Este artículo proporciona un protocolo sencillo y claro para etiquetar los efectores secretados por Salmonella utilizando el sitio específico de expansión del código genético (GCE) e imágenes de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)
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Artículo de método
Imágenes de superresolución de proteínas secretadas por bacterias mediante la expansión del código genético
En este artículo
Resumen
Resumen
Los sistemas de secreción de tipo tres (T3SS) permiten a las bacterias gramnegativas inyectar una batería de proteínas efectoras directamente en el citosol de las células huésped eucariotas. Al ingresar, las proteínas efectoras inyectadas modulan cooperativamente las vías de señalización eucariotas y reprograman las funciones celulares, lo que permite la entrada y supervivencia bacteriana. El monitoreo y la localización de estas proteínas efectoras secretadas en el contexto de las infecciones proporciona una huella para definir la interfaz dinámica de las interacciones huésped-patógeno. Sin embargo, etiquetar e imaginar proteínas bacterianas en células huésped sin interrumpir su estructura / función es técnicamente desafiante.
La construcción de proteínas de fusión fluorescentes no resuelve este problema, porque las proteínas de fusión atascan el aparato secretor y, por lo tanto, no se secretan. Para superar estos obstáculos, recientemente empleamos un método para el marcado fluorescente específico del sitio de efectores secretados por bacterias, así como otras proteínas difíciles de etiquetar, utilizando la expansión del código genético (GCE). Este documento proporciona un protocolo completo paso a paso para etiquetar efectores secretados por Salmonella utilizando el sitio GCE específicamente, seguido de instrucciones para obtener imágenes de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)
Hallazgos recientes sugieren que la incorporación de aminoácidos no canónicos (ncAAs) a través de GCE, seguida de un marcado bio-ortogonal con colorantes que contienen tetrazina, es una técnica viable para el marcado selectivo y la visualización de proteínas secretadas bacterianas y el posterior análisis de imágenes en el huésped. El objetivo de este artículo es proporcionar un protocolo sencillo y claro que pueda ser empleado por investigadores interesados en realizar imágenes de súper resolución utilizando GCE para estudiar diversos procesos biológicos en bacterias y virus, así como las interacciones huésped-patógeno.
Introducción
Las infecciones bacterianas se han considerado durante mucho tiempo como un grave peligro para la salud humana. Los patógenos utilizan sistemas de defensa altamente evolucionados, extremadamente poderosos e intrincados, así como una variedad de factores de virulencia bacteriana (denominados proteínas efectoras) para evadir las respuestas inmunes del huésped y establecer infecciones 1,2. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a estos sistemas y el papel de las proteínas efectoras individuales aún se desconocen en gran medida debido a la escasez de enfoques adecuados para seguir directamente los com....
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Protocolo
1. Construcción de plásmidos
- Clone el gen que expresa el POI en un plásmido de expresión (por ejemplo, pET28a-sseJ 10TAG) que expresa el POI en E. coli BL21 (DE3). Este paso facilita la determinación de que los mutantes son funcionales.
- Para la visualización de efectores secretados por Salmonella en células huésped, construir un plásmido de expresión (pWSK29-sseJ-HA) que exprese el objetivo POI SseJ bajo el control de su promotor nativo, como se describe en informes anteriores 7,12,24. Usando mutagénesis....
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Resultados
Este documento de protocolo describe un método basado en GCE para el etiquetado fluorescente específico del sitio y la visualización de efectores secretados por Salmonella , como se muestra en la Figura 1. La estructura química del grupo bioortogonal transcicloocteno (TCO) que contiene ncAA y el colorante fluorescente se muestran en la Figura 1A. El marcado de SseJ se logró mediante la incorporación genética de ncAA bioo.......
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Discusión
El enfoque descrito en este documento se utilizó para rastrear la ubicación precisa de las proteínas efectoras inyectadas en la célula huésped por el T3SS bacteriano después de la infección. Los T3SS son empleados por patógenos intracelulares como Salmonella, Shigella y Yersinia para transportar componentes de virulencia al huésped. El desarrollo de tecnologías de imagen de superresolución ha permitido visualizar factores de virulencia a una resolución antes inimaginable12,13,.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos iniciales de la rama médica de la Universidad de Texas, Galveston, TX, y un premio Texas STAR a L.J.K. Agradecemos al Prof. Edward Lemke (Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Heidelberg, Alemania) por el plásmido pEVOL-PylRS-AF. Las imágenes de la Figura 1 se crearon con BioRender.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x Tampón de funcionamiento Tris/Glycine SDS | BIO-RAD | 1610732 | |
| Cloruro de amonio | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Sulfato de amonio | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicilina Sódica | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiótico-Antimicótico (100x) | ThermiFischer Scientific 15240096 | ||
| Arabinosa | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (Centrífuga de alto rendimiento) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, EE. UU. | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazina | Lumiprobe (EE. UU.) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoetanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Caseína | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalasa | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Cloranfenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Aminoácido / trans-Cyclooct-2-es – L - Lisina (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Tamaño: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Espectrofotómetro | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Utilizado para el mantenimiento de HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Utilizado para la infección bacteriana en presencia de ncAA, ver sección 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Burro anti-conejo Alexa fluoro555 anticuerpo secundario | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Cepa de E. coli BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| Cámara EMCCD | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1,5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburgo, Alemania | 30123.328 | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Filtros de jeringa - Estériles (PVDF 0.22 y micro; m) | Fischer Scientific | 97203 | Paquete de 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD 1652660 | ||
| Gentamicina | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamina (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucosa oxidasa | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glicerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| Células HeLa | ATTC | CCL-2 | |
| Tampón HEPES Corning | 25-060-C1 | 100 mL | |
| Ácido clorhórico | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Procesamiento y análisis de imágenes: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Tinción a base de Coomassie |
| Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazina | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamicina | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Caldo | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lisozima | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μ Gerente (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Cubeta de micro pulsos | BIO-RAD | 165-2086 | 0,2 cm espacio entre electrodos, paquete de 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Matraces de cultivo celular | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Ciencias de Microscopía Electrónica | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | Para la construcción de plásmidos y el mapa, consulte las siguientes referencias 1. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. | ||
| Kit de minipreparación de plásmidos | Qiagen | 27106 | |
| plásmido pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plásmido pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Mapa vectorial de PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 grado de proteína, solución al 10% | |
| fosfato de potasio monobásico | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Sulfato de potasio | Acros Organic 424220250 | ||
| Proteasa Inhibidor Set I - Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solución |
| Anticuerpo primario anti-HA de conejo | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Hidróxido de sodio | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Piruvato de sodio (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Desmembrador sónico modelo 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (sistema Leica TCS SP8 STED 3X) | Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| portaobjetos de cámara de cultivo de tejidos de pocillos X | SARSTEDT | 94.6190.802 |
Referencias
- Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretio....
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Reimpresiones y permisos
