Artículo de método

Transfección eficiente del ARNm transcrito in vitro en células cultivadas utilizando nanopartículas de péptido-poloxamina

DOI:

10.3791/64288

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17 de agosto de 2022

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1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, Third Military Medical University, 2Department of Pediatrics, Ludwig-Maximilians University of Munich, 3Department of Pharmacy, Southwest Hospital, Third Military Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Se desarrolla una nanopartícula de péptido-poloxamina autoensamblada (PP-sNp) utilizando un dispositivo de mezcla microfluídica para encapsular y entregar ARN mensajero transcrito in vitro . El ARNm/PP-sNp descrito podría transfectar eficientemente células cultivadas in vitro.

Resumen

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Las vacunas de ARN mensajero transcritas in vitro (ARNm) han mostrado un enorme potencial en la lucha contra la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Los sistemas de administración eficientes y seguros deben incluirse en las vacunas de ARNm debido a las frágiles propiedades del ARNm. Un sistema de administración de genes de nanopartículas de péptido-poloxamina autoensamblado (PP-sNp) está diseñado específicamente para la administración pulmonar de ácidos nucleicos y muestra capacidades prometedoras para mediar la transfección exitosa de ARNm. Aquí, se describe un método mejorado para preparar PP-sNp para explicar cómo el PP-sNp encapsula el ARNm de Metridia luciferase (MetLuc) y transfecta con éxito las células cultivadas. El ARNm de MetLuc se obtiene mediante un proceso de transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN lineal. Un PP-sNp se produce mezclando péptido sintético / poloxamina con solución de ARNm utilizando un mezclador microfluídico, lo que permite el autoensamblaje de PP-sNp. La carga de PP-sNp se evalúa posteriormente midiendo el potencial zeta. Mientras tanto, la polidispersidad y el tamaño hidrodinámico de las nanopartículas de PP-sNp se miden utilizando dispersión dinámica de luz. Las nanopartículas de ARNm/PP-sNp se transfieren en células cultivadas, y los sobrenadantes del cultivo celular se analizan para determinar la actividad de la luciferasa. Los resultados representativos demuestran su capacidad de transfección in vitro. Este protocolo puede arrojar luz sobre el desarrollo de sistemas de administración de vacunas de ARNm de próxima generación.

Introducción

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La vacunación ha sido anunciada como una de las intervenciones médicas más eficientes para reducir la morbilidad y mortalidad causadas por enfermedades infecciosas1. La importancia de las vacunas se ha demostrado desde el brote de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). A diferencia del concepto tradicional de inyectar patógenos inactivados o vivos atenuados, los enfoques de vacunas de última generación, como las vacunas basadas en ácidos nucleicos, se concentran en preservar las propiedades inmunoestimulantes de los patógenos objetivo al tiempo que evitan los posibles problemas de seguridad asociados con el virus microbiano completo con....

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Protocolo

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1. Transcripción in vitro de ARNm modificado químicamente

NOTA: Se requiere el uso de tubos libres de nucleasa, reactivos, cristalería, puntas de pipeta, etc., porque las RNasas son omnipresentes en el medio ambiente, como soluciones de laboratorio, superficies de instrumentos, cabello, piel, polvo, etc. Limpie bien las superficies y pipetas del banco antes de usarlas, y use guantes para evitar la contaminación por RNasa.

  1. Realizar la linealización de la plantilla de ADN.
    1. Sintetizar el marco de lectura abierto (ORF) de Metridia luciferasa (MetLuc) flanqueado por un promotor de polimerasa T7, colas d....

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Resultados

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El plásmido recombinante fue digerido para producir la plantilla de ADN linealizado (Figura 2A). Utilizando el protocolo descrito, el kit de transcripción in vitro T7 puede producir hasta 80-120 μg de ARNm MetLuc sin tapa por reacción de 20 μL y 50-60 μg de ARNm de MetLuc tapado por reacción de 100 μL. Cuando se analiza con electroforesis, el ARNm de MetLuc intacto con alta calidad debe mostrar una banda única y clara, como se muestra en la Figura 2B. L.......

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Discusión

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El protocolo descrito aquí no solo permite la producción rentable y rápida de formulaciones de vacunas de ARNm IVT con propiedades definidas, sino que también ofrece la posibilidad de personalizar la formulación de PP-sNp de acuerdo con fines terapéuticos específicos, como la terapia génica. Con el fin de garantizar la generación exitosa de ARNm / PP-sNp IVT, se sugiere prestar especial atención a algunos pasos críticos. Cuando trabaje con ARNm, recuerde siempre que las condiciones libres de RNasa deben mantenerse durant.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, Subvención No. 82041045 y 82173764), el principal proyecto de Estudio sobre el Sistema de Tecnología de Patogénesis y Prevención de Epidemias (2021YFC2302500) por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China, el Proyecto Chongqing Talents: Exceptional Young Talents (CQYC202005027) y la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Los autores agradecen al Dr. Xiaoyan Ding por medir el diámetro hidrodinámico (nm) y el índice de polidispersidad (PDI).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BamHITakara1010
cap 1 sistema de taponadoJinanM082
Línea celular dendríticaSigmaSCC142
Secuencia de ADNGenescript
Células epiteliales bronquiales humanasSigmaSCC150
KpnITakara1068
LPBeyotimeC0533
Cloruro de litioAPEXBioB6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90MalvernNB007605
chip microfluídicoZHONGXINQIHENGChip
Lectores de microplacasThermoFisherVarioskan lux
NanoDrop OneThermoFisherND-ONE-W (A30221)
Agua sin nucleasasThermoFisherAM9932
OptiMEMGibco31985070
Penicilina-estreptomicinaGibco15140122
PseudouridinaAPE× BioB7972
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Quanti-LucInvivoGenRep-qlc2
RiboRuler Escalera de ARN de alto rangoThermoFisherSM1821
Tubo cónico sin ARNasaBiosharpBS-100-M
RPMI Medio 1640ThermoFisherC11875500BT
Bomba de jeringaChemyxFusion 101
T7 Kit de transcripciónJinanE131
PDMS estándar

Referencias

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  1. Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020).
  2. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
  3. Mulligan, M. J., et al.....

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