Abordaje de cuestiones prácticas en la microindentación basada en microscopía de fuerza atómica en explantes de cartílago articular humano

Summary

Presentamos un enfoque paso a paso para identificar y abordar los problemas más comunes asociados con las microindentaciones de microscopía de fuerza atómica. Ejemplificamos los problemas emergentes en los explantes nativos de cartílago articular humano caracterizados por varios grados de degeneración impulsada por la osteoartritis.

Abstract

Sin lugar a dudas, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es actualmente una de las técnicas más potentes y útiles para evaluar micro e incluso nano-señales en el campo biológico. Sin embargo, al igual que con cualquier otro enfoque microscópico, pueden surgir desafíos metodológicos. En particular, las características de la muestra, la preparación de la muestra, el tipo de instrumento y la sonda de indentación pueden dar lugar a artefactos no deseados. En este protocolo, ejemplificamos estos problemas emergentes en explantes de cartílago articular sanos y osteoartríticos. Con este fin, primero mostramos a través de un enfoque paso a paso cómo generar, clasificar y clasificar visualmente discos de cartílago articular ex vivo de acuerdo con diferentes etapas de degeneración mediante imágenes de fluorescencia de mosaico 2D de gran tamaño de los explantes de tejido completo. La principal fortaleza del modelo ex vivo es que comprende cartílago humano nativo envejecido que permite la investigación de los cambios relacionados con la osteoartritis desde el inicio temprano hasta la progresión. Además, también se presentan los errores más comunes en la preparación de los tejidos, así como el procedimiento real de MFA junto con el posterior análisis de los datos. Mostramos cómo los pasos básicos pero cruciales, como la preparación y el procesamiento de la muestra, las características topográficas de la muestra causadas por la degeneración avanzada y la interacción muestra-punta, pueden afectar la adquisición de datos. También sometemos a escrutinio los problemas más comunes en la AFM y describimos, en la medida de lo posible, cómo superarlos. El conocimiento de estas limitaciones es de suma importancia para la correcta adquisición de datos, la interpretación y, en última instancia, la incorporación de los hallazgos en un contexto científico amplio.

Introduction

Debido al tamaño cada vez menor de los dispositivos y sistemas electrónicos, el rápido desarrollo de la tecnología y los equipos basados en micro y nano ha cobrado impulso. Uno de estos dispositivos es la microscopía de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés), que puede escanear superficies biológicas y recuperar información topográfica o biomecánica a escalas nanométricas y micrométricas ^1,2. Entre sus vastas características, esta herramienta puede ser operada como micro y nano indentador para obtener información sobre las propiedades mecánicas de diversos sistemas biológicos 3,....

Protocol

Se utilizaron cóndilos femorales recogidos de pacientes sometidos a artroplastia total de rodilla en el Hospital Universitario de Tübingen, Alemania. Solo se incluyeron en este estudio muestras de cartílago articular de pacientes con patologías articulares degenerativas y postraumáticas. Antes del inicio del estudio se obtuvo la aprobación de los comités de ética departamentales, institucionales y locales (Proyecto n.º 674/2016BO2). Se recibió el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de participar.

NOTA: En la Figura 1 se presenta un diagrama de flujo de los pasos del experimento en ....

Results

Utilizando un dispositivo de corte de fabricación propia, pudimos explantar y generar pequeños discos de cartílago (4 mm x 1 mm) a partir de cóndilos humanos frescos que contenían un patrón espacial celular^{único 30} de cuerdas simples (SS, Figura 2A), cuerdas dobles (DS), grupos pequeños (SC), grupos grandes (BC; Figura 2A) y difusa (Figura 2B). En la Figura 3A se muestra un expla.......

Discussion

Al ser una enfermedad progresiva y multifactorial, la artrosis desencadena cambios estructurales y funcionales en el cartílago articular. A lo largo del curso de la artrosis, las alteraciones en las características mecánicas se acompañan de cambios estructurales y bioquímicos en la superficie del cartílago articular^27,31. Los eventos patológicos más tempranos que ocurren en la OA son la depleción de proteoglicanos junto con la disrupción de la red de colágeno

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anfotericina B	Merck KGaA, Darmstadt, Alemania	1397-89-3
Cabezal de microscopo de fuerza atómica (AFM);	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlín, Alemania	JPK00518
Pegamento de muestra biocompatible	Bruker Nano GmbH, Berlín, Alemania	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, EE. UU.	14948	Tinción permeable a la membrana celular, utilizada para la clasificación de discos de cartílago: imágenes de vista superior
Voladizo	Bruker Nano GmbH, Berlín, Alemania	SAA-SPH-5UM	Frecuencia Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, longitud nom: 115μ m, ancho nom: 40 y mu; m,  Geometría: Rectangular, punta cilíndrica con un 5μ m radio final
cartílago dispositivo de ctting	Hecho a sí mismo	n/a	Dispositivo de corte de plástico que contiene enteros predefinidos de 4 mm x 1 mm
Cámara CDD integrada en el AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Alemania	Cámara DFK 31BF03
CDD integrada en el microscopio de fluorescencia	Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania	CM3050S
El software de procesamiento de datos para AFM	Bruker Nano GmbH, Berlín, Alemania	n/a	Versión 5.0.86,  se puede descargar gratuitamente desde el siguiente sitio web: https://customers.jpk.com
Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Alemania	41966052
Microscopio de fluorescencia (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania	11889113
Soporte de cantiliver para bloques de vidrio	Bruker Nano GmbH, Berlín, Alemania	SP-90-05 Bloque de	vidrio extra largo con caras inclinadas, diseñado especialmente para el uso con el JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Microscopio de contraste de fase invertida (integrado en el AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemania	L201306_03
medio L-15 de Leibovitz sin L-glutamina	Merck KGaA, Darmstadt, Alemania	F1315
Portaobjetos de vidrio para microscopio	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU	CLS294775X50
Medio de montaje con DAPI	ibidi GmbH, Grä estantería, Alemania	50011	Medios de montaje con contratinción nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) utilizados para la obtención de imágenes de cartílago  imagen de vista lateral
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.	P4333
Calentador de placa de Petri asociado con AFM (Calentador de placa de Petri)	Bruker Nano GmbH, Berlín, Alemania	T-05-0117
Bisturí	Feather Medical Products, Osaka, Japón	2023-01
Faldón de silicona	Bruker Nano GmbH, Berlín, Alemania	n/a	Membrana protectora de silicona (D55x0.25) que se coloca sobre la base de la base del bloque de vidrio para evitar la condensación media en la cabeza del AFM.
Programa estadístico - SPSS	IBM, Armonk, Nueva York, EE. UU	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Placas de cultivo de tejidos	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiza	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Países Bajos	SA6255012	Medio de inclusión soluble en agua