Method Article

Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos

DOI:

10.3791/64364

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

In This Article

Summary

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Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) ofrecen una alternativa al uso de animales para la detección preclínica de cardiotoxicidad. Una limitación para la adopción generalizada de hiPSC-CM en la detección de toxicidad preclínica es el fenotipo inmaduro de las células. Aquí se presentan protocolos para la maduración robusta y rápida de hiPSC-CM.

Abstract

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Los cardiomiocitos derivados de células madre inducidas humanas (hiPSC-CM) se utilizan para reemplazar y reducir la dependencia de animales y células animales para pruebas preclínicas de cardiotoxicidad. En formatos monocapa bidimensionales, los hiPSC-CM recapitulan la estructura y función de las células del músculo cardíaco humano adulto cuando se cultivan en una matriz extracelular óptima (ECM). Una ECM (matriz extracelular inductora de maduración-MECM) derivada de células madre perinatales humanas madura la estructura, función y estado metabólico de hiPSC-CM en 7 días después de la placa.

Las monocapas maduras de hiPSC-CM también responden como se espera a los medicamentos clínicamente relevantes, con un riesgo conocido de causar arritmias y cardiotoxicidad. La maduración de las monocapas hiPSC-CM fue un obstáculo para la adopción generalizada de estas valiosas células para la ciencia regulatoria y la detección de seguridad, hasta ahora. Este artículo presenta métodos validados para el recubrimiento, la maduración y el fenotipado funcional de alto rendimiento de la función electrofisiológica y contráctil de hiPSC-CM. Estos métodos se aplican a los cardiomiocitos purificados disponibles comercialmente, así como a los cardiomiocitos derivados de células madre generados internamente utilizando protocolos de diferenciación altamente eficientes y específicos de la cámara.

La función electrofisiológica de alto rendimiento se mide utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD; emisión: 488 nm), fluoróforos sensibles al calcio (CSF) o sensores de calcio codificados genéticamente (GCaMP6). Se utiliza un dispositivo de mapeo óptico de alto rendimiento para las grabaciones ópticas de cada parámetro funcional, y se utiliza un software dedicado personalizado para el análisis de datos electrofisiológicos. Los protocolos MECM se aplican para la detección de medicamentos utilizando un inotrópico positivo (isoprenalina) y bloqueadores específicos del canal del gen humano relacionado con Ether-a-go-go (hERG). Estos recursos permitirán a otros investigadores utilizar con éxito hiPSC-CM maduros para la detección de cardiotoxicidad preclínica de alto rendimiento, pruebas de eficacia de medicamentos cardíacos e investigación cardiovascular.

Introduction

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Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) han sido validados a escala internacional y están disponibles para el cribado de cardiotoxicidad in vitro 1. Los hiPSC-CM de alta pureza pueden generarse en cantidades prácticamente ilimitadas, criopreservarse y descongelarse. Al rechapar, también se reaniman y comienzan a contraerse con un ritmo que recuerda al corazón humano 2,3. Sorprendentemente, los hiPSC-CM individuales se acoplan entre sí y forman una sincitia funcional que late como un solo tejido. Hoy en día, las hiPSCs se deri....

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Protocol

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El uso de hiPSC en este protocolo fue aprobado por el Comité HPSCRO de la Universidad de Michigan (Comité de Supervisión de Células Madre Pluripotentes Humanas). Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de materiales y equipos. Ver Tabla 1 para los medios y sus composiciones.

1. Descongelación y recubrimiento de hiPSC-CM criopreservados disponibles comercialmente para la maduración en una matriz extracelular inductora de maduración (MECM)

  1. Calentar todos los reactivos a temperatura ambiente y rehidratar las placas MECM con solución salina balanceada de Hank (HBSS) o s....

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Results

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Maduración de hiPSC-CM caracterizada por contraste de fase e imágenes confocales inmunofluorescentes
La línea de tiempo para la maduración mediada por ECM de hiPSC-CM disponibles comercialmente utilizando placas de 96 pocillos recubiertas con MECM se presenta en la Figura 1A. Estos datos se recopilan utilizando cardiomiocitos disponibles comercialmente que llegan al laboratorio como viales criopreservados de células. Cada vial contiene >5 × 106 cardiomiocito.......

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Discussion

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Existen varios enfoques diferentes para la detección de cardiotoxicidad in vitro utilizando hiPSC-CM. Un reciente documento de "Mejores prácticas" sobre el uso de hiPSC-CM presentó los diversos ensayos in vitro , sus lecturas primarias y, lo que es más importante, la granularidad de cada ensayo para cuantificar la función electrofisiológica cardíaca humana20. Además de usar electrodos perforadores de membrana, la medida más directa de la función electrofisiológica cardíaca humana.......

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Disclosures

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TJH es consultor y asesor científico de StemBioSys, Inc. TB es un empleado de StemBioSys, Inc. AMR y JC son ex consultores de StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR y JC son accionistas de StemBioSys, Inc.

Acknowledgements

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Este trabajo ha sido apoyado por las subvenciones de los NIH HL148068-04 y R44ES027703-02 (TJH).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Tripsina EDTAGibco25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 & mol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albúmina humanaSigmaA9731-1G
alfa actinina anticuerpoThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/A
https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Medio de ensayo transparente (fluorobrita)ThermoFisherA1896701Para adenovirus transducción
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Suero fetal bovino)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM medios de mantenimientoFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T. HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnesio sal hidratoSigmaA8960-5g
L-glutaminaGibco A2916801
LS columnasMiltenyii Biotec130-042-401
Búfer MACS (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping Microscopio confocal CuriBio
https://www.curibio.com/products-overview Nikon A1RAminoácidos
Gibco11140-050
filtro de preseparaciónMiltenyii Biotec130-041-407
Kit de aislamiento de cardiomiocitos derivado de PSC, humanoMiltenyii Biotec130-110-188
PulsoCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separador (Imán)Miltenyii Biotec130-091-051
Ácido retinoicoSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamina)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI anticuerpo (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (ácido etilendiaminotetraacético - solución de EDTA)Gibco15040-066
Y-27632 diclorhidratoTocris1254
β-mercaptoetanolGibco21985023
no esenciales Nikon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al.

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Cardiotoxicity ScreeningHiPSC CardiomyocytesMonolayer CultureExtracellular MatrixOptical MappingElectrophysiological AnalysisCalcium ImagingMagnetic Cell SortingDrug Response TestingAction Potential Measurement

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