método, en combinación con RNA-seq, permite estudiar la regulación traslacional de los ARNm eucariotas en un tejido complejo como es el nódulo simbiótico.

Introducción

Las plantas leguminosas, como la soja (Glycine max), pueden establecer simbiosis con bacterias específicas del suelo llamadas rizobios. Esta relación mutualista provoca la formación de nuevos órganos, los nódulos simbióticos, en las raíces de las plantas. Los nódulos son los órganos de la planta que albergan las bacterias y consisten en células huésped cuyo citoplasma está colonizado con una forma especializada de rizobios llamados bacteroides. Estos bacteroides catalizan la reducción del nitrógeno atmosférico (_N2) en amoníaco, que se transfiere a la planta a cambio de carbohidratos ^1,2.