La amplificación de la señal de tiramida durante la tinción inmunofluorescente permite la detección sensible de RIPK3 y MLKL fosforilados durante la necroptosis inducida por ZBP1 después de la infección por HSV-1.
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Artículo de método
Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas
En este artículo
Resumen
Resumen
La quinasa Receptor-interacción serina/treonina proteína quinasa 3 (RIPK3) y su sustrato mixto de linaje quinasa similar a dominio (MLKL) son reguladores críticos de necroptosis, una forma inflamatoria de muerte celular con importantes funciones antivirales. La autofosforilación de RIPK3 induce la fosforilación y activación de la proteína verdugo formadora de poros de la necroptosis MLKL. El tráfico y oligomerización de MLKL fosforilada en la membrana celular da lugar a la lisis celular, característica de la muerte celular necroptótica. El sensor de ácido nucleico ZBP1 se activa uniéndose al ARN bicatenario zurdo en forma Z (ARN-Z) después de la infección con virus de ARN y ADN. La activación de ZBP1 restringe la infección por virus al inducir la muerte celular regulada, incluida la necroptosis, de las células huésped infectadas. La microscopía de inmunofluorescencia permite la visualización de diferentes pasos de señalización aguas abajo de la necroptosis mediada por ZBP1 por célula. Sin embargo, la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia estándar, utilizando anticuerpos fosfoespecíficos disponibles comercialmente contra RIPK3 y MLKL humanos, impide la obtención de imágenes reproducibles de estos marcadores. Aquí, describimos un procedimiento de tinción optimizado para serina (S) fosforiladas RIPK3 (S227) y MLKL (S358) en células humanas HT-29 infectadas con el virus del herpes simple 1 (HSV-1). La inclusión de un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) en el protocolo de tinción inmunofluorescente permite la detección específica de S227 fosforilado RIPK3. Además, TSA aumenta en gran medida la sensibilidad de la detección de MLKL fosforilado S358. Juntos, este método permite la visualización de estos dos eventos críticos de señalización durante la inducción de la necroptosis inducida por ZBP1.
Introducción
La proteína quinasa 3 de serina/treonina que interactúa con receptores (RIPK3) y la quinasa de linaje mixto similar a un dominio (MLKL) son reguladores centrales de la muerte celular necrótica 1,2. La necroptosis es una forma lítica e inflamatoria de muerte celular regulada involucrada en la inmunidad antiviral y la autoinflamación. La necroptosis de las células infectadas por virus detiene inmediatamente la replicación del virus. La lisis celular después de la inducción de necroptosis también libera patrones moleculares asociados al daño, que estimulan la inmunidad antiviral 3,4
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Protocolo
1. Preparación de tiramida biotinilada
- Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para hacer una solución madre de 10 mM, disuelva 3,6 mg de tiramida de biotina en 1 ml de DMSO. Conservar el producto disuelto en alícuotas a -20 °C para preservar la calidad.
2. Mantenimiento de células HT-29 en cultivo
NOTA: Los HT-29 que expresan ZBP1 se generaron por transducción con un lentivector27 que codifica ZBP1 humano.
- Mantenga las células HT-29 que expresan ZBP1 en el medio 5A de McCoy suplementado con L-glutamina, piruva....
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Resultados
La detección inmunofluorescente de la fosforilación de MLKL y especialmente de la fosforilación de RIPK3 en células humanas es técnicamente desafiante26. Aquí presentamos un protocolo de tinción mejorado para p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) humanos tras la activación de ZBP1. El protocolo incluye un paso TSA para mejorar el límite de detección y la sensibilidad de las señales fluorescentes. Para validar el método, se realizó una comparación lado a lado de la inmunofluorescencia mediada por TSA con .......
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Discusión
Este protocolo de tinción inmunofluorescente describe el uso de la amplificación de señal de tiramida (TSA) para aumentar la sensibilidad a los eventos de señalización de la vía de señalización necropótica humana que son difíciles de detectar, incluida la fosforilación de RIPK3 y MLKL26. La inclusión de un paso TSA mejora significativamente el umbral de detección de p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) y aumenta la sensibilidad del esfuerzo p-MLKL (S358). TSA reveló una señal p-RIPK3 (S227) ya presente .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al VIB Bioimaging Core por la capacitación, el apoyo y el acceso al parque de instrumentos. J.N. cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO). La investigación en el grupo J.M. fue apoyada por una beca Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), una beca de investigación junior (G031022N) de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO), una beca de prueba de concepto para jóvenes investigadores de CRIG y por la Universidad de Gante. La investigación en el grupo P.V. contó con el apoyo de EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpos | |||
| Anti-conejo HRP | Agilent Technologies Bélgica | K4002 | Envision+ System-HRP Etiquetado Polímero anti-conejo |
| Cabra anti-ratón DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Anticuerpo secundario |
| HSV-1 ICP0 Santa | Cruz | sc-53070 | Anticuerpo |
| anti-ICP0 (HSV-1) de ratónSuero de ratón IAV-PR8 | Producción propia | xx | Anticuerpo policlonal anti-IAV-PR8 |
| de ratón pMLKL | Abcam | ab187091 | Anticuerpo anti-MLKL-fosfo S358 |
| de conejo pRIPK3 Abcam | ab209384 | Anticuerpo anti-RIPK3-fosfo S227 de conejo | |
| DAPI | Thermofisher | D21490 | Para visualizar el núcleo de las células |
| Estreptavidina acoplada a Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | Para visularizar moléculas de biotina |
| Compuestos | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Sustrato oxidante, necesario para la actividad de HRP |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | Para fijar/reticular las células |
| Biotinil-tiramida | R& D Systems | 6241 | Para amplificar la señal, sustrato HRP |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| Para cultivo celular: para separar las células | |||
| 8,0 g/L de NaCl | |||
| 0,4 g/L de sal disódica de EDTA | |||
| EDTA 0,04% | Formulación | 1,1 g/L Na2HPO4 | |
| 0,2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0,2 g/L KCl | |||
| 0,2 g/L de glucosa | |||
| Suero fetal bovino | TICO | FBS EU XXX | Para cultivo celular, mantenimiento del cultivo celular; Número de lote: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | inhibidor de la quinasa RIPK3 |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | Para el cultivo celular, el mantenimiento del cultivo celular |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Solución bloqueante |
| PBS | Gibco | ||
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | S8636 | Para el cultivo celular, mantenimiento del cultivo celular |
| TNF-& alpha; | Producción interna | : | molécula de señalización, capaz de desencadenar la muerte celular en combinación con BV6 y zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | Para permeabilizar las células |
| Azul de tripán | Merck | 11732 | Para el recuento de células, utilizado como marcador vivo/muerto al 0,1% |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T4424 | Para el cultivo celular: para separar las células |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona |
| Material | |||
| µ-Diapositiva 8 pocillo alto fondo de vidrio | iBidi | 80807 | Para cultivar las células |
| Algodón Preping Balls-tamaño mediano | Microscopía Electrónica Ciencias | 71001-10 | Para limpiar los objetivos |
| Immersol 518 F / 30 ° C | ZEISS | 444970-9000-000 | Para visualizar la muestra con grandes aumentos |
| Limpiador de lentes | ZEISS | 000000-0105-200 | Para limpiar los objetivos |
| LSM880 Microscopio | Para visualizar la muestra | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | Para procesar los datos |
| Prisma 9 | Graphpad | xx | Para analizar los datos: pruebas estadísticas y generación de gráficos |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | Para realizar cuantificaciones |
| Zen black | ZEISS | xx | Para adquirir y procesar imágenes |
| Zen blue | ZEISS | xx | Para visualizar imágenes |
| Viruses | |||
| Cepa HSV-1 (mutRHIM) F | producida por Dr. Jiahuai Han | en la replicación interna de | HSV-1 como desencadenante de la necroptosis; El dominio central RHIM de UL39/ICP6 está mutado (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) Cepa F | producida por el Dr. Jiahuai Han | la replicación interna | HSV-1 (WT) como control negativo para la inducción de la necroptosis (inhibición de ICP6) |
| IAV PR8 | en stock interno | en la replicación interna | IAV como desencadenante de la necroptosis |
Referencias
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic c....
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Reimpresiones y permisos
