El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.
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Artículo de método
In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D
En este artículo
Resumen
Resumen
Como ingrediente principal de las vacunas, los adyuvantes pueden inducir o mejorar directamente las respuestas inmunes potentes, generalizadas, innatas y adaptativas asociadas con los antígenos. Se ha encontrado que la ofiopogonina D (OP-D), un componente purificado extraído de la planta Ophiopogon japonicus, es útil como adyuvante de la vacuna. Los problemas de la baja solubilidad y toxicidad de OP-D se pueden superar eficazmente mediante el uso de un método de emulsificación de baja energía para preparar la nanoemulsión de ofiopogonina D (NOD). En este artículo, se examinan una serie de protocolos in vitro para la evaluación de la actividad celular. Los efectos citotóxicos de L929 se determinaron mediante un ensayo de kit de conteo celular-8. Luego, los niveles de citoquinas secretadas y el número de células inmunes correspondientes después de la estimulación y el cultivo de esplenocitos de ratones inmunizados se detectaron mediante métodos ELISA y ELISpot. Además, la capacidad de absorción de antígenos en células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC), que se aislaron de ratones C57BL / 6 y maduraron después de la incubación con GM-CSF más IL-4, se observó mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM). Es importante destacar que la activación de los macrófagos se confirmó midiendo los niveles de IL-1β, IL-6 y citoquinas del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) mediante kits ELISA después de cocultivar macrófagos peritoneales (PM) de ratones en blanco con el adyuvante durante 24 h. Se espera que este protocolo proporcione a otros investigadores enfoques experimentales directos y efectivos para evaluar la eficacia de la respuesta celular de los nuevos adyuvantes de vacunas.
Introducción
Las vacunas son un medio importante para prevenir y tratar las enfermedades infecciosas y no transmisibles. La adición adecuada de adyuvantes y vehículos de administración a las formulaciones de vacunas es beneficiosa para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos y generar respuestas inmunes duraderas1. Además del alumbre adyuvante clásico (sal de aluminio), hay seis tipos de adyuvantes para vacunas que se comercializan actualmente: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 y Matrix-M
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Protocolo
Todos los experimentos celulares se realizaron en un laboratorio de ingeniería celular equipado con quirófanos básicos, salas de amortiguación, salas de cultivo estéril y salas de identificación y análisis. El entorno y las condiciones de trabajo estaban libres de contaminación microbiana y otros factores nocivos. Los experimentos con animales se llevaron a cabo con base en las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar.
1. Autoclave y preparación de materiales
- Preparar lo....
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Resultados
La evaluación de la actividad celular de los adyuvantes OP-D y NOD se completó in vitro de acuerdo con el protocolo. Los fibroblastos L929 son un modelo de cribado útil para los ensayos de toxicidad in vitro de la NOD (Figura 1). La cuantificación de los niveles de citoquinas inflamatorias en el bazo puede ayudar a los investigadores a comprender mejor la respuesta inmune (Figura 2). La monitorización de CTL con ELISpot es el estándar de oro pa.......
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Discusión
Las vacunas de subunidades proporcionan una excelente seguridad pero una inmunogenicidad deficiente. La estrategia principal para mejorar la inmunogenicidad es adsorber físicamente o acoplar antígenos con adyuvantes e incorporarlos a los sistemas de administración de fármacos para promover la absorción y presentación por parte de las DC. Las saponinas vegetales naturales como la saponina quillaia y sus derivados son altamente tóxicas y no son adecuadas para el desarrollo de vacunas humanas17. Por .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses financieros o personales en competencia que podrían haber influido en el trabajo reportado en este documento.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la subvención No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China, subvenciones No. 31670938, 32070924, 82041045 y 32000651 del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, subvenciones No. 2014jcyjA0107 y No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing, subvención No. CYS21519 del Proyecto de Investigación e Innovación de Postgrado de Chongqing, subvención No. 2020XBK24 de los proyectos especiales de la Universidad Médica del Ejército, y subvención No. 202090031021 del Programa Nacional de Innovación y Emprendimiento para estudiant....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.25% Tripsina-EDTA (1x) | GIBCO, EE. UU. | 25200056 | |
| placas de filtro de 96 pocillos | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, EE. UU. | ||
| null Contador de células automatizado | Countstar, China | IC1000 | |
| ratones BALB/c y ratones C57BL/6 | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | nulo | |
| triglicérido caprílico/cáprico (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Pekín, China | null | |
| Kits CCK-8 | Dojindo, Japón | CK04 | |
| Placa de recuento de células | Costar, Corning, EE. UU. | CO010101 | |
| Tamiz de células | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrífuga 5810 R | Eppendorf, Alemania | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | D9542 | |
| DMEM básico (1x) medio | GIBCO, EE. UU. | C11885500BT | |
| DSZ5000X Microscopio invertido | Nikon, Japón | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Alemania | ELR06 | |
| Suero fetal bovino | GIBCO, EE. UU. | 10099141C | |
| Lector de microplacas con todas las funciones Thermo | Fisher Scientific, EE. UU. | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, EE. UU | ||
| Granulocitos Macrófagos Factor estimulante de colonias GM-CSF | , R& D Systems, EE. UU. | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, EE. UU. | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Suiza | null | |
| IL-4 | PeproTech, EE. UU. | 042149 | |
| línea celular L929 | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clon 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Microscopía confocal de escaneo láser | Zeiss, Alemania | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, Francia | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, Francia | 36372K | |
| Ratón IFN-γ Kit ELISA | Dakewe, China | 1210002 | |
| Ratón IFN-γ Kit ELISPOT prerrevestido | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Ratón IL-17A Kit ELISA | Dakewe, China | 1211702 | |
| Ratón IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, Estados Unidos | 3521-4HPW-2 | |
| Ratón IL-1β Kit de ELISA | Dakewe, China | 1210122 | |
| Ratón IL-6 Kit de ELISA | Dakewe, China | 1210602 | |
| Ratón TNF-α Kit ELISA | Dakewe, China | 1217202 Aminoácidos | |
| no esenciales (100x) | Invitrogen, EE. UU. | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Invitrogen, EE. UU. | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Fosfato Solución salina tamponada | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medio | Hyclone (Life Technology), EE. UU. | SH30809.01 | |
| Piruvato de sodio (100 mM) | Invitrogen, EE. UU. | 11360070 | |
| Escualeno | Sigma, EE. UU | S3626 | |
| β- Mercaptoetanol | Invitrogen, Estados Unidos | 21985023 |
Referencias
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeuti....
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Reimpresiones y permisos
