Un dispositivo de terapia fotodinámica construido internamente y basado en diodos emisores de luz para mejorar la citotoxicidad de la verteporina en un modelo de cultivo celular 2D

Resumen

Aquí, describimos un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar con éxito ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD) utilizando cultivo de células HeLa bidimensionales y verteporfina como fotosensibilizador.

Resumen

Este documento describe un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD), llamado PhotoACT. El dispositivo se construyó utilizando un conjunto de diodos emisores de luz (LED) programables convencionales, un módulo de pantalla de cristal líquido (LCD) y un sensor de luz conectado a una placa de microcontrolador comercial. La estructura basada en caja del prototipo se hizo con tableros de fibra de densidad media (MDF). El compartimento interno puede asignar simultáneamente cuatro microplacas multipocillos de cultivo celular.

Como prueba de concepto, estudiamos el efecto citotóxico de la verteporfina fotosensibilizadora (PS) contra la línea celular HeLa en cultivo bidimensional (2D). Las células HeLa fueron tratadas con concentraciones crecientes de verteporfina durante 24 h. Se descartó el medio sobrenadante que contenía fármaco, las células adherentes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se agregó un medio libre de fármaco. En este estudio, el efecto de la verteporfina en las células se examinó sin exposición a la luz o después de la exposición durante 1 h a la luz utilizando valores rojo-verde-azul (RGB) de 255, 255 y 255 (fluencia promedio de 49.1 ± 0.6 J / cm²). Después de 24 h, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT).

Los resultados experimentales mostraron que la exposición de las células tratadas con verteporfina a la luz del dispositivo mejora el efecto citotóxico del fármaco a través de un mecanismo mediado por especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, el uso del prototipo descrito en este trabajo se validó comparando los resultados con un dispositivo PDT comercial. Por lo tanto, este prototipo de terapia fotodinámica basada en LED representa una buena alternativa para los estudios in vitro de TFD.

Introducción

Entre las enfermedades no transmisibles más letales, el cáncer representa una de las principales causas mundiales de muerte prematura. Representó casi 10 millones de muertes en 2020, lo que representa aproximadamente una de cada seis muertes en todo el mundo¹. Además, el fenómeno de la resistencia a múltiples fármacos (MDR) representa una tremenda amenaza para la salud pública, ya que los protocolos quimioterapéuticos aprobados no alcanzan las etapas de remisión para esta condición clínica². Las células cancerosas pueden desarrollar resistencia a la quimioterapia a través de varios mecanismos; sin embargo, la sobreexpres....

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y software utilizados en este protocolo.

1. Construcción del dispositivo

1. Sierra de 3 mm de espesor de tableros de fibra de densidad media (MDF) para obtener piezas con las dimensiones mostradas en la Figura 1A.
   NOTA: Utilice el archivo vectorial (archivo complementario 1) para el corte de control numérico computarizado (CNC).
2. Construya dos cajas con las siguientes dimensiones (largo x ancho x alto): 330 mm x 235 mm x 225 mm para la....

Resultados

El dispositivo PDT final, llamado PhotoACT, incluía una cámara oscura para asignar hasta cuatro microplacas multipocil, con su superficie interior superior equipada con un conjunto de 30 LED dispersos programados para emitir distintos espectros de luz visible (Figura 3 y Archivo Suplementario 6). El dispositivo se construyó utilizando dos cajas asociadas: una caja interna diseñada como una cámara oscura para los ensayos PDT, y una caja externa para cubrir la cámara interna y.......

Discusión

El dispositivo PhotoACT final fue conveniente de construir con componentes de bajo costo disponibles comercialmente a un costo total de menos de $ 50. Las ventajas adicionales incluyen bajas demandas de mantenimiento, la capacidad de irradiar múltiples tipos de placas de cultivo, el uso simultáneo de hasta cuatro unidades por ensayo, bajo peso (2 kg) / tamaño (44 cm³) que permite la portabilidad, irradiación precisa y reproducible (datos no mostrados) y una interfaz de configuración fácil de usar y simple que .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5% Tripsina-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Reactivo de disociación de cultivo de células de mamíferos
Impresora 3D	Flashforge		Finder modelo
Placas de 96 pocillos Placas			de superficie no estériles, de poliestireno y de alta adherencia con pocillos de fondo plano utilizadas para el cultivo celular 2D
Arduino
Sensor		de brillo	Modelo TSL2561 con niveles de detección de 0,1-40.000+ lux e interfaz I2C
Botones
Zumbador
Matraces			Matraz de fondo rectangular estéril de poliestireno con superficie tratada con cultivo de tejidos (TC), cuello inclinado y tapón de ventilación (tamaños)
Tubos de			centrífugaTubos estériles de polipropileno con una capacidad de 15/50 mL utilizados para la dilución de cultivos celulares en la etapa de siembra del ensayo
CO2 Placa
	ESP32
			DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) es un medio basal ampliamente utilizado para apoyar el crecimiento de muchas células de mamíferos diferentes.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimetilsulfóxido, ≥ 99,5% (GC), apto para el cultivo de células vegetales
Suero fetal bovino	Gibco	12657029	FBS proporciona el mejor valor al brindar consistencia de crecimiento celular a lo largo del tiempo y los pasajes.
Gentamicina (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Medicamento antibiótico soluble en agua originalmente purificado del hongo  Micromonospora purpurea. La gentamicina actúa previniendo la contaminación de los cultivos celulares
Hemocitómetro			Cámara con patrón de Neubauer utilizada para el recuento de células en la etapa de siembra del ensayo
Microscopio de laboratorio invertido	Leica		DM Il Cabina
		campana de flujo laminar	LED diseñada para proteger el entorno de trabajo de los contaminantes al mantener un flujo constante y unidireccional de aire filtrado por HEPA sobre el trabajo área. Se utiliza en varios pasos de los procedimientos de cultivo y tratamiento de células
Pantalla
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD modelo con procesador incorporado. Cinta con 30 LEDs, 1 metro de longitud y 9 vatios Tableros
		fibra MDF	3mm de espesor Tableros de fibra de densidad media
Tubos de microcentrífuga Estériles			, tubos de polipropileno con tapa de seguridad y capacidad de 1.5/2.0 mL. Herramientas convenientes para manipular pequeños volúmenes en la etapa de tratamiento del ensayo Lector de
microplacas	ThermoFischer		Multiskan FC diseñado para detectar un amplio rango de longitud de onda de absorbancia (340-850 nm). El equipo se utilizó para evaluar la viabilidad celular después de la incubación de MTT.
Reactivo MTT	Invitrogen	M6494	bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. Se utiliza para ensayos de viabilidad de celdas
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			No electrónico, monocanal, 1-10 μ Micropipeta
		P1000	No electrónica, monocanal, 10-1000 μ Micropipeta
		P200	No electrónica, monocanal, 20-200 μ Capacidad L
Equipo PDT	LumaCare		Modelo LC-122
Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4	Gibco	10010031	Formulación de sal equilibrada utilizada para lavar células durante los procedimientos de cultivo y ensayo
Puntas
			L volúmenes máximos
Verteporfina	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfina, ≥ 94% (HPLC)

de cultivo celular controladora de incubadora Software de diseño Trimble SketchUp DMEM High Glucose Gibco 11965092 deLCD de de Fotómetro de microplacas de capacidad L de capacidad L de potenciómetros No estéril, ajuste universal, 10/200/1000 μ