Aquí, describimos un protocolo para visualizar células proliferantes similares a tallos en la medusa Cladonema. La hibridación in situ fluorescente de montaje completo con un marcador de células madre permite la detección de células madre, y el etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina permite la identificación de células en proliferación. Juntas, se pueden detectar células similares a la proliferación activa.
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Artículo de método
Hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum
En este artículo
Resumen
Resumen
Los cnidarios, incluidas las anémonas de mar, los corales y las medusas, exhiben una morfología y estilos de vida diversos que se manifiestan en pólipos sésiles y medusas que nadan libremente. Como se ejemplifica en modelos establecidos como Hydra y Nematostella, las células madre y / o células proliferativas contribuyen al desarrollo y regeneración de pólipos cnidarios. Sin embargo, los mecanismos celulares subyacentes en la mayoría de las medusas, particularmente en la etapa de medusa, son en gran medida poco claros y, por lo tanto, es fundamental desarrollar un método sólido para identificar tipos de células específicas. Este artículo describe un protocolo para visualizar células proliferantes similares a tallos en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum. Cladonema medusae posee tentáculos ramificados que crecen continuamente y mantienen la capacidad regenerativa a lo largo de su etapa adulta, proporcionando una plataforma única con la que estudiar los mecanismos celulares orquestados por la proliferación y / o células madre. La hibridación in situ fluorescente de montaje completo (FISH) utilizando un marcador de células madre permite la detección de células madre, mientras que el marcado de pulsos con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), un marcador de fase S, permite la identificación de células en proliferación. Combinando el etiquetado de FISH y EdU, podemos detectar células madre que proliferan activamente en animales fijos, y esta técnica se puede aplicar ampliamente a otros animales, incluidas las especies de medusas no modelo.
Introducción
Cnidaria es considerado un filo metazoario de ramificación basal que contiene animales con nervios y músculos, colocándolos en una posición única para comprender la evolución del desarrollo y la fisiología animal 1,2. Los cnidarios se clasifican en dos grupos principales: los antholozoos (por ejemplo, las anémonas de mar y los corales) poseen solo larvas de planula y etapas de pólipos sésiles, mientras que los medusozoos (miembros de hidrozoos, estaurozoos, esciphozoa y cubozoa) generalmente toman la forma de medusas o medusas que nadan libremente, así como larvas y pólipos de plánula. Los cnidarios comúnmente....
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Protocolo
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.
1. Síntesis de la sonda
- Extracción de ARN
- Coloque tres Cladonema medusae vivas que se cultivan en agua de mar artificial (ASW) en un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta de transferencia de 3,1 ml con la punta cortada, y retire la mayor cantidad de ASW posible.
NOTA: ASW se prepara disolviendo una mezcla de sales minerales en agua del grifo con neutralizador de cloro; la gravedad específica final (S.G.) es 1.018 o las partes por mil....
- Coloque tres Cladonema medusae vivas que se cultivan en agua de mar artificial (ASW) en un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta de transferencia de 3,1 ml con la punta cortada, y retire la mayor cantidad de ASW posible.
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Resultados
Los tentáculos de Cladonema se han utilizado como modelo para estudiar los procesos celulares de morfogénesis y regeneración15,16,17. La estructura del tentáculo está compuesta por un tubo epitelial donde las células madre, o células i, se encuentran en la región proximal, llamada bulbo del tentáculo, y se agregan nuevas ramas secuencialmente a la parte posterior de la región distal del bulbo a lo largo del lado adaxial.......
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Discusión
Las células proliferantes y las células madre son fuentes celulares importantes en diversos procesos como la morfogénesis, el crecimiento y la regeneración21,22. Este artículo describe un método para teñir conjuntamente el marcador de células madre Nanos1 mediante el etiquetado de FISH y EdU en Cladonema medusae. Trabajos previos utilizando el etiquetado de EdU o BrdU han sugerido que las células proliferativas se localizan en los bulbos del ten.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por AMED bajo el número de subvención JP22gm6110025 (a Y.N.) y por el número de subvención JSPS KAKENHI 22H02762 (a Y.N.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Wako | 137-06862 | |
| Pipeta de transferencia de 3,1 ml | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 imprimación | 5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3' | ||
| Cladonema pacificum Nanos1 imprimación | 5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGTGT -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi adelante cebador | 5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi imprimación | 5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3' | ||
| Kit de proliferación celular Click-iT EdU para imágenes, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | Kit EdU |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | neutralizador de cloro |
| DIG Kit de detección de ácido nucleico Reactivo de bloqueo | Roche | 11175041910 | tampón de bloqueo |
| Mezcla de marcaje de ARN DIG | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS célula competente DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | célula competente |
| Kit de extracción de gel/PCR de gen rápido | Kit | extracción de gel | FG-91302 |
| Mini kit de plásmido de gen rápido | FG-90502 | miniprep de plásmido | |
| Formamida | Wako | 068-00426 | |
| Sal sódica de heparina porcina | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropil-β-D(-)-tiogalactopiranósido (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | placa de agar |
| LB Base de caldo LB | Invitrogen | 12780-052 | LB |
| medio Ácido maleico | Wako | 134-00495 | |
| mini Columnas de ARN de espín rápido | Roche | 11814427001 | columna de limpieza |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop OneC con Wi-Fi | Espectrofotómetro | Thermo Scientific | ND-ONEC-W |
| Polioxietileno (20) Monolaurato de sorbitán (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogeneizador |
| Proteinasa K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| Inhibidor de RNasa | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | kit de aislamiento de ARN total |
| RQ1 RNasa libre de ARNasa | Promega | M6101 | |
| Tampón de citrato de sodio salino 20x polvo (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mezcla de sales minerales |
| T3 ARN polimerasa | Roche | 11031163001 | |
| T7 ARN polimerasa | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Incutador de hibridación |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq ADN polimerasa |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st hebra Kit de síntesis de ADNc | TaKaRa | 6210A Kit de | síntesis de ADNc |
| Clon objetivo | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| ARNt | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus cianina 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | técnica de amplificación de señal de tiramida (TSA) |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | Microscopio confocal de barrido láser |
Referencias
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire....
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Reimpresiones y permisos
