Artículo de método

Imágenes de superresolución de proteínas secretadas por bacterias mediante la expansión del código genético

DOI:

10.3791/64382

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10 de febrero de 2023

 , 
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

En este artículo

Resumen

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Este artículo proporciona un protocolo sencillo y claro para etiquetar los efectores secretados por Salmonella utilizando el sitio específico de expansión del código genético (GCE) e imágenes de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)

Resumen

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Los sistemas de secreción de tipo tres (T3SS) permiten a las bacterias gramnegativas inyectar una batería de proteínas efectoras directamente en el citosol de las células huésped eucariotas. Al ingresar, las proteínas efectoras inyectadas modulan cooperativamente las vías de señalización eucariotas y reprograman las funciones celulares, lo que permite la entrada y supervivencia bacteriana. El monitoreo y la localización de estas proteínas efectoras secretadas en el contexto de las infecciones proporciona una huella para definir la interfaz dinámica de las interacciones huésped-patógeno. Sin embargo, etiquetar e imaginar proteínas bacterianas en células huésped sin interrumpir su estructura / función es técnicamente desafiante.

La construcción de proteínas de fusión fluorescentes no resuelve este problema, porque las proteínas de fusión atascan el aparato secretor y, por lo tanto, no se secretan. Para superar estos obstáculos, recientemente empleamos un método para el marcado fluorescente específico del sitio de efectores secretados por bacterias, así como otras proteínas difíciles de etiquetar, utilizando la expansión del código genético (GCE). Este documento proporciona un protocolo completo paso a paso para etiquetar efectores secretados por Salmonella utilizando el sitio GCE específicamente, seguido de instrucciones para obtener imágenes de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)

Hallazgos recientes sugieren que la incorporación de aminoácidos no canónicos (ncAAs) a través de GCE, seguida de un marcado bio-ortogonal con colorantes que contienen tetrazina, es una técnica viable para el marcado selectivo y la visualización de proteínas secretadas bacterianas y el posterior análisis de imágenes en el huésped. El objetivo de este artículo es proporcionar un protocolo sencillo y claro que pueda ser empleado por investigadores interesados en realizar imágenes de súper resolución utilizando GCE para estudiar diversos procesos biológicos en bacterias y virus, así como las interacciones huésped-patógeno.

Introducción

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Las infecciones bacterianas se han considerado durante mucho tiempo como un grave peligro para la salud humana. Los patógenos utilizan sistemas de defensa altamente evolucionados, extremadamente poderosos e intrincados, así como una variedad de factores de virulencia bacteriana (denominados proteínas efectoras) para evadir las respuestas inmunes del huésped y establecer infecciones 1,2. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a estos sistemas y el papel de las proteínas efectoras individuales aún se desconocen en gran medida debido a la escasez de enfoques adecuados para seguir directamente los componentes cruciales de las proteínas y los efectores en las células huésped durante la patogénesis.

Un ejemplo típico es Salmonella enterica serovar Typhimurium, que causa gastroenteritis aguda. Salmonella Typhimurium utiliza sistemas de secreción de tipo tres (T3SS) para inyectar una variedad de proteínas efectoras directamente en las células huésped. Tan pronto como la Salmonella entra en la célula huésped, reside en un compartimento ácido unido a la membrana, denominado vacuola que contiene Salmonella (SCV)3,4. El pH ácido del SCV activa la isla de patogenicidad de Salmonella 2 (SPI-2) codificada T3SS y transloca una descarga de 20 o más proteínas efectoras a través de la membrana vacuolar en el citosol del huésped 5,6,7,8. Dentro del huésped, estos complejos cócteles de proteínas efectoras manipulan coordinadamente las vías de señalización de la célula huésped, lo que resulta en la formación de estructuras de membrana tubular altamente dinámicas y complejas que se extienden desde el SCV a lo largo de los microtúbulos, denominados filamentos inducidos por Salmonella (SIF), que permiten que la Salmonella sobreviva y se replique dentro de las células huésped9,10,11.

Los métodos para visualizar, rastrear y monitorear las localizaciones efectoras bacterianas, y examinar su tráfico e interacciones dentro de las células huésped, proporcionan información crítica sobre los mecanismos que sustentan la patogénesis bacteriana. El etiquetado y localización de proteínas efectoras T3SS secretadas por Salmonella dentro de las células huésped ha demostrado ser un desafío tecnológico12,13; No obstante, el desarrollo de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente ha transformado nuestra capacidad para estudiar y visualizar proteínas dentro de los sistemas vivos. Sin embargo, el tamaño de las proteínas fluorescentes (~25-30 kDa)15 es a menudo comparable o incluso mayor que el de la proteína de interés (POI; por ejemplo, 13,65 kDa para SsaP, 37,4 kDa para SifA). De hecho, el etiquetado de proteínas fluorescentes de los efectores a menudo bloquea la secreción del efector marcado y bloquea el T3SS14.

Además, las proteínas fluorescentes son menos estables y emiten un bajo número de fotones antes del fotoblanqueo, limitando su uso en técnicas microscópicas de superresolución16,17,18, particularmente en microscopía de localización de fotoactivación (PALM), STORM y microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED). Si bien las propiedades fotofísicas de los colorantes fluorescentes orgánicos son superiores a las de las proteínas fluorescentes, los métodos / técnicas como CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 y HA-Tags 24,25 requieren un apéndice adicional de proteína o péptido que puede perjudicar la función estructural de la proteína efectora de interés al interferir con la modificación o el tráfico postraduccional. Un método alternativo que minimiza la modificación de proteínas necesaria implica la incorporación de ncAA en un POI durante la traducción a través de GCE. Los ncAA son fluorescentes o pueden hacerse fluorescentes a través de la química de clic 12,13,26,27,28.

Usando GCE, los ncAA con grupos bioortogonales diminutos y funcionales (como un grupo azida, ciclopropeno o ciclooctino) se pueden introducir en casi cualquier ubicación en una proteína diana. En esta estrategia, un codón nativo se intercambia con un codón raro como un codón de parada ámbar (TAG) en una posición específica en el gen del POI. La proteína modificada se expresa posteriormente en las células junto con un par ortogonal aminoacil-ARNt sintetasa/ARNt. El sitio activo de la ARNt sintetasa está diseñado para recibir solo un ncAA particular, que luego se une covalentemente al extremo 3 'del ARNt que reconoce el codón ámbar. El ncAA simplemente se introduce en el medio de crecimiento, pero debe ser absorbido por la célula y llegar al citosol donde la aminoacil-ARNt sintetasa (aaRS) puede unirlo al ARNt ortogonal; a continuación, se incorpora al POI en la ubicación especificada (véase la figura 1)12. Por lo tanto, GCE permite la incorporación específica del sitio de una plétora de grupos reactivos bioortogonales como cetona, azida, alquino, ciclooctino, transcicloocteno, tetrazina, norboneno, α, amida β-insaturada y biciclo [6.1.0]-nonino en un POI, superando potencialmente las limitaciones de los métodos convencionales de etiquetado de proteínas 12,26,27,28.

Las recientes tendencias emergentes en las técnicas de imagen de superresolución han abierto nuevas vías para investigar estructuras biológicas a nivel molecular. En particular, STORM, una técnica de superresolución basada en la localización de una sola molécula, se ha convertido en una herramienta invaluable para visualizar estructuras celulares hasta ~ 20-30 nm y es capaz de investigar procesos biológicos una molécula a la vez, descubriendo así los roles de las moléculas intracelulares que aún se desconocen en los estudios tradicionales promediados por conjuntos13 . Las técnicas de molécula única y súper resolución requieren una pequeña etiqueta con fluoróforos orgánicos brillantes y fotoestables para obtener la mejor resolución. Recientemente hemos demostrado que la GCE se puede utilizar para incorporar sondas adecuadas para imágenes de superresolución12.

Dos de las mejores opciones para el etiquetado de proteínas en las células son la biciclo [6.1.0] noninelisina (BCN) y la transcicloocteno-lisina (TCO; que se muestra en la Figura 1), que pueden codificarse genéticamente utilizando una variante del par ARNt / sintetasa (aquí denominado ARNt Pyl / PylRS AF), dondePyl representa pirrolisina, y AF representa un doble mutante diseñado racionalmente (Y306A, Y384F) derivado de Methanosarcina mazei que codifica naturalmente pirrolisina12, 29,30,31. A través de la reacción de cicloadición de Diels-Alder (SPIEDAC) de demanda inversa de electrones promovida por cepa, estos aminoácidos reaccionan quimioselectivamente con conjugados de tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tales reacciones de cicloadición son excepcionalmente rápidas y compatibles con las células vivas; También pueden ser fluorogénicos, si un fluoróforo apropiado se funcionaliza con la fracción tetrazina12,26,32. Este documento presenta un protocolo optimizado para monitorear la dinámica de los efectores bacterianos administrados en las células huésped utilizando GCE, seguido de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando dSTORM. Los resultados indican que la incorporación de un ncAA a través de GCE, seguida de una reacción de clic con colorantes fluorogénicos portadores de tetrazina, representa un método versátil para el marcado selectivo, la visualización de proteínas secretadas y la posterior localización subcelular en el huésped. Sin embargo, todos los componentes y procedimientos detallados aquí pueden ajustarse o sustituirse para que el sistema de GCE pueda adaptarse para investigar otras cuestiones biológicas.

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Protocolo

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1. Construcción de plásmidos

  1. Clone el gen que expresa el POI en un plásmido de expresión (por ejemplo, pET28a-sseJ 10TAG) que expresa el POI en E. coli BL21 (DE3). Este paso facilita la determinación de que los mutantes son funcionales.
  2. Para la visualización de efectores secretados por Salmonella en células huésped, construir un plásmido de expresión (pWSK29-sseJ-HA) que exprese el objetivo POI SseJ bajo el control de su promotor nativo, como se describe en informes anteriores 7,12,24. Usando mutagénesis dirigida al sitio, reemplazar el codón de fenilalanina-10 con un codón ámbar (TAG) en SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), asegurando el motivo AAT-TAG-ACT 33,34.
  3. Además de los plásmidos anteriores, para la incorporación genética de trans-ciclooct-2-en-L-lisina (TCO*A) en un POI, utilice otro plásmido de expresión (pEVOL-PylRS-AF)31 que contenga los genes evolucionados del par ARNt/sintetasa (tRNAPyl/PylRS AF ) codificados en el plásmido pEVOL.
    NOTA: Las descripciones detalladas del plásmido y los protocolos de clonación se describen en el informe anterior30,31.
  4. Utilice kits de preparación de plásmidos disponibles comercialmente para obtener ADN plásmido de alta calidad. Para el ADN purificado, la proporción óptima de 260/280 es ~ 1.8. Verifique la pureza del ADN usando electroforesis en gel de agarosa al 1%, si es necesario.

2. Preparación del cultivo bacteriano

  1. Obtención de transformadores dobles para probar que el mutante es funcional en E. coli
    1. Tome células competentes BL21 fuera de -80 ° C y descongele en hielo durante aproximadamente 20-30 min.
    2. Mezclar 1–5 μL de cada plásmido (~50 ng de pEVOL-PylRS-AF y pET28a-sseJ 10TAG) con 200 μL de células BL21 químicamente competentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mezcle suavemente las células competentes y la mezcla de plásmidos; Incubar durante 30 minutos en hielo.
    3. Choque térmico del tubo de microcentrífuga en un baño maría a 42 °C durante 45 s. Vuelva a poner los tubos en hielo durante 2 minutos.
    4. Agregue 1 ml de medio LB caliente al tubo de microcentrífuga y transfiera rápidamente la mezcla a un tubo cónico de 15 ml. Incubar las células a 37 °C en una agitadora a 250 rpm durante 1 h. Coloque en placa alguna porción o todas las células transformadas en placas de agar LB que contengan antibióticos apropiados. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
      NOTA: En este protocolo, se utilizaron 35 μg/mL de cloranfenicol y 50 μg/ml de kanamicina para seleccionar pEVOL-PylRS-AF y pET28a-sseJ 10TAG, respectivamente. En el paso de transformación, evalúe la transformación exitosa utilizando controles negativos y positivos.
  2. Transfiera el mutante a Salmonella para la visualización de efectores secretados por Salmonella en las células huésped:
    1. Añadir 2–3 μL de pEVOL-PylRS-AF y pWSK29-sseJ 10TAG a 40–60 μL de cepa electrocompetente de Salmonella Typhimurium 14028s en un tubo de microcentrífuga refrigerado. Mezclar la mezcla suavemente con una pipeta.
    2. Transfiera la mezcla de electroporación a una cubeta refrigerada (espacio de electrodos de 0,2 cm); ajuste los ajustes de electroporación a 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Coloque la cubeta dentro de la cámara de electroporación. Asegúrese de que el electrodo de la cámara haga contacto firme con la cubeta del micro pulsador.
    3. Mantén pulsado el botón de pulso hasta que emita un pitido.
    4. Agregue inmediatamente 1 ml de medio LB caliente en la cubeta. Transfiera todo el contenido a un tubo cónico de 15 ml. Incubar las células a 37 °C agitando a 250 rpm durante 1 h.
    5. Coloque una porción o la totalidad de la mezcla de electroporación de Salmonella en una placa de agar LB que contenga antibióticos apropiados. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
      NOTA: En este protocolo, se utilizaron 35 μg/ml de cloranfenicol y 100 μg/ml de ampicilina para la selección de pEVOL-PylRS-AF y pWSK29-sseJ 10TAG, respectivamente.
  3. Preparación del cultivo
    1. Inocular una sola colonia de Salmonella o E. coli en 5 ml de medio LB que contenga antibióticos apropiados. Cultivar durante la noche a 37 °C, agitando a 250 rpm.

3. Expresión y etiquetado fluorescente de proteínas portadoras de ncAA

  1. Expresión de proteínas portadoras de ncAA en E. coli
    1. Transfiera 100 μL de cultivo primario a 5 ml de medio LB (dilución 1:50) que contenga 35 μg/ml de cloranfenicol y 50 μg/ml de kanamicina, seguido de incubación a 37 °C con agitación a 250 rpm hasta que el OD600 alcance 0,4–0,6.
    2. Preparar 1 mM de solución madre TCO*A (10 mL; Tabla 1).
    3. Cuando los cultivos alcancen OD600 = 0.4–0.6, reemplace el medio LB con LB fresco que contenga 1 mM TCO*A, 35 μg/ml de cloranfenicol y 50 μg/ml de kanamicina.
      NOTA: Alternativamente, se puede preparar una solución madre TCO*A como se describe en el paso 5.4.2.
    4. Inducir la expresión de proteínas en presencia de 1 mM de IPTG, 0,2% de arabinosa y agitar durante la noche a 34 °C, 250 rpm. Cosechar las células bacterianas por centrifugación durante 5 min a 11.000 × g. Retirar el sobrenadante y congelar el pellet a -20 °C hasta su uso posterior.
    5. Para un experimento de control, repita el mismo experimento pero exprese las proteínas portadoras de ncAA en ausencia de ncAA. Para el marcado fluorescente in vitro de proteínas portadoras de ncAA en E. coli, siga el procedimiento detallado descrito en el paso 3.3.
  2. Expresión de proteínas portadoras de ncAA en Salmonella
    1. Transfiera 100 μL de cultivo primario a 5 ml de medio LB (dilución 1:50) que contenga 35 μg/ml de cloranfenicol y 100 μg/ml de ampicilina, seguido de incubación a 37 °C con agitación a 250 rpm hasta que el OD600 alcance 0,6.
    2. Preparar el medio N-mínimo modificado (MgM, pH 5.6) como se describe en la Tabla 1.
    3. Sustituir el medio LB por un medio N-mínimo modificado (MgM) suplementado con 1 mM TCO*A (Tabla 1). Cultivar las bacterias a 34 °C durante 30 min. Luego, agregue 0.2% de arabinosa, 25 mg / ml de cloranfenicol y 100 mg / ml de ampicilina, y haga crecer las células durante otras 6 h, agitando a 250 rpm.
    4. Después de 6 h, lavar las bacterias 4 veces durante un intervalo de 30 min, con medios frescos de MgM (pH 5.6) (Tabla 1) sin ncAA. En los pasos de lavado, use 972 × g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    5. Centrifugar las bacterias, resuspender en 1x tampón PBS e incubar durante 1 h a 4 °C en la oscuridad para eliminar el exceso de ncAAs. Después de 1 h, centrifugar las bacterias a 3.000 × g, 4 °C durante 15 min y almacenar para su uso posterior.
    6. Para un experimento de control, repita el mismo experimento expresando proteínas portadoras de ncAA en ausencia de ncAA.
  3. Marcado de fluorescencia in vitro de proteínas portadoras de ncAA en Salmonella Typhimurium
    1. Resuspender las células de Salmonella que expresan SseJ-F10TCO-HA en ausencia o presencia de TCO*A (a partir del paso 3.2) en 1x PBS. Ajuste el OD600 a 4 en PBS. Incubar las células con 20 μM Janelia Fluor 646-tetrazina (JF646-Tz) o 20 μM BDP-Fl-tetrazina (5 mM de soluciones madre en DMSO) a 37 °C en la oscuridad y agitar durante 1-2 h a 250 rpm.
    2. Granular las células, lavar 3-4x con PBS que contiene 5% de DMSO y 0,2% de Pluronic F-127, resuspender en PBS que contiene 5% de DMSO e incubar durante la noche a 4 °C en la oscuridad. Lave 2x de nuevo con 1x PBS. En los pasos de lavado, use 972 × g, durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    3. Obtener imágenes de las células inmediatamente usando un microscopio confocal o fijarlas con paraformaldehído al 1,5% (PFA) en PBS durante 30-45 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
    4. Lavar las celdas fijas 2x con PBS y finalmente en 50 mM NH4Cl en PBS durante 15 min para eliminar el exceso de PFA. Resuspender las células en PBS y almacenar a 4 °C durante no más de 3-4 días. Obtener imágenes de las bacterias mediante microscopía confocal, como se describe en la sección 6.

4. Caracterización bioquímica de proteínas portadoras de ncAA

  1. Lisis celular
    1. Resuspender las células de la sección 3.1 en tampón de lisis (Tabla 1) e incubar a temperatura ambiente durante más de 30 min. Enfríe la mezcla en hielo durante 15 minutos.
      NOTA: Mantenga la relación entre el tampón de lisis y el peso celular utilizado a 1:10.
    2. Sonicar las células resuspendidas mientras aún están en hielo. Pulse durante 30 s en el ajuste 7 al menos 6x, con espacios de 1 minuto, utilizando un sonicador (consulte la Tabla de materiales).
    3. Girar el lisado celular a 20.500 × g, 4 °C durante 15 min (mantener 4 °C es crítico). Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el pellet.
  2. Análisis SDS-PAGE
    1. Prepare 5x SDS cargando tinte (Tabla 1). Añadir 5 μL de tampón de carga de gel SDS a 13 μL de lisado celular. Desnaturalice las proteínas con tampón de muestra de dodecil sulfato de sodio (SDS) en un tubo de 2 ml a 95 °C durante 10 min, centrifugar la mezcla a 2.000 × g durante 50 s y cargar en un gel de poliacrilamida SDS al 12%.
    2. Ensamble el casete de gel, colóquelo en un aparato de electroforesis en gel y conecte el aparato de electroforesis a una fuente de alimentación eléctrica. Vierta el tampón de funcionamiento, cargue los marcadores de peso molecular y las muestras de proteínas, y ejecute el gel a 100 V, hasta que el bromofenol llegue al fondo del gel de resolución.
      NOTA: Comience el análisis inmediatamente, ya que los lisados almacenados a -20 °C tienden a perder calidad después de cada ciclo de congelación-descongelación.
    3. Mancha el gel con tinción de proteína azul de Coomassie.

5. Etiquetado bioortogonal del efector secretado por Salmonella SseJ-F10TCO-HA en células HeLa

  1. Cultivar y mantener células HeLa a 37 °C, 5% deCO2 y 95% de humedad en un medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa (4,5 g/L), suplementado con FBS al 10% (v/v) además de penicilina-estreptomicina (1x).
  2. Cultivar bacterias 1 día antes de la infección. Inocular una sola colonia de Salmonella 14028s que albergue pEVOL-PylRS-AF y pWSK29-sseJ 10TAG en 5 ml de caldo LB estándar que contenga antibióticos durante la noche a 37 °C, agitando a 250 rpm.
  3. Semilla de células HeLa 1 día antes de la infección. Tome un matraz de cultivo de tejidos (T-75) que contenga células HeLa a ~80% de confluencia, según lo determinado por el examen microscópico de la densidad celular. Lave las celdas con PBS caliente. Separar las células con 3 ml de tripsina/EDTA caliente al 0,25% durante 5 min a 37 °C, 5% deCO2.
    1. Apague la tripsina usando 2 ml de DMEM (+ 10% FBS). Transfiera todo el contenido del matraz a un tubo de 15 ml después de resuspender las células. Gire las celdas a 1.000 × g durante 5 minutos. Saque el sobrenadante del tubo. Resuspender el pellet de células HeLa en medio de crecimiento precalentado.
    2. Use un hemocitómetro para examinar la suspensión y contar las células presentes. Preparar un material celular diluido a 1 × 105 células/ml. Semilla 0.5 × 105 células HeLa por pocillo en 500 μL de DMEM + 10% de medio de crecimiento FBS en un portaobjetos de cámara de ocho pocillos. Mantener el portaobjetos de la cámara en una incubadora a 37 °C, 5% CO2, 95% de humedad durante 24 h.
  4. Infección bacteriana
    1. Subcultivo de Salmonella 14028s que alberga pEVOL-PylRS-AF y pWSK29-sseJ 10TAG, diluyendo 100 μL de cultivo bacteriano durante la noche (desde el paso 5.2) en 3 ml de medio LB (dilución 1:30) que contiene 35 μg/ml de cloranfenicol y 100 μg/ml de ampicilina, seguido de incubación a 37 °C con agitación a 250 rpm durante 5-7 h.
      NOTA: Durante esta fase, los cultivos alcanzan la fase exponencial tardía, y las bacterias son altamente invasivas.
    2. Preparar una solución madre de TCO de 100 mM*A y un medio completo (Tabla 1).
    3. Para iniciar la infección de células HeLa, saque las células HeLa de la incubadora y lave las células con DPBS precalentado antes de agregar 500 μL de DMEM fresco (+10% FBS) a cada pocillo. Coloque la cámara deslizante de nuevo en la incubadora deCO2 hasta que comience la infección.
    4. Después de 5-7 h de incubación, diluir el cultivo de Salmonella a OD600 = 0.2 en 1 ml de medio de crecimiento DMEM (~ 3 × 108 ufc / ml). Agregue las cantidades requeridas del inóculo de Salmonella en cada pocillo del portaobjetos de la cámara para que la multiplicidad de infección (MOI) sea 100.
    5. Incubar las células infectadas en una incubadora deCO2 durante 30 minutos. Lave las células 3 veces con DPBS precalentado para eliminar la Salmonella extracelular. Establezca este punto de tiempo en 0 h después de la infección. Añadir 500 μL de medio completo (Tabla 1) que contenga 100 μg/ml de gentamicina durante 1 h. Después de 1 h, lavar las células 3 veces con DPBS. Añadir 500 μL del medio completo (del paso 5.4.2; Tabla 1) suplementado con arabinosa al 0,2%, 10 μg/ml de gentamicina en cada pocillo del portaobjetos de la cámara.
    6. En un experimento de control, realice infecciones similares de células HeLa sin TCO*A.
    7. Incubar el portaobjetos de la cámara durante 10 h en la incubadora deCO2 .
  5. Haga clic en el etiquetado basado en la química en células vivas
    1. Proceda a etiquetar las células infectadas por bacterias. Precaliente el medio completo sin TCO*A (Tabla 1).
    2. Después de 10 h después de la infección, reemplace el medio completo con medio completo fresco sin TCO*A y lave las células HeLa 4 veces durante un intervalo de 30 minutos cada una con DPBS precalentado, seguido de un medio completo fresco (sin TCO*A).
    3. Preparar una solución madre de colorante-tetrazina de 0,5 mM en DMSO.
      NOTA: Para el etiquetado de efectores secretados por Salmonella en las células huésped, se presentan dos protocolos. Para el protocolo 1, preparar la mezcla de colorante diluyendo el caldo JF646-Tz en 1x PBS que contenga 1% de sal sódica de caseína de leche bovina de modo que la solución de trabajo final sea de 2 μM. Para el protocolo 2, prepare un medio completo caliente (sin FBS y TCO*A) y agregue 2 μM JF646-Tz. Haga esta mezcla de colorante fresca para cada sesión de etiquetado. Trabaje en la oscuridad si es posible (atenúe las luces en el capó y / o la habitación).
    4. Después de 12 h después de la infección, aspirar el medio de las células. Lave la celda con DPBS precalentado 2x o 3x. En un grupo de pocillos, añadir 500 μL de la mezcla de solución de colorante descrita en el protocolo 1, y en otro grupo de pocillos del mismo portaobjetos de cámara, añadir 500 μL de la mezcla de solución de colorante descrita en el protocolo 2 mencionado en el paso 5.5.3 y la nota siguiente. Coloque la cámara deslizándose de nuevo en la incubadora deCO2 durante 1,5-2 h.
    5. Después de 13.5-14 h después de la infección, enjuague las células HeLa 2x con DPBS precalentado. Agregue 500 μL de DMEM fresco (suplementado con FBS). Coloque la corredera de la cámara de nuevo en la incubadora durante 30 minutos. Lave las celdas con DPBS precalentado seguido de DMEM fresco 4x durante un intervalo de 30 min.
    6. A las 16 h después de la infección, fijar las células HeLa con PFA añadiendo 200 μL de PFA al 4% en cada pocillo e incubando durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Aspirar el PFA, enjuagar 3 veces con PBS y almacenar las células en PBS a 4 °C en la oscuridad.
      NOTA: El PFA es un producto químico altamente tóxico. Evite la inhalación, así como el contacto con la piel y los ojos. Use equipo de protección cuando lo manipule. Para evitar que la muestra marcada se exponga a la luz, apague la luz en la campana de cultivo celular.
  6. Inmunotinción de proteínas marcadas con HA
    1. Aspirar el PBS y enjuagar una vez en solución de bloqueo (Tabla 1).
    2. Incubar las células HeLa fijas con una solución de anticuerpos primarios basada en PBS (Tabla 1) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Use un anticuerpo primario anti-HA de conejo para teñir la SseJ secretada (dilución 1:500).
    3. Después de 1 h, lavar suavemente las células 2x con 0.5 mL de 0.1% Tween-20/1x PBS. Durante los lavados con solución Tween/PBS, incubar las células 3x con 0,5 mL de Tween20/1x PBS al 0,1% durante 5 min.
    4. Diluir el anticuerpo secundario burro anti-conejo 555 1:500 en solución de anticuerpos secundarios e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
    5. Después de 1 h, lavar suavemente las células 2x con 0.5 mL de 0.1% Tween-20/1x PBS e incubar 2x con 0.5 mL de 0.1% Tween20/1x PBS durante 5 min.
    6. Lave las células 3 veces con 0,5 ml de 1x PBS y guárdelas a 4 °C en la oscuridad.
      NOTA: Las celdas fijas se pueden almacenar durante un par de semanas en PBS a 4 °C. La inmunotinción debe realizarse en el último minuto.

6. Imágenes confocales

  1. Use un microscopio confocal, como un disco giratorio (SD) o un microscopio STED.
    1. Ajuste la configuración de adquisición de imágenes, como el modo de escaneo (XYZ), la velocidad de escaneo (400 Hz), la resolución (512 x 512), la ampliación (100x) y el apilamiento Z.
    2. Utilice los filtros de excitación/emisión correctos para DAPI, BDP-Tz y JF646 tetrazina.
      NOTA: Para este protocolo, las imágenes confocales se realizaron en un sistema de microscopio STED equipado con un láser de luz blanca pulsada, lo que permite la selección de excitación en el rango de 470-670 nm y un láser de diodo UV 405 nm para excitación a 405 nm, 488 nm y 647 nm. Los rangos de emisión apropiados se configuraron utilizando el divisor de haz acústico-óptico incorporado en combinación con una detección espectral multibanda sintonizable basada en prismas del sistema confocal.
    3. Adquiera las imágenes utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100×/1.4.

7. Imágenes de superresolución (dSTORM)

  1. Encienda el microscopio 3 h antes de obtener imágenes para permitir el equilibrio térmico (es más probable que ocurra una deriva si las imágenes comienzan antes de esto). Enfríe la cámara a -70 °C.
  2. Mientras tanto, prepare un nuevo tampón de imágenes GLOX-BME (Tabla 1).
  3. Lleve las células al microscopio. Coloque la cámara de imágenes en la etapa del microscopio en el portamuestras. En el soporte, asegúrese de que la muestra esté plana y segura. Cambie el medio en el pocillo con 0,4 ml del tampón de imágenes GLOX-BME recién hecho.
  4. Establezca la línea láser y los conjuntos de filtros correctos. Disminuya la potencia del láser a ~ 1 mW para identificar una célula HeLa de interés. Ajuste el plano focal y el ángulo del rayo láser mientras ilumina la muestra con densidades láser bajas de 647 nm (en este caso, se sugiere un ángulo inclinado pronunciadamente [HILO], ya que HILO eleva la señal a fondo [SBR]). Ajuste el ángulo de iluminación HILO.
    NOTA: En este protocolo, las imágenes de súper resolución de SseJ se adquirieron en el canal Alexa Fluor 647 utilizando un microscopio de epifluorescencia invertido (consulte la Tabla de materiales), equipado con un objetivo TIRF (objetivo de inmersión en aceite 100x Apo TIRF, NA 1.49). La fluorescencia se detectó con una cámara EMCCD, que se controló a través de μManager.
  5. Ajuste la ganancia del preamplificador a 3 y active la transferencia de trama en μManager. Establezca EM-gain en 200 para una mayor sensibilidad en las mediciones de dSTORM, como se describe en un informe anterior35.
  6. Antes de las imágenes dSTORM, capture una imagen de referencia limitada por difracción de la estructura objetivo. Cambie los fluoróforos al estado oscuro encendiendo el láser a su máxima potencia.
    NOTA: Se observaron moléculas individuales y parpadeantes rápidas de fluoróforos JF646 cuando los fluoróforos JF646 se transformaron a un estado predominantemente oscuro mediante iluminación continua de luz de excitación de 647 nm, como se describió anteriormente36.
  7. Ajuste la fuerza del láser a un nivel adecuado donde los eventos de parpadeo estén separados en el espacio y el tiempo, establezca el tiempo de exposición en 30 ms y comience la adquisición. Adquiere entre 10.000 y 30.000 fotogramas.
    NOTA: Se deben realizar cambios en la fuerza del láser para optimizar el parpadeo. Considere aumentar la intensidad del láser si se detectan demasiados eventos (partículas parpadeantes que se superponen). La longitud ideal depende de la calidad de la muestra, pero ~ 10,000 cuadros deben mostrar características discernibles.

8. Reconstrucción de imágenes de dSTORM

  1. Utilice el software apropiado para el análisis de imágenes.
    NOTA: ThunderSTORM, uno de los muchos programas de reconstrucción de imágenes de código abierto disponibles, se describe brevemente a continuación.
  2. Abra ImageJ e importe los datos sin procesar. Abra el complemento ThunderSTORM y configure la configuración de la cámara correspondiente al dispositivo.
  3. Vaya a Ejecutar análisis y establezca la configuración adecuada, como el filtrado de imágenes (diferencia de filtros promedio), los métodos de localización (máximo local) y la localización de subpíxeles de moléculas (PSF gaussiano integrado). Haga clic en Aceptar para iniciar la reconstrucción de la imagen.
    NOTA: Si es necesario, ya se han descrito instrucciones detalladas para configurar los parámetros en ThunderSTORM37.

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Resultados

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Este documento de protocolo describe un método basado en GCE para el etiquetado fluorescente específico del sitio y la visualización de efectores secretados por Salmonella , como se muestra en la Figura 1. La estructura química del grupo bioortogonal transcicloocteno (TCO) que contiene ncAA y el colorante fluorescente se muestran en la Figura 1A. El marcado de SseJ se logró mediante la incorporación genética de ncAA bioo...

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Discusión

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El enfoque descrito en este documento se utilizó para rastrear la ubicación precisa de las proteínas efectoras inyectadas en la célula huésped por el T3SS bacteriano después de la infección. Los T3SS son empleados por patógenos intracelulares como Salmonella, Shigella y Yersinia para transportar componentes de virulencia al huésped. El desarrollo de tecnologías de imagen de superresolución ha permitido visualizar factores de virulencia a una resolución antes inimaginable12,13,...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por fondos iniciales de la rama médica de la Universidad de Texas, Galveston, TX, y un premio Texas STAR a L.J.K. Agradecemos al Prof. Edward Lemke (Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Heidelberg, Alemania) por el plásmido pEVOL-PylRS-AF. Las imágenes de la Figura 1 se crearon con BioRender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x Tampón de funcionamiento Tris/Glycine SDSBIO-RAD1610732
Cloruro de amonioFischer ScientificA661-500
Sulfato de amonioFischer ScientificBP212R-1
Ampicilina SódicaSigma-AldrichA01665 g
Antibiótico-Antimicótico (100x)ThermiFischer Scientific 15240096
ArabinosaSigma-AldrichA3256500 g
Avanti J-26XP (Centrífuga de alto rendimiento)Beckman Coulter
Bacto-AgarBD Diagnostics, Franklin Lakes, EE. UU.214010
BDP-FL-tetrazinaLumiprobe (EE. UU.)2.14E+02
β-mercaptoetanolMillipore444203250 mL
Azul de bromofenolSigma-AldrichB8026
BSASigma-AldrichA4503500 g
CaseínaSigma-AldrichC8654
CatalasaSigma-AldrichC9322
CloranfenicolSigma-AldrichC1919
Click Aminoácido / trans-Cyclooct-2-es – L - Lisina (TCO*A)SiChem GmbHSC-8008Tamaño: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)InvitrogenH3570
DeNovix DS-11+ EspectrofotómetroDeNovix
DMEM*Corning10-013-CV* Utilizado para el mantenimiento de HeLa Cell
DMEM**Gibco11965-092**Utilizado para la infección bacteriana en presencia de ncAA, ver sección 5.4.
DMSOSigma-AldrichD8418250 g
Burro anti-conejo Alexa fluoro555 anticuerpo secundarioInvitrogenA-31572
DPBS, 1xCorning21-031-CV
Cepa de E. coli BL21 (DE3)Novagen (Madison, WI)
Cámara EMCCDAndoriXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1,5 mL (PCR clean)Eppendorf, Hamburgo, Alemania30123.328
Suero Fetal Bovino (FBS)Fischer10082147
Fisherbrand Filtros de jeringa - Estériles (PVDF 0.22 y micro; m)Fischer Scientific97203Paquete de 100
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBIO-RAD 1652660
GentamicinaSigma-AldrichG127210 mL
Gibco L-Glutamina (200 mM), 100xFischer Scientific25-030-081
Glucosa oxidasaSigma-AldrichG7141-50KU
GlicerolFischer ScientificBF229-4
Células HeLaATTCCCL-2
Tampón HEPES Corning25-060-C1100 mL
Ácido clorhóricoFischer ScientificA144-212
ImageJProcesamiento y análisis de imágenes:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlueExpedeonISB1LTinción a base de Coomassie
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)Sigma-AldrichI5502
Janelia Fluoro 646-tetrazinaTocris Bioscience7279
KanamicinaSigma-Aldrich606155 g
LB CaldoBD Difco244620500 g
LisozimaSigma-AldrichL6876
μ Gerente (v. 1.4.2)https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MESSigma-AldrichM3671250 g
Cubeta de micro pulsosBIO-RAD165-20860,2 cm espacio entre electrodos, paquete de 50
Nikon N-STORMNikon Instruments Inc.https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Matraces de cultivo celularThermiFischer Scientific156499
Omnipur Casamino AcidCalbiochem2240500 g
Paraformaldehhyde (PFA)Ciencias de Microscopía Electrónica 15710
PBS (10x)Roche11666789001
Solución de penicilina-estreptomicina (100x)GenDEPOT CA005-010100 mL
pEVOL-PylRS-AFPara la construcción de plásmidos y el mapa, consulte las siguientes referencias
1. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Kit de minipreparación de plásmidosQiagen27106
plásmido pWSK29-sseJ10TAG-HARef.: elife. 2021, 10, e67789.
plásmido pWSK29-sseJ-HARef.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                                                                                    Mapa vectorial de PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127Millipore540025 grado de proteína, solución al 10%
fosfato de potasio monobásicoFischer ScientificP285-500
Sulfato de potasioAcros Organic 424220250
Proteasa Inhibidor Set I - CalbiochemSigma-Aldrich539131100x Solución
Anticuerpo primario anti-HA de conejoSigma-AldrichH6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028sRef.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
SaponinaSigma-Aldrich47036-50G-F
Dodecil sulfato de sodio (SDS)Sigma-AldrichL3771
Hidróxido de sodioFischer ScientificSS255-1
Piruvato de sodio (100 mM), 100xCorning25-060-C1100 mL
Desmembrador sónico modelo 100Fischer Scientific24932
STED microsocpe (sistema Leica TCS SP8 STED 3X)Leica Microsystems, Wetzlar, Alemaniahttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORMhttps://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT CA014-010
Tween-20Sigma-AldrichP9416100 mL
portaobjetos de cámara de cultivo de tejidos de pocillos XSARSTEDT94.6190.802

Referencias

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