Artículo de método

Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos

DOI:

10.3791/64364

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24 de marzo de 2023

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1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

En este artículo

Resumen

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Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) ofrecen una alternativa al uso de animales para la detección preclínica de cardiotoxicidad. Una limitación para la adopción generalizada de hiPSC-CM en la detección de toxicidad preclínica es el fenotipo inmaduro de las células. Aquí se presentan protocolos para la maduración robusta y rápida de hiPSC-CM.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los cardiomiocitos derivados de células madre inducidas humanas (hiPSC-CM) se utilizan para reemplazar y reducir la dependencia de animales y células animales para pruebas preclínicas de cardiotoxicidad. En formatos monocapa bidimensionales, los hiPSC-CM recapitulan la estructura y función de las células del músculo cardíaco humano adulto cuando se cultivan en una matriz extracelular óptima (ECM). Una ECM (matriz extracelular inductora de maduración-MECM) derivada de células madre perinatales humanas madura la estructura, función y estado metabólico de hiPSC-CM en 7 días después de la placa.

Las monocapas maduras de hiPSC-CM también responden como se espera a los medicamentos clínicamente relevantes, con un riesgo conocido de causar arritmias y cardiotoxicidad. La maduración de las monocapas hiPSC-CM fue un obstáculo para la adopción generalizada de estas valiosas células para la ciencia regulatoria y la detección de seguridad, hasta ahora. Este artículo presenta métodos validados para el recubrimiento, la maduración y el fenotipado funcional de alto rendimiento de la función electrofisiológica y contráctil de hiPSC-CM. Estos métodos se aplican a los cardiomiocitos purificados disponibles comercialmente, así como a los cardiomiocitos derivados de células madre generados internamente utilizando protocolos de diferenciación altamente eficientes y específicos de la cámara.

La función electrofisiológica de alto rendimiento se mide utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD; emisión: 488 nm), fluoróforos sensibles al calcio (CSF) o sensores de calcio codificados genéticamente (GCaMP6). Se utiliza un dispositivo de mapeo óptico de alto rendimiento para las grabaciones ópticas de cada parámetro funcional, y se utiliza un software dedicado personalizado para el análisis de datos electrofisiológicos. Los protocolos MECM se aplican para la detección de medicamentos utilizando un inotrópico positivo (isoprenalina) y bloqueadores específicos del canal del gen humano relacionado con Ether-a-go-go (hERG). Estos recursos permitirán a otros investigadores utilizar con éxito hiPSC-CM maduros para la detección de cardiotoxicidad preclínica de alto rendimiento, pruebas de eficacia de medicamentos cardíacos e investigación cardiovascular.

Introducción

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Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) han sido validados a escala internacional y están disponibles para el cribado de cardiotoxicidad in vitro 1. Los hiPSC-CM de alta pureza pueden generarse en cantidades prácticamente ilimitadas, criopreservarse y descongelarse. Al rechapar, también se reaniman y comienzan a contraerse con un ritmo que recuerda al corazón humano 2,3. Sorprendentemente, los hiPSC-CM individuales se acoplan entre sí y forman una sincitia funcional que late como un solo tejido. Hoy en día, las hiPSCs se derivan rutinariamente de muestras de sangre de pacientes, por lo que cualquier persona puede ser representada utilizando ensayos de detección de cardiotoxicidad hiPSC-CM in vitro 4,5. Esto crea la oportunidad de realizar "Ensayos Clínicos en un Plato", con representación significativa de diversas poblaciones6.

Una ventaja crítica sobre los enfoques existentes de detección de cardiotoxicidad de células animales y animales es que los hiPSC-CM utilizan el genoma humano completo y ofrecen un sistema in vitro con similitudes genéticas con el corazón humano. Esto es especialmente atractivo para la farmacogenómica y la medicina personalizada: se prevé que el uso de hiPSC-CM para el desarrollo de medicamentos y otras terapias proporcionará prescripciones de medicamentos más precisas, precisas y seguras. De hecho, los ensayos bidimensionales (2D) de monocapa hiPSC-CM han demostrado ser predictivos de cardiotoxicidad de medicamentos, utilizando un panel de medicamentos clínicamente utilizados con un riesgo conocido de causar arritmias 1,7,8,9. A pesar del vasto potencial de los hiPSC-CM y la promesa de racionalizar y abaratar el desarrollo de fármacos, ha habido una renuencia a utilizar estos nuevos ensayos10,11,12.

Hasta ahora, una limitación importante de la adopción y aceptación generalizadas de los ensayos de detección de hiPSC-CM es su apariencia inmadura, similar a la fetal, así como su función. El tema crítico de la maduración de hiPSC-CM ha sido revisado y debatido en la literatura científica hasta la saciedad13,14,15,16. Del mismo modo, se han empleado muchos enfoques para promover la maduración de hiPSC-CM, incluyendo manipulaciones de matriz extracelular (ECM) en monocapas 2D y el desarrollo de tejidos cardíacos diseñados en 3D (EHT)17,18. Por el momento, existe la creencia generalizada de que el uso de EHT 3D proporcionará una maduración superior en relación con los enfoques basados en monocapa 2D. Sin embargo, las monocapas 2D proporcionan una mayor eficiencia de utilización celular y un mayor éxito en el recubrimiento en comparación con los EHT 3D; Los EHT 3D utilizan un mayor número de células y, a menudo, requieren la inclusión de otros tipos de células que pueden confundir los resultados. Por lo tanto, en este artículo, la atención se centra en el uso de un método simple para madurar hiPSC-CM cultivados como monocapas 2D de células acopladas eléctrica y mecánicamente.

La maduración avanzada de hiPSC-CM se puede lograr en monocapas 2D utilizando un ECM. Las monocapas 2D de hiPSC-CM pueden madurarse utilizando un cubreobjetos de polidimetilsiloxano suave y flexible, recubierto con una matriz de membrana basal secretada por una célula de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de ratón). En 2016, los informes mostraron que los hiPSC-CM cultivados en esta condición de ECM blanda maduraron funcionalmente, mostrando velocidades de conducción potenciales de acción cercanas a los valores cardíacos adultos (~ 50 cm / s)18. Además, estos hiPSC-CM maduros mostraron muchas otras características electrofisiológicas que recuerdan al corazón adulto, incluido el potencial de membrana en reposo hiperpolarizado y la expresión de Kir2.1. Más recientemente, los informes identificaron un recubrimiento ECM derivado de células madre perinatales humanas que promueve la maduración estructural de 2D hiPSC-CMs19. Aquí, se presentan métodos fáciles de usar para monocapas 2D hiPSC-CM estructuralmente maduras para su uso en pantallas electrofisiológicas de alto rendimiento. Además, proporcionamos validación de un instrumento de mapeo óptico para la adquisición y análisis automatizados de la función electrofisiológica monocapa 2D hiPSC-CM, utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD) y sondas y proteínas sensibles al calcio.

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Protocolo

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El uso de hiPSC en este protocolo fue aprobado por el Comité HPSCRO de la Universidad de Michigan (Comité de Supervisión de Células Madre Pluripotentes Humanas). Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de materiales y equipos. Ver Tabla 1 para los medios y sus composiciones.

1. Descongelación y recubrimiento de hiPSC-CM criopreservados disponibles comercialmente para la maduración en una matriz extracelular inductora de maduración (MECM)

  1. Calentar todos los reactivos a temperatura ambiente y rehidratar las placas MECM con solución salina balanceada de Hank (HBSS) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga calcio y magnesio, durante 1 h antes del recubrimiento de cardiomiocitos (200 μL de tampón por pocillo de una placa de 96 pocillos).
  2. Lave las placas MECM 2x con HBSS o PBS que contengan calcio y magnesio durante 1 h antes del recubrimiento de cardiomiocitos (200 μL de tampón por pocillo de una placa de 96 pocillos) y mantenga los pocillos hidratados.
  3. Preparar un baño maría a 37 °C.
  4. Retire los tubos de cardiomiocitos del tanque de nitrógeno líquido, transfiera los tubos a hielo seco y abra ligeramente las tapas del tubo para liberar presión.
    NOTA: ¡Liberar presión en los tubos es extremadamente importante! Si se acumula demasiada presión dentro de los tubos, podrían explotar.
  5. Vuelva a sellar las tapas de los tubos y colóquelos en el baño de agua para descongelar durante 4 minutos.
    NOTA: Deje que se descongelen completamente, para evitar el daño celular debido a la descongelación parcial.
  6. Después de que las células se descongelen, rocíe los tubos con etanol al 70% antes de abrirlos. Transfiera las células en tubos cónicos de 15 ml con una pipeta de 1 ml. Gotea lentamente 8 ml de medio de recubrimiento, agitando el tubo cada vez que se agrega 1 ml, para permitir que las células se ajusten a los cambios en la osmolaridad.
    1. Lave el criovial con 1 ml de medio de recubrimiento con una pipeta de vidrio de 1 ml. Luego, gotee lentamente el lavado en el tubo cónico de 15 ml.
  7. Centrifugar los tubos a ~300 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio de recubrimiento. Retire una alícuota y realice el recuento de células vivas con un hemocitómetro. Añadir un medio de recubrimiento adicional para obtener 7,5 × 105 células/ml.
    NOTA: Se requieren aproximadamente 10 ml de suspensión celular para preparar 96 pocillos.
  8. Dispensar 100 μL de suspensión celular por pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con MECM utilizando una pipeta multicanal.
    NOTA: Asegúrese de evitar la precipitación celular y obtener una densidad celular uniforme en todos los pozos durante el enchapado.
  9. Incubar las células a 37 °C, 5% deCO2 durante 2 días antes de cambiar el medio a medio de mantenimiento (200 μL/pocillo). Cambie el medio de mantenimiento el día 5 después de la descongelación. Realizar ensayos de electrofisiología el día 7 o más tarde, como se describió anteriormente 8,9. Cambie el medio cada dos días cuando opte por extender el cultivo celular.

2. Diferenciación dirigida al corazón hiPSC y purificación de hiPSC-CM

  1. Solución caliente 1x de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) disponible comercialmente, HBSS sin calcio y magnesio (HBSS--), y placas de 6 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal solubilizada secretada por una célula de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de ratón) a temperatura ambiente.
  2. Marque las colonias diferenciadas mediante microscopía de contraste de fase y aspirado/ablación. Lave cada pocillo con 1 ml de HBSS--. Realice dos lavados en pozos que contengan >10 puntos de diferenciación.
  3. Aspire el HBSS y agregue 1 ml de solución de EDTA a cada pocillo. Incubar las placas durante un máximo de 5 min a 37 °C. Revise las placas después de 3 minutos y busque colonias blancas translúcidas y visibles.
  4. Aspire la solución de EDTA y agregue 1 ml a un solo pocillo. Desaloje las células con 2 ml de medio hiPSC pipeteando la suspensión hacia arriba y hacia abajo repetidamente, usando una pipeta de vidrio de 10 ml para separar todas las células madre del pozo y transfiera la suspensión celular a un tubo de recolección. Repita la aspiración y el desalojo con pozos posteriores.
    NOTA: Desaloje las colonias difíciles de levantar con la punta de la pipeta de vidrio.
  5. Cuente las células madre y ajuste el volumen a la placa 8.0 × 105 células/pocillo. Cultivar las células en medio hiPSC (2 mL/pocillo) hasta que las células madre alcancen el 90% de confluencia (esta vez se denomina a partir de ahora D0).
  6. Preparar 2 mL de medio de diferenciación basal suplementado con 4 μM de CHIR99021.
  7. En D0, lave cada pocillo de una placa de 6 pocillos de células madre con 1 ml de HBSS por pocillo. Sustituir el HBSS por medio de diferenciación basal suplementado con 4 μM de CHIR99021.
  8. En D1, no hagas nada.
  9. En D2, preparar un medio de diferenciación basal suplementado con 4 μM de IWP4.
  10. Reemplace el medio con 2 ml de medio de diferenciación basal suplementado con IWP4 por pocillo.
  11. En D3, no hacer nada para una diferenciación ventricular específica. Para una diferenciación auricular específica, aspirar el medio y añadir 2 ml de medio basal suplementado con 4 μM de IWP4 y 1 μM de solución de ácido retinoico (AR) por pocillo.
  12. En D4, aspirar el medio y añadir 2 mL de medio basal por pocillo para la diferenciación ventricular. Para una diferenciación auricular, aspirar el medio y añadir 2 ml de medio basal suplementado con 1 μM de solución de AR por pocillo.
  13. En D5, no hagas nada.
  14. En D6, aspirar el medio y añadir 2 ml de medio basal por pocillo (para diferenciación auricular y ventricular).
  15. En D7, no hagas nada.
  16. En D8, aspirar el medio y añadir 2 mL de medio de mantenimiento de cardiomiocitos. Cambie el medio cada dos días hasta la separación celular, o siga un plan de exposición crónica a medicamentos.

3. purificación hiPSC-CM a través de MACS (clasificación celular activada magnéticamente)

  1. Aspirar el medio de cultivo celular y lavar cada pocillo con 1 ml de HBSS--. Disociar las células añadiendo 1 mL de tripsina/EDTA al 0,25% e incubando a 37 °C, 5% deCO2 durante 10 min. Resuspender y singularizar las células en cada pocillo con 2 mL de medio de recubrimiento para inactivar la tripsina/EDTA.
  2. Recolectar las células de los seis pocillos en un tubo cónico de 50 ml con un colador de 70 μm. Luego, lave el colador con 3 ml de medio de recubrimiento. Cuenta las celdas.
  3. Centrifugar la suspensión a ~300 × g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y lave las células con 20 ml de tampón de separación MACS helado. Luego, centrifugar nuevamente a ~ 300 × g durante 5 min.
  4. Resuspender el pellet en 80 μL de tampón de separación MACS frío por 5 × 106 células. Añadir 20 μL de cóctel frío de agotamiento no cardiomiocitario (humano) por 5 × 106 células. Mezclar suavemente la suspensión celular e incubar en hielo durante 10 min.
  5. Lave la muestra añadiendo 4 ml de tampón de separación MACS frío por 5 × 106 células. Centrifugar la muestra a ~300 × g durante 5 min y aspirar el sobrenadante.
  6. Resuspender el pellet en 80 μL de tampón de separación MACS frío por 5 × 106 células. Añadir 20 μL de microperlas antibiotina frías por 5 × 106 células. Mezclar suavemente la suspensión celular e incubar durante 10 minutos en hielo.
  7. Mientras las muestras se están incubando, coloque las columnas de agotamiento positivo (equipadas con los filtros de preseparación de 30 μm) en el separador MACS y coloque los tubos de recolección de 15 ml etiquetados debajo de las columnas. Se necesita una columna por cada 5 × 106 celdas.
  8. Prepare cada columna con 3 ml de tampón de separación MACS frío. Mezclar la suspensión celular tratada con anticuerpos con 2 ml de tampón de separación MACS por 5 × 106 células, y añadir a la columna.
    NOTA: ¡No centrifugar! La centrifugación en este paso tiene efectos perjudiciales sobre el rendimiento de los cardiomiocitos.
  9. Agregue 2 ml de tampón de separación MACS a cada columna y recoja el flujo hasta que se recojan 12 ml de suspensión de cardiomiocitos de flujo continuo.
    NOTA: Nunca permita que las columnas se sequen completamente.
  10. Centrifugar los cardiomiocitos a ~300 × g durante 5 min, desechar el sobrenadante y suspender los cardiomiocitos en 1 ml de medio de recubrimiento.
  11. Cuente las celdas para determinar la concentración, ajuste el volumen a la densidad de siembra deseada y coloque las celdas. Colocar en placa los cardiomiocitos purificados en las placas MECM de 96 pocillos, como se describió anteriormente en los pasos 1.9-1.11 (7,5 × 105 células/pocillo).

4. Mapeo óptico utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD) y fluoróforos sensibles al calcio (CSF)

  1. Preparar la cantidad adecuada de CIV en HBSS con calcio y magnesio, añadiendo 1 μL de colorante VSD por ml de HBSS y 10 μL de adyuvante de carga por ml de HBSS.
    NOTA: Normalmente, una placa de 96 pocillos requiere 10 ml de solución VSD.
  2. Alternativamente, prepare HBSS con calcio y magnesio suplementado con 5 μM de LCR. Aspirar el medio de mantenimiento de cardiomiocitos y reemplazar con 100 μL de CIV o LCR por pocillo de una placa de 96 pocillos. Incubar las células durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular.
  3. Retire los tintes y reemplácelos con medio de ensayo o HBSS. Equilibre a 37 °C para la adquisición de mapas ópticos de datos de referencia con un dispositivo de mapeo óptico de alto rendimiento.
  4. Trate las células con medicamentos para pruebas de exposición aguda, o mapee las células que fueron expuestas crónicamente a medicamentos de interés.
  5. Para pruebas de cardiotoxicidad en placas de 96 pocillos, use cuatro dosis de un compuesto con al menos seis pocillos por dosis. Use dosis que oscilen entre abajo y por encima de la concentración plasmática terapéutica efectiva, incluida una dosis de la concentración plasmática terapéutica clínica efectiva.
  6. Diluir los medicamentos en dimetilsulfóxido, almacenarlos como soluciones madre a -20 °C y luego diluirlos en HBSS a las concentraciones deseadas.
  7. Realizar mediciones electrofisiológicas basales antes de la aplicación del fármaco, como se describe en la sección 5. Una vez que se hayan aplicado los medicamentos, realice registros electrofisiológicos al menos 30 minutos más tarde para estudios crónicos. Consulte las siguientes secciones para conocer los procedimientos de adquisición y análisis de datos de mapeo óptico.

5. Mapeo óptico utilizando indicador de calcio codificado genéticamente (GECI)

  1. Placas disponibles comercialmente o hiPSC-CM purificadas por MACS, como se describió anteriormente, utilizando placas de 96 pocillos recubiertas con MECM para hacer hiPSC-CM maduras. Para formar monocapas confluentes, placa 7.5 × 104 CMs por pocillo de cada placa de 96 pocillos. Utilice el medio de chapado.
  2. Después de 48 h en el medio de recubrimiento, cambie al medio de mantenimiento de cardiomiocitos.
  3. El día 4 después de la descongelación y el replacado, agregue adenovirus recombinante para expresar GCaMP6m (AdGCaMP6m) a las células en una multiplicidad de infección (MOI) = 5. Agregue el virus usando el medio de ensayo CM.
    NOTA: Aquí, se realizaron experimentos con GCaMP6m en cardiomiocitos iCell2 de un proveedor comercial.
  4. El día 5, retire el medio adGCaMP6m y reemplácelo con RPMI + B27 nuevo (medio de mantenimiento de cardiomiocitos).
  5. El día 7, observe los CM utilizando microscopía o el generador de imágenes de mapeo óptico, para visualizar las contracciones espontáneas y los transitorios de calcio correspondientes.
  6. El día 7 o más tarde, para la detección de medicamentos, transfiera directamente placas de 96 pocillos de monocapas hiPSC-CM maduras que expresan GCaMP6m al generador de imágenes de mapeo óptico desde la incubadora para la adquisición de datos de referencia.
  7. Después de la adquisición de datos electrofisiológicos, devolver las placas de los CM a la incubadora de cultivo de tejidos, para mediciones en un punto de tiempo posterior.
  8. Después de los registros de referencia, aplique los medicamentos, usando al menos cuatro dosis de cada medicamento y al menos seis pocillos por dosis. Equilibre los medicamentos en las células durante al menos 30 minutos antes de la recopilación de datos. Caliente la temperatura del pozo a ~37 °C antes y durante la adquisición de datos.
  9. Después de los registros de referencia de una placa completa, agregue isoproterenol (500 nM) a cada pocillo para permitir datos sólidos de respuesta al medicamento. Cuantificar los efectos de isoproterenol sobre la frecuencia de latido monocapa, la amplitud de contracción (amplitud transitoria de calcio) y la duración transitoria del calcio (ver figura 6), como se describe en la sección 5.

6. Adquisición de datos y análisis de mapeo óptico

  1. Asegúrese de que la cámara del dispositivo de mapeo óptico, el transiluminador y el calentador de placas estén encendidos.
  2. Abra el software de adquisición y determine la ubicación de guardado del archivo.
  3. Abra el cajón frontal y coloque la placa en el calentador de placas.
  4. Adquiera un marco oscuro haciendo clic en el botón Marco oscuro .
  5. Seleccione Duración (10-30 s) y Velocidad de fotogramas de adquisición (por ejemplo, 100 fps; 250 fps para una resolución temporal más alta) y haga clic en Iniciar adquisición.
  6. Abra el software de análisis y, en la pestaña Importar/Filtrar , seleccione Buscar un solo archivo o Teselas múltiples para reconstruir una placa.
  7. Seleccione Modo de parámetro (APD o CaTD), introduzca Distancia por píxel y utilice el Asistente para pozos para determinar la ubicación de los pozos en la imagen. Haga clic en Procesar guardar para pasar a la siguiente pestaña.
  8. Abra la pestaña ROI (regiones de interés) y elija dibujar los ROI manualmente, automáticamente o no usar ROI en absoluto, que luego considerarían todo bien para el análisis. Después de seleccionar los ROI, haga clic en el botón Procesar/Guardar para pasar al siguiente paso. Marque las casillas Ocultar pozos y Mostrar solo filtros para visualizar los ROI.
  9. Abra la pestaña Análisis y, en la parte superior derecha de la pantalla, seleccione cada pozo o ROI para confirmar la precisión de la detección automática de latidos. Agregue o elimine ritmos de los rastros presionando Agregar ritmo / Guardar ritmos, o seleccionando un ritmo individual y presionando Eliminar en el teclado.
  10. Opcionalmente, utilice la función Mapas de calor promedio para crear mapas de calor de los parámetros seleccionados para la placa.
  11. Haga clic en el botón Diagrama espacio-temporal en la pestaña Análisis para visualizar los datos de cada pozo o el ROI. Después de asegurarse de que la detección de latido sea precisa, vaya a la pestaña Exportar y seleccione Formato de archivo. Pulse Exportar y cree una carpeta a la que se exportarán los datos. Proceda a abrir archivos de datos y ejecute la rutina de análisis estadístico elegida.
    NOTA: Se prefieren los archivos .xlxs ya que todos los parámetros se exportan en un solo archivo; Otros formatos (.csv o .tsv) generan un archivo por parámetro.

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Resultados

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Maduración de hiPSC-CM caracterizada por contraste de fase e imágenes confocales inmunofluorescentes
La línea de tiempo para la maduración mediada por ECM de hiPSC-CM disponibles comercialmente utilizando placas de 96 pocillos recubiertas con MECM se presenta en la Figura 1A. Estos datos se recopilan utilizando cardiomiocitos disponibles comercialmente que llegan al laboratorio como viales criopreservados de células. Cada vial contiene >5 × 106 cardiomiocito...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Existen varios enfoques diferentes para la detección de cardiotoxicidad in vitro utilizando hiPSC-CM. Un reciente documento de "Mejores prácticas" sobre el uso de hiPSC-CM presentó los diversos ensayos in vitro , sus lecturas primarias y, lo que es más importante, la granularidad de cada ensayo para cuantificar la función electrofisiológica cardíaca humana20. Además de usar electrodos perforadores de membrana, la medida más directa de la función electrofisiológica cardíaca humana...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TJH es consultor y asesor científico de StemBioSys, Inc. TB es un empleado de StemBioSys, Inc. AMR y JC son ex consultores de StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR y JC son accionistas de StemBioSys, Inc.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo ha sido apoyado por las subvenciones de los NIH HL148068-04 y R44ES027703-02 (TJH).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.25% Tripsina EDTAGibco25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 & mol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albúmina humanaSigmaA9731-1G
alfa actinina anticuerpoThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/A
https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Medio de ensayo transparente (fluorobrita)ThermoFisherA1896701Para adenovirus transducción
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Suero fetal bovino)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM medios de mantenimientoFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T. HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnesio sal hidratoSigmaA8960-5g
L-glutaminaGibco A2916801
LS columnasMiltenyii Biotec130-042-401
Búfer MACS (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping Microscopio confocal CuriBio
https://www.curibio.com/products-overview Nikon A1RAminoácidos
Gibco11140-050
filtro de preseparaciónMiltenyii Biotec130-041-407
Kit de aislamiento de cardiomiocitos derivado de PSC, humanoMiltenyii Biotec130-110-188
PulsoCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separador (Imán)Miltenyii Biotec130-091-051
Ácido retinoicoSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamina)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI anticuerpo (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (ácido etilendiaminotetraacético - solución de EDTA)Gibco15040-066
Y-27632 diclorhidratoTocris1254
β-mercaptoetanolGibco21985023
no esenciales Nikon

Referencias

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  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
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