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Artículo de método

Implantes de cabeza para la neuroimagen de ratas despiertas con la cabeza fija

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DOI:

10.3791/64324

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7 de septiembre de 2022

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1Department of Neurobiology and Behavior, School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of California, Irvine, 33Center for Neurobiology of Learning and Memory, University of California, Irvine

En este artículo

Resumen

Se describe un nuevo procedimiento detallado para la obtención de imágenes funcionales de ratas despiertas con la cabeza fija.

Resumen

Los anestésicos, comúnmente utilizados en la investigación científica preclínica y fundamental, tienen una influencia depresiva en las funciones metabólicas, neuronales y vasculares del cerebro y pueden influir negativamente en los resultados neurofisiológicos. El uso de animales despiertos para estudios de investigación es ventajoso, pero plantea el gran desafío de mantener a los animales tranquilos y estacionarios para minimizar los artefactos de movimiento a lo largo de la adquisición de datos. Las imágenes despiertas en roedores de menor tamaño (por ejemplo, ratones) son muy comunes, pero siguen siendo escasas en ratas, ya que las ratas son más grandes, más fuertes y tienen una mayor tendencia a oponerse a las restricciones de movimiento y la fijación de la cabeza durante los largos períodos requeridos para obtener imágenes. Se describe un nuevo modelo de neuroimagen de ratas despiertas con la cabeza fija utilizando eslingas cosidas a mano personalizadas, implantes de cabeza impresos en 3D, gorras para la cabeza y un marco para la cabeza. Los resultados adquiridos después de un único ensayo de estimulación de bigote único sugieren un aumento en la intensidad de la respuesta funcional evocada. La adquisición de la respuesta funcional evocada de ratas despiertas con la cabeza fija es más rápida que la de ratas anestesiadas, confiable, reproducible y puede usarse para estudios longitudinales repetidos.

Introducción

La mayoría de las investigaciones de neuroimagen científica básica, preclínica y traslacional se adquieren de animales anestesiados 1,2. Los anestésicos facilitan la experimentación, pero influyen continuamente en el metabolismo del cerebro y del cuerpo, la presión arterial y la frecuencia cardíaca3. El tipo de anestesia y la duración y vía de administración agregan variables de confusión a la interpretación de los datos que podrían contribuir para la reproducibilidad y fallas traslacionales4. Un cuello de botella importante de los estudios de neuroimagen de ratas despiertas y con la cabeza fija es el requisito de mantener a la rata estacionaria y tranquila durante los procesos de preparación y adquisición de datos. Los pequeños movimientos producen artefactos de movimiento injustificados, que pueden afectar negativamente el análisis y las interpretaciones de los datos.

Se ha ideado un nuevo modelo de neuroimagen de ratas despiertas con la cabeza fija utilizando eslingas personalizadas, implantes de cabeza impresos en tres dimensiones (3D), gorras para la cabeza y un marco para la cabeza que ofrece varias ventajas para una fácil experimentación. El implante de cabeza 3D es ligero y cubre una pequeña porción del cráneo necesaria para la transfixia. Los implantes y tapas de cabeza impresos en 3D están diseñados utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD). Los protocolos de estimulación de bigotes, adquisición de datos, análisis de datos y resultados de ratas anestesiadas han sido descritos en detalle en trabajos previos 5,6,7.

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Protocolo

Todos los procedimientos cumplieron con las pautas del Instituto Nacional de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Irvine de la Universidad de California. En este estudio se utilizaron siete machos y una rata hembra (Sprague-Dawley, peso: 185-350 g). Después de completar el estudio, las ratas fueron sacrificadas usando una sobredosis de dióxido de carbono.

1. Diseño de diferentes componentes

  1. Diseño del implante frontal:
    1. Haga el implante de cabeza utilizando el software CAD (Figura 1C) y diséñelo para obtener imágenes del área posterior al bregma y adyacente a la línea media centrada en la corteza somatosensorial. Asegúrese de que el implante de cabeza cubra un área de 0.9 mm a 1.9 mm en el cráneo lejos del área de imágenes.
    2. Use solo tres tornillos para anclar el implante de cabeza en el cráneo de la rata. Diseñe todos los orificios de los tornillos para que permanezcan en el lado opuesto de la línea media en el hemisferio contralateral del hemisferio del que se obtiene la imagen.
    3. Coloque una barra, ahuecada desde el interior, en la parte superior del implante de cabeza para permitir que los cables fijen la tapa de la cabeza al implante de cabeza como se muestra en la Figura 1D.
  2. Diseño de la tapa de la cabeza:
    1. Asegúrese de que la tapa de la cabeza cubra completamente el área de imágenes y la proteja de cualquier tipo de traumatismo como se muestra en la Figura 1A, B. Agregue una curvatura a la tapa de la cabeza para que se alinee con la forma de la cabeza sin causar dificultad a las actividades diarias del animal en las jaulas enriquecidas estándar.
    2. Corte el lado interno de la tapa de la cabeza en una forma rectangular más ancha para que la parte superior del implante de cabeza pueda encajar en ella, como se muestra en la Figura 1E. Perpendicular a este rectángulo, corte otras dos regiones rectangulares para anclar la tapa de la cabeza al implante de cabeza.
    3. Pase un cable a través de la barra hueca superior del implante de cabeza para la fijación de la tapa de la cabeza en la cabeza de la rata como se muestra en la Figura 1E-G. Pase el segundo cable de la misma manera.
      NOTA: Estos cables se pueden quitar fácilmente con alicates o pinzas. Los archivos de impresión 3D se proporcionan (formato de archivo: STL) como Archivo complementario 1 y Archivo complementario 2.
  3. Diseño del marco de la cabeza:
    1. Diseñe el marco de la cabeza de manera que una parte cortada pueda moverse a través de la barra superior del implante de cabeza y se fije con una abrazadera.
    2. Incline la otra parte cortada para proporcionar resistencia adicional para mantener la cabeza de la rata fija para que el lado contralateral sea completamente accesible para la obtención de imágenes. Para el propósito de este estudio, corte la placa de acero con recortes de estaño para producir el marco de la cabeza (Figura 1H, I).
      NOTA: Esta parte también se puede imprimir en 3D.

2. Entrenamiento inicial de ratas

  1. Permita que las ratas se aclimaten al ambiente del vivero en sus jaulas durante 2-3 días.
  2. Comience a manipular la rata en una habitación tranquila. Abra la jaula y haga que el experimentador ponga su mano dentro de la jaula cerca de la rata durante 15-20 minutos para permitir que la rata se habitúe.
  3. Una vez que la rata muestre calma al no asustarse o huir de las manos del experimentador, levante suavemente a la rata para manipularla. Maneje a la rata durante 30-45 minutos cada día antes del entrenamiento con cabestrillo.

3. Entrenamiento con cabestrillo

  1. Entrene a las ratas durante al menos 2-3 días en los cabestrillo antes de la implantación quirúrgica del implante de cabeza y la tapa de la cabeza.
  2. Organice la configuración del cabestrillo como se muestra en la figura 2A. Limpie la configuración del cabestrillo con toallitas de etanol.
    NOTA: Todas las eslingas están cosidas a mano y hechas de un material de red en la parte inferior o en ambos lados, como se muestra en la Figura 2A, B.
  3. Para el entrenamiento con cabestrillo, anestesiar a las ratas usando isoflurano al 4% para la inducción y al 1% para el mantenimiento hasta que no haya reflejo de pellizco de la pata trasera.
  4. Bajo anestesia con isoflurano, coloque las ratas en una lámina de plástico flexible que mide 20 cm x 8 cm (largo x ancho), donde 10 cm x 8 cm de la lámina de plástico están completamente cubiertos con la parte más blanda del Velcro.
    NOTA: Anestesiar a las ratas para el entrenamiento con cabestrillo es un paso opcional, utilizado principalmente para reducir el estrés y la ansiedad.
  5. Durante los primeros 2 días del entrenamiento, coloque a la rata cómodamente en un calcetín de bebé (tamaño 0-3 meses) con la cabeza hacia afuera a través de un pequeño agujero inciso en el extremo del calcetín.
  6. Envuelva un pequeño trozo de almohadilla absorbente alrededor de la parte inferior del cuerpo para mantener a la rata seca y recoger los excrementos.
  7. Envuelva a la rata en un paño de algodón transpirable (tamaño: 25 cm x 25 cm). Coloque la rata en una lámina de plástico que tenga Velcro tiras pegadas a ella.
  8. Asegure aún más la rata a la lámina de plástico utilizando tiras de Velcro de 0,5 cm de ancho a una distancia de 3-6 mm entre sí.
  9. Asegure la rata en el cabestrillo. Retire la anestesia gaseosa. Permita que la rata se recupere de la anestesia con gas en el cabestrillo.
  10. Cuando la rata comience a batir, ofrezca unas gotas de solución de sacarosa al 10% como recompensa cada 10-15 minutos.
  11. Presente aleatoriamente a la rata los estímulos sensoriales que se utilizarán durante la obtención de imágenes (aquí estimulación de bigotes, cada 15-25 minutos) para acostumbrarla a los estímulos sensoriales. Estimula manualmente los bigotes a intervalos aleatorios.
  12. Entrene a la rata en el cabestrillo durante 1 h el día 1, 2 h el día 2 y 3 h el día 3 como se muestra en la Figura 2C.

4. Preparación prequirúrgica

  1. Imprima el implante de cabeza y la tapa de la cabeza con la impresora 3D (Figura 1).
  2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y tocados (implantes y tapones) sumergiendo el equipo en el germicida Metricide28 durante 10 horas. Enjuague bien las herramientas con agua estéril justo antes de la cirugía.
  3. Exponga a la rata al 4% de isoflurano y luego mantenga al 1% -2% de isoflurano hasta que no haya reflejo de pellizco de la pata trasera. Esta cirugía se puede realizar bajo muchos tipos de anestesia, como isoflurano, pentobarbital sódico y ketamina-xilazina.
  4. Inyecte atropina (0.05 mg / kg) por vía intramuscular para reducir las secreciones mucosas para ayudar en la respiración.
  5. Afeite la cabeza de la rata 5 mm centrada alrededor de la línea media con un recortador de pelo que comienza desde entre los ojos hasta la parte posterior de las orejas.
  6. Controle la saturación parcial de oxígeno y la frecuencia cardíaca a través de un oxímetro de pulso y una sonda de monitor de frecuencia cardíaca asegurada a la pata trasera de la rata.
  7. Limpie la cabeza de la rata y el área circundante tres veces con rondas alternas de betadina y toallitas con alcohol al 70%.
  8. Arregla la rata en un sistema estereotáxico.
  9. Inserte una sonda rectal lubricada con vaselina para medir la temperatura corporal de la rata y mantenerla a través del sistema de retroalimentación de la manta calefactora para evitar la hipotermia después de la administración de anestesia.
  10. Administrar clorhidrato de lidocaína anestésico local a una concentración de 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 peso corporal por vía subcutánea en el sitio quirúrgico.
  11. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar que se seque.
  12. Administrar anestesia local al 2% por vía subcutánea sobre el sitio quirúrgico.
  13. Inyecte 3 ml de solución de ringer lactato a temperatura ambiente por vía subcutánea para prevenir la deshidratación y proporcionar nutrición durante la cirugía.

5. Cirugía

  1. Retire la parte de la piel sobre el sitio quirúrgico (4 mm de diámetro centrado alrededor de la línea media y el centro de la cabeza) con tijeras quirúrgicas afiladas. Diseccionar y eliminar parte de la piel (~2 mm de diámetro, sobre la corteza somatosensorial izquierda) entre la oreja y el ojo en la parte temporal de la cabeza.
  2. Extraer, con un bisturí, el tejido subyacente de la piel (pericráneo) para exponer el cráneo. Limpie el cráneo con una gasa de algodón esterilizada.
  3. Retraer / resecar el músculo temporal para exponer el tamaño deseado para el área de imagen [7.5 mm por 7.5 mm para este estudio].
  4. Exponga el cráneo en el hemisferio contralateral para el implante de cabeza. Coloque el implante de cabeza en el cráneo para determinar la ubicación de los tornillos de anclaje para el implante como se muestra en la Figura 2D-F.
  5. Marque el cráneo para perforar los tornillos usando tinta india con broca 1. Perfore los orificios de rebabas para los tornillos con la broca dental 3. Atornille el implante de cabeza en su lugar.
  6. Seque el cráneo con una gasa estéril. Aplique una capa delgada de adhesivo tisular alrededor y debajo del implante de cabeza para pegarlo al cráneo. Aplique una capa de cemento dental para apoyar aún más el implante de cabeza en su lugar y deje que el cemento se seque durante 2-3 minutos.
    NOTA: El uso de adhesivo tisular además del cemento dental asegura una fuerte sujeción8.
  7. Usando la broca dental 3, adelgaza un área de 7.5 mm x 7.5 mm en el lado izquierdo del cráneo justo posterior a la bregma y lateral a la línea media. Adelgazar el cráneo a ~50 μm como se muestra en la Figura 3A.
  8. Aplique ungüento antibiótico tópico sobre el sitio quirúrgico y luego cúbralo con una capa delgada de caucho de silicona para proteger el cráneo adelgazado como se muestra en la Figura 3B. Cubra el sitio quirúrgico con la tapa de la cabeza como se muestra en la Figura 3C. Fíjelo en su lugar con los dos pequeños trozos de cables que atraviesan tanto el implante de cabeza como la tapa de la cabeza, como se muestra en la Figura 3D, E. Aplique caucho de silicona para cubrir la tapa de la cabeza y el cráneo para estabilizar la tapa de la cabeza más adelante en la cabeza de la rata, como se muestra en la Figura 3F.
    NOTA: El caucho de silicona proporciona protección adicional al cráneo adelgazado.
  9. Inyecte a la rata con flunixina meglumina (2,5 mg/kg) por vía subcutánea para el manejo del dolor y la inflamación. Para prevenir la infección, inyecte el antibiótico Enrosita enrofloxacino (22,7 mg/ml, 10 mg/kg +/-0,01), por vía intraperitoneal.
  10. Mueva la rata a la cámara de recuperación para ayudar a mantener su temperatura corporal con una manta de calentamiento y una lámpara de calor. Monitoree a la rata continuamente hasta que recupere la conciencia y pueda mantener la decúbito esternal.
  11. Devuelva la rata a su jaula separada una vez que se recupere por completo.
  12. Durante los próximos 3 días, administre flunixina y buprenorfina para aliviar la inflamación y el dolor y enrosite para prevenir la infección dos veces al día.

6. Imágenes despiertas

  1. Anestesiar a la rata con isoflurano al 4% para la inducción y al 1% para el mantenimiento cuando no hay reflejo de pellizco de la pata trasera. Inyecte acepromazina (0,3-0,5 mg/kg) por vía subcutánea.
    NOTA: Esta concentración de acepromazina está por debajo de los niveles leves de sedación y solo ayuda a mantener a las ratas tranquilas durante todo el proceso de obtención de imágenes.
  2. Usando tiras personalizadas de Velcro, fije la rata en la lámina de plástico utilizada durante los procedimientos de entrenamiento. Envuelva la parte inferior del cuerpo con una almohadilla de absorción y coloque la rata cómodamente en el cabestrillo.
  3. Retire la goma de silicona. Retire la tapa de la cabeza quitando los cables de fijación. Fije el marco de la cabeza en el implante de cabeza como se muestra en la Figura 2G.
  4. Bloquee el marco de la cabeza con abrazaderas como se muestra en la Figura 2H, I.
  5. Retire la anestesia gaseosa. Enjuague el área de imágenes con solución salina 3x y limpie con una gasa húmeda. Seque el área de imágenes y haga un pozo, usando vaselina, alrededor del área de imágenes. Llene el pozo con solución salina esterilizada y cúbralo con un portaobjetos de vidrio (Figura 2E).
  6. Consulte los procedimientos de adquisición de imágenes ópticas de señal intrínseca, el protocolo de estimulación de bigotes y el análisis y presentación de datos, que se han discutido en detalle anteriormente 6,7.
  7. A lo largo del experimento, monitoree a las ratas para detectar signos de agitación e inquietud, que pueden reducirse aún más cubriendo los ojos de las ratas con un paño suave o una gasa (opcional).

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Resultados

Se muestran las señales de imagen óptica representativas de un único ensayo de una rata anestesiada y la respuesta sumada (de 40 ensayos recopilados) de una rata despierta (Figura 4). La intensidad de la señal para la estimulación de un solo bigote de una rata despierta se puede visualizar en un umbral más alto que para la rata anestesiada, mostrando una señal más fuerte del animal despierto. Los bigotes C2 de las ratas se estimulan a 5 Hz durante 1 s, y la respuesta funcional se muestra com...

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Discusión

El uso de imágenes de ratas despiertas y con la cabeza fija ofrece muchas ventajas en términos de facilidad y personalización. Las eslingas diseñadas a medida permiten que las ratas se envuelvan a través de material de red transpirable, eliminando la necesidad de encerrar a los animales en cámaras de restricción de plástico cerradas durante largos períodos de tiempo10,11. Las ratas se mantienen tranquilas y libres de estrés durante las largas sesiones de imagen s...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha y Amirsoheil Zareh por su ayuda durante el entrenamiento de las ratas y la preparación de las hondas. El financiamiento fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, Número de subvención: NS119852) y la Fundación Leducq (Número de subvención: 15CVD02).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RatasCharles RiverSprague Dawley
IsofluranoPivetal21295098Anestésico general
Lidocaína HCl 2% inyecciónPhoenix L-2000-04Anestésico local
Inyección de sulfato de atropinaVedco5098907512Ayuda en la respiración
Lactato Solución inyectable de RingerVedco
Inyección de flunixinaVedco 6064408670Manejo del dolor
Inyección de enrosita (Enrofloxacina 2.27%)VetOne501084Evite la infección
Inyección de PromAce (maleato de acepromazina)Beohringer Ingelheim136059
Ungüento AnimaxDechra Productos Veterinarios122-75Ingredientes activos de nistatina 1000 unidades por gramo, sulfato de neomicina 2,5 mg por gramo, tiostrepton 2500 unidades por gramo y acetónido de triamcinolona 1 mg por gramo
Ungüento oftálmico PuralubeDechra Productos Veterinarios Dechra211-38
Povidona yodada Almohadillas de preparación PVP MedlineMDS093917Betadine
Hisopos genéricos con alcohol isopropílicoBD 326895
Vetbond adhesivo3M1469SB
Fresa (broca), carburo de operación estándarSS Fresas blancas14829#3
Tornillos, 00-90 x 1/8 cabeza plana acero inoxidableJ.I. MorrisF0090CE125Tornillos de anclaje
Sistema estereotáxicoKopf Instruments1430
Manta calefactora homeotérmicaHarvard Apparatus50-7220-F
Oxímetro de pulso y monitor de frecuencia cardíacaKent ScientificMouseStat Jr.
PetrolatumFisher ScientificP66-1LBVaselina genérica
Alambre, cobre desnudoFisher Scientific15-545-2C20
Teets Cold Cure polvoDentalC73-0054 ingrediente activo: Metacrilato de metilo
Teets Cold Cure líquidoPearson DentalC73-0078 ingrediente activo: Metacrilato de metilo
Molde de siliconade caucho Smooth-OnBody Double Fast polímerosilicona
Metricide 28 (Germicida)MetrexOct-05
Tinta china, negroPelikan301051
Taladro dentalNSK DentalUltimate XL-F
Impresora 3DPrusa Researchi3 MK3S+
Coser en sujetadoresVelcro90030
Tela utilitaria para pantallas de mascotasJoann 10173334Material de red
Fresa (broca), carburo de operación estándarSS Fresas blancas14829#1 fresa
50989088317 calibre Pearson de

Referencias

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