Aquí, presentamos un protocolo para un modelo de ratón de pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL). Para inducir el NIHL, desarrollamos un dispositivo nuevo y sencillo que utiliza plástico corrugado, una jaula trampa para ratas y un altavoz. Se emplearon imágenes de inmunofluorescencia y respuesta auditiva del tronco encefálico para evaluar la función auditiva y el daño de las células ciliadas externas, respectivamente.
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Artículo de método
Condiciones experimentales modificadas para la pérdida de audición inducida por ruido en ratones y evaluación de la función auditiva y el daño de las células ciliadas externas
En este artículo
Resumen
Resumen
Un modelo animal de pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL, por sus siglas en inglés) es útil para que los patólogos, terapeutas, farmacólogos e investigadores de la audición comprendan a fondo el mecanismo de NIHL y, posteriormente, optimicen las estrategias de tratamiento correspondientes. Este estudio tiene como objetivo crear un protocolo mejorado para desarrollar un modelo de ratón de NIHL. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J. Los ratones no anestesiados fueron expuestos a ruidos fuertes (1 y 6 kHz, presentados simultáneamente a 115-125 dB SPL-A) de forma continua durante 6 h al día durante 5 días consecutivos. La función auditiva se evaluó 1 día y 1 semana después de la exposición al ruido, utilizando la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR). Después de la medición de ABR, los ratones fueron sacrificados y sus órganos de Corti fueron recolectados para la tinción de inmunofluorescencia. A partir de las mediciones de la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR), se observó una pérdida auditiva significativa 1 día después de la exposición al ruido. Después de 1 semana, los umbrales de audición de los ratones experimentales disminuyeron a ~80 dB SPL, que seguía siendo un nivel significativamente más alto que el de los ratones de control (~40 dB SPL). A partir de los resultados de las imágenes de inmunofluorescencia, se demostró que las células ciliadas externas (OHC) estaban dañadas. En resumen, creamos un modelo de NIHL utilizando ratones machos C57BL/6J. Se desarrolló y luego se empleó un dispositivo nuevo y sencillo para generar y emitir ruido de tonos puros. Las mediciones cuantitativas de los umbrales de audición y la confirmación morfológica del daño de la OHC demostraron que el ruido aplicado indujo con éxito una pérdida auditiva esperada.
Introducción
Alrededor de 1.300 millones de personas en todo el mundo sufren pérdida de audición debido ala exposición al ruido. En este estudio, nuestro objetivo fue establecer un proceso claro paso a paso para inducir y confirmar la pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL). La NIHL es el resultado de una degeneración/destrucción de las células ciliadas (HC) y de las neuronas ganglionares espirales (SGN), daño en los estereocilios de HC y/o pérdida de sinapsis entre las HC internas de la coclear y las SGN. Tales anomalías también pueden causar tinnitus y deterioro de la percepción del habla (especialmente en un entorno acústico complejo) además de NIHL. ....
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Protocolo
Los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del Mackay Medical College. Se compraron ratones machos C57BL/6J de ocho semanas de edad en el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Ciudad de New Taipei, Taiwán). Todos los ratones fueron criados y alojados de acuerdo con el protocolo estándar para animales.
1. Inducción de NIHL en ratones
- Preparar la jaula para los ratones experimentales
- Para ello, utiliza una jaula trampa para ratas con unas dimensiones de 14 cm × 17 cm × 24 cm. Corta cuatro piezas de cartón corrugado en tamaños apropiados, haciendo ....
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Resultados
Un cambio en el umbral de audición de ABR
El umbral de audición de los ratones se midió utilizando ABR de ráfaga de tono 1 día o 1 semana después de la exposición al ruido. Se observó un aumento significativo en el umbral de audición en las tres frecuencias probadas (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB SPL; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB SPL) 1 día después de la exposición al ruido (es decir, el6º día). La recuperación parcial de la audición se produjo 1 semana después de la expos.......
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Discusión
El NIHL se puede dividir en dos tipos: NIHL temporal, que muestra un cambio temporal del umbral de audición, y NIHL permanente, que se caracteriza por un cambio permanente del umbral de audición. Se cree que la pérdida auditiva que observamos en el sexto día (1 día después de la exposición al ruido) es una combinación de estos dos tipos. En este caso, el umbral auditivo mostraría una recuperación gradual a lo largo del tiempo debido al componente temporal de la pérdida auditiva. En nuestros estudios experiment.......
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Divulgaciones
No hay conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos las subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) del Gobierno de Taiwán (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) y las becas de investigación intramuros del Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Juego de micrófonos estándar de campo libre CCP de 1/4" | GRAS 428158 | para la exposición al ruido | |
| Módulo de entrada de amplificador, AMI100D | BIOPAC | Para la respuesta auditiva del tronco encefálico | |
| Bioamplificador, | BIO100C BIOPAC | Para la respuesta auditiva del tronco encefálico | |
| Albúmina sérica bovina | SIGMA | A9647 | Tinción de inmunofluorescencia |
| Software Cellsens | Ciencias de la | Adquisición de imágenes | |
| Plástico | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Tinción de inmunofluorescencia |
| Ácido etilendiaminotetraacético | SIGMA | E5134 | Descalcificación |
| Amplificador de respuesta evocada, ERS100C | BIOPAC | Para la respuesta | |
| auditiva del tronco encefálicoFormaldehído | APLHA | F030410 | Fijación de coclear Sistema de adquisición de datos de |
| alto rendimiento, MP160 | BIOPAC | Para la respuesta auditiva del tronco encefálico | |
| Cable de extensión modular, | MEC110C BIOPAC | Para la respuesta auditiva del tronco encefálico | |
| Anticuerpo primario Myo7A | Proteus | 25-6790 | Tinción de inmunofluorescencia |
| Anticuerpo secundario Myo7A | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | tinción de inmunofluorescencia |
| , unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | Para la respuesta auditiva del tronco encefálico | |
| anticuerpo contra la faloidina | Alexa Fluor | A12381 | tinción de inmunofluorescencia |
| SIGMA | P4417 | ||
| Jaula | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- inyección de xilacina, solución | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Amplificador de sonido, MT-1000 | unika | Para la exposición | |
| al ruido Generador/analizador/miscelánea de sonido, FW-02 | CLIO | 620300719 | Para la exposición al ruido |
| Cámara insonorizada | Tecnología electroacústica | Para la exposición al ruido y ABR | |
| Altavoz | electroacústica IEA Para la exposición al | ruido | |
| Módulo estimulador, STM100C | BIOPAC | Para la respuesta auditiva del tronco encefálico | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Tinción de inmunofluorescencia |
| Juego de tubophone, OUT101 | BIOPAC | Para la respuesta auditiva del tronco encefálico | |
| Microscopio vertical, BX53 | Olympus | Adquisición de imágenes | |
| Zoletil | Virbac |
Referencias
- World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
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Reimpresiones y permisos
