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Artículo de método

Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas

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DOI:

10.3791/64332

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20 de octubre de 2022

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1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

En este artículo

Resumen

La amplificación de la señal de tiramida durante la tinción inmunofluorescente permite la detección sensible de RIPK3 y MLKL fosforilados durante la necroptosis inducida por ZBP1 después de la infección por HSV-1.

Resumen

La quinasa Receptor-interacción serina/treonina proteína quinasa 3 (RIPK3) y su sustrato mixto de linaje quinasa similar a dominio (MLKL) son reguladores críticos de necroptosis, una forma inflamatoria de muerte celular con importantes funciones antivirales. La autofosforilación de RIPK3 induce la fosforilación y activación de la proteína verdugo formadora de poros de la necroptosis MLKL. El tráfico y oligomerización de MLKL fosforilada en la membrana celular da lugar a la lisis celular, característica de la muerte celular necroptótica. El sensor de ácido nucleico ZBP1 se activa uniéndose al ARN bicatenario zurdo en forma Z (ARN-Z) después de la infección con virus de ARN y ADN. La activación de ZBP1 restringe la infección por virus al inducir la muerte celular regulada, incluida la necroptosis, de las células huésped infectadas. La microscopía de inmunofluorescencia permite la visualización de diferentes pasos de señalización aguas abajo de la necroptosis mediada por ZBP1 por célula. Sin embargo, la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia estándar, utilizando anticuerpos fosfoespecíficos disponibles comercialmente contra RIPK3 y MLKL humanos, impide la obtención de imágenes reproducibles de estos marcadores. Aquí, describimos un procedimiento de tinción optimizado para serina (S) fosforiladas RIPK3 (S227) y MLKL (S358) en células humanas HT-29 infectadas con el virus del herpes simple 1 (HSV-1). La inclusión de un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) en el protocolo de tinción inmunofluorescente permite la detección específica de S227 fosforilado RIPK3. Además, TSA aumenta en gran medida la sensibilidad de la detección de MLKL fosforilado S358. Juntos, este método permite la visualización de estos dos eventos críticos de señalización durante la inducción de la necroptosis inducida por ZBP1.

Introducción

La proteína quinasa 3 de serina/treonina que interactúa con receptores (RIPK3) y la quinasa de linaje mixto similar a un dominio (MLKL) son reguladores centrales de la muerte celular necrótica 1,2. La necroptosis es una forma lítica e inflamatoria de muerte celular regulada involucrada en la inmunidad antiviral y la autoinflamación. La necroptosis de las células infectadas por virus detiene inmediatamente la replicación del virus. La lisis celular después de la inducción de necroptosis también libera patrones moleculares asociados al daño, que estimulan la inmunidad antiviral 3,4. La necroptosis se inicia por la activación de RIPK3 después de interacciones mediadas por motivos de interacción homotípica RIP (RHIM) con una de las tres moléculas activadoras aguas arriba: RIPK1 (sobre el compromiso del receptor TNF 1 [TNFR1]), β inductor de interferón inductor de adaptador que contiene dominio TIR (TRIF; en el compromiso de los receptores 3 y 4 tipo Toll), o el sensor antiviral de ácido nucleico Z-DNA proteína de unión al ADN 1 (ZBP1)1,2 . La señalización de necroptosis procede a través de una serie de eventos de fosforilación que comienzan con la autofosforilación de RIPK3. La autofosforilación de RIPK3 humana en serina (S)227 dentro de su dominio quinasa es un requisito previo para la necroptosis al permitir la interacción con MLKL y se usa comúnmente como un marcador bioquímico para la activación de RIPK3 humana y la muerte celular necrótica 1,5. Una vez activado, RIPK3 fosforila el bucle de activación de MLKL en treonina (T)357 y S3581. Esto provoca un cambio en la conformación MLKL, lo que resulta en la exposición del dominio del haz de cuatro hélices N-terminal. MLKL luego oligomeriza y trafica a la membrana celular donde forma un poro a través de la inserción de los cuatro haces helicoidales expuestos en la bicapa lipídica, lo que finalmente conduce a la muerte celular 2,6.

ZBP1 es un sensor de ácido nucleico antiviral que reconoce los ácidos nucleicos zurdos en forma Z, incluido el ARN bicatenario en la conformación Z (ARN Z). La unión al ARN Z se produce a través de dos dominios Zα posicionados en el extremo N de ZBP1. Se cree que el ARN-Z que se acumula durante la infección por virus de ARN y ADN afecta directamente a ZBP1 7,8. ZBP1 activado recluta RIPK3 a través de sus RHIM centrales e induce la muerte celular regulada, incluyendo necroptosis 9,10. Los virus han adoptado numerosos mecanismos de escape para contrarrestar la necroptosis de la célula huésped inducida por ZBP111. Por ejemplo, la subunidad 1 de la ribonucleótido reductasa del virus del herpes simple 1 (HSV-1), conocida como ICP6 y codificada por UL39, alberga RHIM en su extremo N que interfiere con la activación de RIPK3 mediada por ZBP1 en células humanas12,13,14,15. ZBP1 no sólo restringe la replicación viral, sino que los estudios en ratones han demostrado que la activación de ZBP1 causa enfermedades inflamatorias y estimula la inmunidad contra el cáncer 16,17,18,19,20,21. Los protocolos que detectan eventos de señalización que ocurren durante la necroptosis inducida por ZBP1 en células humanas son, por lo tanto, valiosos para evaluar el papel de ZBP1 en estos procesos.

La amplificación de señal de tiramida (TSA), también conocida como deposición catalizada del informador (CARD), se ha desarrollado para mejorar el límite de detección y la relación señal-ruido en inmunoensayos basados en anticuerpos. Durante la TSA, se puede usar cualquier anticuerpo primario para detectar el antígeno de interés. La peroxidasa de rábano picante (HRP), acoplada a un anticuerpo secundario, cataliza la acumulación local de radicales tiramida biotinilados en presencia de peróxido de hidrógeno. Estos radicales de biotina-tiramida activados reaccionan con residuos de tirosina proximales para formar enlaces covalentes. Los sustratos potenciales de tiramida-biotina incluyen el antígeno en sí, los anticuerpos primarios y secundarios y las proteínas vecinas. Por lo tanto, aunque TSA mejora significativamente la sensibilidad del ensayo, parte de su resolución espacial se pierde. En un paso final, las moléculas de biotina se detectan utilizando estreptavidina marcada con fluorescencia. La reacción HRP deposita muchas moléculas de tiramida-biotina en o cerca del antígeno de interés. Esto aumenta en gran medida el número de sitios de unión estreptavidina-fluorocromo, amplificando así en gran medida la sensibilidad del ensayo (Figura 1). Alternativamente, la tiramida se puede acoplar directamente a un fluorocromo, eliminando la necesidad de fluoróforos acoplados a estreptavidina. La inmunohistoquímica de proteínas y la hibridación in situ ADN/ARN estuvieron entre los primeros métodos mediante los cuales se empleó TSA para mejorar las intensidades de señal22,23. Más recientemente, la TSA se ha combinado con la citometría de flujo intracelular24 y la espectrometría de masas25.

Aquí, presentamos un protocolo para detectar serina 227 fosforilada humana RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) y MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) tras la activación de ZBP1 por infección por HSV-1 utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Utilizamos una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 sensible a la necroptosis que se transdució para expresar de manera estable ZBP1 humano. Estas células fueron infectadas con una cepa HSV-1 que expresa una proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) en la que cuatro aminoácidos centrales dentro del RHIM viral (VQCG) fueron reemplazados por alaninas (AAAA), lo que hace que el ICP6 no pueda bloquear la necroptosis mediada por ZBP113,14,15. Para superar el problema de la baja relación señal-ruido de los anticuerpos actualmente disponibles comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 y p-MLKL en inmunotinción26, realizamos un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta en la detección robusta de p-RIPK3 humano (S227) y mejora la sensibilidad de detección de p-MLKL humano (S358) en un orden de magnitud.

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Protocolo

1. Preparación de tiramida biotinilada

  1. Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para hacer una solución madre de 10 mM, disuelva 3,6 mg de tiramida de biotina en 1 ml de DMSO. Conservar el producto disuelto en alícuotas a -20 °C para preservar la calidad.

2. Mantenimiento de células HT-29 en cultivo

NOTA: Los HT-29 que expresan ZBP1 se generaron por transducción con un lentivector27 que codifica ZBP1 humano.

  1. Mantenga las células HT-29 que expresan ZBP1 en el medio 5A de McCoy suplementado con L-glutamina, piruvato de sodio y suero bovino fetal al 10% (de ahora en adelante denominado medio completo) y manténgalo en una incubadora a 37 ° C con 5% de dióxido de carbono. Lo ideal es utilizar celdas de un número de paso bajo (menos de 10). Deje que las células se recuperen durante al menos 5 días después del ciclo de descongelación antes del inicio del experimento.
  2. Para separar las células del matraz de cultivo, retirar el medio y lavar las células con 5 ml de PBS (precalentado a 37 °C). A continuación, añadir la cantidad adecuada de tripsina/EDTA (0,05% tripsina y 0,032% EDTA, respectivamente, precalentado a 37 °C) a las células (2 ml para un matraz T75, 3 ml para un matraz T175).
  3. Incubar las células con tripsina/EDTA durante un máximo de 10 minutos en una incubadora a 37 °C con 5% de dióxido de carbono. Después, golpee el matraz y compruebe visualmente si las células se desprendieron del matraz con un microscopio con un aumento objetivo de 4x-20x.
  4. Si las células no están completamente separadas, incubar durante otros 5 minutos a 37 °C. Cuando las células se desprendan, detener la reacción enzimática añadiendo 6 ml de medio completo al matraz.
  5. Reúna la suspensión celular en un tubo de 15 ml. Contar las células usando una tinción azul de tripano para evaluar la viabilidad; Se recomienda una dilución 1:5. Solo se procede con el experimento si la viabilidad de las células supera el 90%.

3. Inicio del experimento, siembra y estimulación de las células

  1. Sembrar 90.000 células HT-29 que expresan ZBP1 en medio completo en una placa de pozo de área de superficie de 1 cm² que permite microscopía de alta gama. Utilice un volumen final de 200 μL por pocillo.
  2. Incubar las células durante la noche a 37 °C con 5% de dióxido de carbono. Tenga en cuenta que es necesario sembrar algunos pozos adicionales para los controles de tinción, lo que se explica con más detalle en el paso 5.6.
  3. Cuando las células alcancen una confluencia del 70% -80%, agregue un estímulo inductor de necroptosis a las células. Aquí, las células se infectaron con HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicidad de infección [MOI] de 5, definida como unidades formadoras de placa (ufp) divididas por el número de células; la pfu se cuantificó mediante un ensayo de placa en células Vero) durante 6 h, 8 h o 10 h.
  4. Como control positivo para la inducción de necroptosis, estimular las células durante 4 h con un cóctel inductor de necroptosis que contenga 30 ng/mL de TNF, 20 μM del inhibidor pan-caspasa zVAD-fmk y 5 μM del SMAC mimético BV6.
  5. Como control negativo para la tinción de p-RIPK3 (S227), incluir GSK'840 (1 μM) para inhibir la actividad de la quinasa RIPK3 y prevenir la autofosforilación de S227. Idealmente, agregue el inhibidor en una condición no tratada y después de la estimulación de la necroptosis. El inhibidor se puede agregar simultáneamente con la infección viral.
  6. Preparar los estímulos en medio completo, precalentados a 37 °C. Use un volumen final de 200 μL por pocillo para todas las estimulaciones.

4. Fijación de las celdas

  1. Retire el medio y lave las células con 200 μL de 1x PBS. Luego, agregue 150 μL de PFA al 4% (ya equilibrado a temperatura ambiente) a las células e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    NOTA: Si está utilizando celdas que se desprenden fácilmente, la fijación de las celdas se puede optimizar de la siguiente manera. Retire 100 μL de medio del pozo, de modo que quede un volumen de 100 μL en la placa. Agregue 100 μL de PFA al 4% a las células. Incubar las celdas durante 5 min a temperatura ambiente. Después, retire el medio/fijador de los pocillos y reemplácelo con 150 μL de PFA al 4%. Incubar las células durante otros 20 minutos a temperatura ambiente para asegurar la fijación completa de las células.
  2. Después de la fijación, retire el PFA al 4% y lave las células 3x con 200 μL de 1x PBS. Las muestras pueden almacenarse en un exceso (>200 μL) de 1x PBS a 4 °C durante la noche hasta su posterior procesamiento.

5. Permebilización y tinción primaria

  1. Retire el PBS y agregue 100 μL de tampón de permeabilización (0.5% Triton X-100 en PBS). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Retirar el tampón de permeabilización y, posteriormente, lavar los pocillos con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar la cámara de imágenes con tampón de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante (20-30 movimientos de balanceo por minuto).
  3. Para evitar la unión inespecífica de anticuerpos primarios, añadir 100 μL de medio bloqueador e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. Alternativamente, este paso de bloqueo puede ser reemplazado por el bloqueo con BSA al 3%, Triton-X-100 al 0,1% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
  4. Lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
  5. Después de retirar el tampón de lavado, añadir los anticuerpos primarios a la cámara de imagen e incubar durante la noche a 4 °C. Use un volumen final de 100 μL para cubrir el pozo. Durante la incubación nocturna a 4°C, no coloque la cámara de imágenes sobre un agitador de laboratorio basculante.
    NOTA: Anti p-MLKL (S358; dilución: 1:200) y anti-p-RIPK3 (S227; dilución: 1:200) comparten al conejo como especie huésped y, por lo tanto, no deben combinarse en un pozo. Para controlar la infección viral, combine un anticuerpo primario contra una proteína viral de elección con p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227). Aquí, las células se infectaron con infección por HSV-1 seguida de tinción ICP0 (dilución: 1:50, especie huésped: ratón).
  6. Tenga en cuenta los controles de tinción necesarios en este punto. Siempre incluya una condición sin anticuerpos primarios para visualizar el fondo potencial del paso de amplificación de TSA para establecer el umbral de enmascaramiento (consulte el paso 9).
    NOTA: En caso de un protocolo de tinción conjunta (por ejemplo, combinar p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227] con un anticuerpo contra una proteína viral) use también tinciones individuales. El uso de tinciones individuales es importante para corregir la posible señal de sangrado en otros canales de imagen.

6. Amplificación de señal de tiramida (TSA)

  1. Retire la mezcla de anticuerpos primarios y lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
  2. Retire el tampón de lavado y agregue 100 μL de anticuerpo secundario marcado con HRP reconociendo la especie de anticuerpo primario que necesita ser amplificado. Para amplificar la señal p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), añadir 100 μL de anti-conejo-HRP e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
    NOTA: Solo se amplificarán p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227). La tinción de una proteína viral se visualizará utilizando un método estándar de tinción indirecta.
  3. Después, lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
  4. En los siguientes pasos, agregue la tiramida biotinilada a la placa microscópica. Usando el grupo HRP acoplado a los anticuerpos secundarios, la reacción enzimática desencadenará la formación de radicales tiramida muy cerca del objetivo primario (aquí, p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227]).
  5. Para activar la actividad enzimática de HRP, agregue un sustrato oxidante junto con la tiramida biotinilada. Para lograr esto, complemente el tampón TSA (ácido bórico 0.1 M [pH 8.5]) con 0.03 M H 2 O2; específicamente, tomar 5 mL de tampón TSA y agregar 5 μL de 30%H2O2.
  6. Ahora, diluya la biotina-tiramida en un tampón TSA suplementado conH2O2que va desde 1: 1,000 a 1: 20,000.
    NOTA: El factor de dilución de la biotina-tiramida debe optimizarse por lote.
  7. Retire el tampón de lavado de los pocillos y agregue biotina-tiramida diluida a los pocillos hasta un volumen final de 100 μL. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en un agitador de laboratorio basculante.
  8. A continuación, lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.

7. Fluoróforos

NOTA: Dado que la señal del anticuerpo primario se convierte en un grupo biotina, p-MLKL (S358) y p-RIPK3 (S227) se visualizan utilizando estreptavidina acoplada a un fluoróforo (fluoróforo 568, dilución: 1:500). Además, los núcleos se tiñen con DAPI (5 μg/mL). Si se incluye una proteína viral en el protocolo de tinción, incluya un anticuerpo secundario adecuado marcado con fluorescencia contra la especie huésped de su anticuerpo primario. En los resultados representativos, se utilizó un ratón anti-ICP0. Como anticuerpo secundario se incluyó un antiratón de cabra acoplado al fluoróforo 633 (dilución: 1:1.000).

  1. Hacer la mezcla de tinción en tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS) que contiene los anticuerpos y tinciones mencionados anteriormente. Retire el tampón de lavado, agregue 100 μL de mezcla para tinción e incube a temperatura ambiente durante 1 h en un agitador de laboratorio basculante. Mantenga la cámara de imágenes protegida de la luz desde este paso en adelante.
  2. A continuación, lave los pocillos 2x con tampón de lavado (0.1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
  3. Finalmente, enjuague los pozos 2x con 1x PBS. Almacene las muestras en un exceso (> 200 μL) de 1x PBS hasta obtener imágenes. Alternativamente, sumerja las muestras en un medio de montaje para preservar la tinción. La cámara de imágenes ahora está lista para ser visualizada en un microscopio confocal.

8. Obtención de imágenes con un microscopio confocal

  1. Encienda el microscopio confocal y los láseres al menos 10 minutos antes de la toma de imágenes.
  2. Utilice un objetivo de inmersión para la sensibilidad. Preferiblemente, use un aumento objetivo de 40x o 63x. Antes de obtener imágenes, limpie los objetivos de inmersión con un limpiador de lentes utilizando bolas de algodón adecuadas. Los objetivos sucios (por ejemplo, debido al polvo) pueden dar lugar a imágenes de menor calidad.
  3. Coloque una cantidad excesiva de aceite en la parte inferior de la cámara de imágenes. Además, agregue una gota de aceite en el objetivo de elección.
  4. Coloque la cámara de imágenes en el microscopio. Encuentre el campo de enfoque mediante la tinción DAPI o mediante imágenes de campo claro. Si es necesario, muévase alrededor de la cámara de imágenes para garantizar la distribución adecuada del aceite de inmersión.
  5. Configure las pistas de imágenes necesarias en el microscopio. Dependiendo del microscopio, los siguientes pasos pueden variar (Tabla 1).
    NOTA: Al configurar las pistas de imágenes, programe las pistas para que la tinción nuclear se mida al final. El láser de 405 nm puede contribuir al fotoblanqueo y, por lo tanto, a la pérdida de señal específica en todos los canales.
  6. Para analizar una celda completa para detectar la presencia de p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), mida pilas z que abarquen la altura de la celda. Aquí, las pilas z se hicieron de 40 cortes cada 0,16 μm, lo que resultó en un rango de 6,22 μm.

PistaLáserDivisor de hazFiltro
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)561MBS -405 +BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
Gen viral: ICP0633MBS -405 +BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Núcleo: DAPI405MBS -405 +BP 420-480 + BP 495-550
MBS 488/561/633

Tabla 1: Pistas de imágenes para la visualización celular.

9. Análisis y cuantificación de datos

  1. Cargue las imágenes microscópicas en el software. Utilice el enfoque extendido para visualizar toda la información de la pila z en una imagen 2D.
  2. A continuación, programe el protocolo de análisis para extraer la siguiente información: el número de células por imagen, la suma de vóxeles que muestran la tinción p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+. Un vóxel representa un volumen tridimensional, definido como el equivalente tridimensional de un píxel.
  3. Para cuantificar el número de células por imagen, segmente el núcleo. Para reducir el ruido en los resultados de segmentación, agregue una limitación de tamaño a la segmentación (>100 μm³). El número de núcleos segmentados representa el número de células en la imagen.
  4. Para cuantificar la cantidad de vóxeles p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+, programe una segmentación basada en umbrales. Establezca el umbral para que no se capte ninguna señal en las imágenes sin anticuerpos primarios (NP).
  5. Adapte aún más el umbral utilizando las imágenes de la condición simulada no tratada. Para garantizar la detección sensible del aumento de la señal debido a la estimulación de la necroptosis, limite la captación de vóxeles p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ en condiciones simuladas estableciendo un umbral más alto. Siempre verifique el protocolo de análisis programado en varias imágenes de la condición simulada y la infección viral que induce necroptosis.
  6. Ejecute el análisis en todos los conjuntos de imágenes. Exporte la cuantificación de vóxel y la segmentación del núcleo en un archivo .txt para su posterior procesamiento en el software de hoja de cálculo.
  7. Haga una tabla dinámica de los datos que muestre el nombre de la imagen, la cuantificación del núcleo y la suma de los vóxeles detectados.
  8. A continuación, divida la suma de los vóxeles positivos por el recuento de celdas en la imagen. Esto da como resultado un valor relativo de vóxeles positivos por célula. Para visualizar el aumento del pliegue, divida el valor relativo de p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ vóxeles por celda por la mediana de la condición no tratada (simulacro).

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Resultados

La detección inmunofluorescente de la fosforilación de MLKL y especialmente de la fosforilación de RIPK3 en células humanas es técnicamente desafiante26. Aquí presentamos un protocolo de tinción mejorado para p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) humanos tras la activación de ZBP1. El protocolo incluye un paso TSA para mejorar el límite de detección y la sensibilidad de las señales fluorescentes. Para validar el método, se realizó una comparación lado a lado de la inmunofluorescencia mediada por TSA con ...

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Discusión

Este protocolo de tinción inmunofluorescente describe el uso de la amplificación de señal de tiramida (TSA) para aumentar la sensibilidad a los eventos de señalización de la vía de señalización necropótica humana que son difíciles de detectar, incluida la fosforilación de RIPK3 y MLKL26. La inclusión de un paso TSA mejora significativamente el umbral de detección de p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) y aumenta la sensibilidad del esfuerzo p-MLKL (S358). TSA reveló una señal p-RIPK3 (S227) ya presente ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al VIB Bioimaging Core por la capacitación, el apoyo y el acceso al parque de instrumentos. J.N. cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO). La investigación en el grupo J.M. fue apoyada por una beca Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), una beca de investigación junior (G031022N) de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO), una beca de prueba de concepto para jóvenes investigadores de CRIG y por la Universidad de Gante. La investigación en el grupo P.V. contó con el apoyo de EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG y GIGG consorcios, y VIB.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpos
Anti-conejo HRPAgilent Technologies BélgicaK4002Envision+ System-HRP Etiquetado Polímero anti-conejo
Cabra anti-ratón DyLight 633Thermofisher35513Anticuerpo secundario
HSV-1 ICP0 SantaCruzsc-53070Anticuerpo
anti-ICP0 (HSV-1) de ratónSuero de ratón IAV-PR8Producción propiaxxAnticuerpo policlonal anti-IAV-PR8
de ratón pMLKLAbcamab187091Anticuerpo anti-MLKL-fosfo S358
de conejo pRIPK3 Abcamab209384Anticuerpo anti-RIPK3-fosfo S227 de conejo
DAPIThermofisherD21490Para visualizar el núcleo de las células
Estreptavidina acoplada a Alexa Fluor 568ThermofisherS11226Para visularizar moléculas de biotina
Compuestos
30% H2O2SigmaH1009Sustrato oxidante, necesario para la actividad de HRP
4% PFASANBIOAR1068Para fijar/reticular las células
Biotinil-tiramidaR& D Systems6241Para amplificar la señal, sustrato HRP
BV-6SelleckchemS7597BV6 IAP Inhibitor
         Para cultivo celular: para separar las células
         8,0 g/L de NaCl
         0,4 g/L de sal disódica de EDTA
EDTA 0,04%Formulación1,1 g/L Na2HPO4
         0,2 g/L NaH2PO4
         0,2 g/L KCl
         0,2 g/L de glucosa
Suero fetal bovinoTICOFBS EU XXXPara cultivo celular, mantenimiento del cultivo celular; Número de lote: 90439
GSK'840AobiousAOB0917inhibidor de la quinasa RIPK3
L-GlutaminaSigma-AldrichG7513Para el cultivo celular, el mantenimiento del cultivo celular
MAXblockActive Motif15252Solución bloqueante
PBSGibco
Piruvato de sodioSigma-AldrichS8636Para el cultivo celular, mantenimiento del cultivo celular
TNF-& alpha;Producción interna:molécula de señalización, capaz de desencadenar la muerte celular en combinación con BV6 y zVAD
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50MLPara permeabilizar las células
Azul de tripánMerck11732Para el recuento de células, utilizado como marcador vivo/muerto al 0,1%
TripsinaSigma-AldrichT4424Para el cultivo celular: para separar las células
zVADBachemBACE4026865.0005Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona
Material
µ-Diapositiva 8 pocillo alto fondo de vidrioiBidi80807Para cultivar las células
Algodón Preping Balls-tamaño medianoMicroscopía Electrónica Ciencias71001-10Para limpiar los objetivos
Immersol 518 F / 30 ° CZEISS444970-9000-000Para visualizar la muestra con grandes aumentos
Limpiador de lentesZEISS000000-0105-200Para limpiar los objetivos
LSM880 MicroscopioPara visualizar la muestra
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Cepa HSV-1 (mutRHIM) Fproducida por  Dr. Jiahuai Hanen la replicación interna deHSV-1 como desencadenante de la necroptosis; El dominio central RHIM de UL39/ICP6 está mutado (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) Cepa Fproducida por el Dr. Jiahuai Hanla replicación internaHSV-1 (WT) como control negativo para la inducción de la necroptosis (inhibición de ICP6)
IAV PR8en stock internoen la replicación internaIAV como desencadenante de la necroptosis
propia 10444402 confocal Fast Airyscan en

Referencias

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Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas
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