Aquí, presentamos métodos detallados para la preparación y evaluación de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo.
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Artículo de método
Preparación, características, toxicidad y evaluación de la eficacia de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Los péptidos epítopos han atraído una atención generalizada en el campo de las vacunas tumorales debido a su seguridad, alta especificidad y producción conveniente; en particular, algunos epítopos restringidos por MHC I pueden inducir una actividad efectiva de linfocitos T citotóxicos para eliminar las células tumorales. Además, la administración nasal es una técnica de administración efectiva y segura para las vacunas tumorales debido a su conveniencia y mejora el cumplimiento del paciente. Sin embargo, los péptidos de epítopos no son adecuados para la administración nasal debido a su pobre inmunogenicidad y falta de eficiencia de administración. Las nanoemulsiones (NE) son sistemas termodinámicamente estables que pueden cargarse con antígenos y administrarse directamente a la superficie de la mucosa nasal. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) es el pentapéptido central de la laminina, un péptido de unión a integrina expresado por las células epiteliales respiratorias humanas. En este estudio, se preparó una vacuna intranasal autoensamblada para el tumor NE del péptido epítopo que contiene el péptido sintético IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) mediante un método de emulsificación de baja energía. La combinación de IKVAV y OVA257-264 puede mejorar la captación de antígenos por las células epiteliales de la mucosa nasal. Aquí, establecemos un protocolo para estudiar las características fisicoquímicas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) y dispersión dinámica de luz (DLS); estabilidad en presencia de proteína mucina; toxicidad mediante el examen de la viabilidad celular de las células BEAS-2B y los tejidos nasales y pulmonares de ratones C57BL/6; captación celular por microscopía de barrido láser confocal (CLSM); perfiles de liberación mediante imágenes de animales pequeños in vivo; y el efecto protector y terapéutico de la vacuna mediante el uso de un modelo portador de tumores E.G7. Anticipamos que el protocolo proporcionará pistas técnicas y teóricas para el desarrollo futuro de nuevas vacunas mucosas de péptidos de epítopos de células T.
Introducción
Como una de las innovaciones de salud pública más importantes, las vacunas desempeñan un papel clave en la lucha contra la carga mundial de enfermedades humanas1. Por ejemplo, en la actualidad, se están probando más de 120 vacunas candidatas para enfermedades COVID-19, algunas de las cuales han sido aprobadas en muchos países2. Informes recientes afirman que las vacunas contra el cáncer han mejorado efectivamente el progreso de los tratamientos clínicos contra el cáncer porque dirigen el sistema inmunológico de los pacientes con cáncer para reconocer los antígenos como extraños al cuerpo3. Además,....
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Protocolo
Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para la revisión ética del bienestar animal (GB / T 35892-2018) y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar. Los ratones fueron sacrificados por una inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de pentobarbital de sodio al 1%.
1. Preparación del I-OVA NE
- Mezcle 1 mg de monofosforilo lípido A (MPLA) con 100 μL de DMSO, vórtice durante 5 min, y deje reposar durante 4 h a temperatura ambiente (RT) para que se disuelva por completo.
- Agregue Tween 80 e I-OVA cua....
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Resultados
De acuerdo con el protocolo, completamos la preparación y la evaluación experimental in vitro e in vivo de la administración de la nanovacuna tumoral nasal. TEM, AFM y DLS son medios eficaces para la evaluación de las características básicas del potencial zeta superficial y el tamaño de partícula de la nanovacuna (Figura 1). Las células epiteliales BEAS-2B son un modelo de cribado útil para las pruebas de toxicidad in vitro de vacunas nasales (.......
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Discusión
Las nanovacunas funcionalizadas con membranas de inmunocitos tienen grandes ventajas en la terapia dirigida a la enfermedad, y los efectos secundarios se minimizan por propiedades tales como tropismo tumoral único, la identificación de objetivos específicos, circulación prolongada, interacciones intercelulares mejoradas y baja toxicidad sistémica. También se pueden integrar fácilmente con otros módulos de tratamiento para tratar cánceres de forma cooperativa16,20.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contradictorias conocidos que podrían haber parecido influir en el trabajo reportado en este documento.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el No. 31670938, 32070924, 32000651 del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, No. 2014jcyjA0107 y No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing, No. 2020XBK24 y No. 2020XBK26 de los proyectos especiales de la Universidad Médica del Ejército, y No. 202090031021 y No. 202090031035 del Programa Nacional de Innovación y Emprendimiento para estudiantes universitarios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de 96 pocillos | Corning Incorporated, EE. UU. | CLS3922 | |
| Lector de microplacas Bio-Rad 6.0 | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, EE. UU | . Kits Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 | Dojindo, Japón | Centrífuga CK04 | |
| 5810 R | Eppendorf, Alemania | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | D9542 | |
| suero fetal bovino (FBS) | Hyclone (Life Technology, EE. UU.) | SH30088.03 | |
| I-OVA marcado con FITC | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | ||
| HF 90/240 Incubadora Heal | Force, Suiza | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Microscopio invertido | Nikon, Japón | DSZ5000X | |
| IPC-208 Universidad de | Chong Qing, China | NA | |
| Sistema IVIS | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., Reino Unido | NA | |
| MPLA& | nbsp; Invivogen Lit. Co. | tlrl-mpla | |
| Pomada de sulfato de neomicina | Shanghai CP General Pharmaceutical Co., Ltd. | ||
| OVA257– 264 | Shanghái Botai Biotechnology Co., Ltd. | ||
| RPMI 1640 medio | Hyclone (Life Technology, EE. UU.) | SH30809.01 | |
| Conjugación de péptido sintético (I-OVA) de IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Zeiss LSM800 microscopio de fluorescencia confocal de barrido láser | Zeiss, Alemania | Zeiss LSM800 |
Referencias
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al.
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Reimpresiones y permisos
