Un dispositivo de terapia fotodinámica construido internamente y basado en diodos emisores de luz para mejorar la citotoxicidad de la verteporina en un modelo de cultivo celular 2D

Resumen

Aquí, describimos un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar con éxito ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD) utilizando cultivo de células HeLa bidimensionales y verteporfina como fotosensibilizador.

Resumen

Este documento describe un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD), llamado PhotoACT. El dispositivo se construyó utilizando un conjunto de diodos emisores de luz (LED) programables convencionales, un módulo de pantalla de cristal líquido (LCD) y un sensor de luz conectado a una placa de microcontrolador comercial. La estructura basada en caja del prototipo se hizo con tableros de fibra de densidad media (MDF). El compartimento interno puede asignar simultáneamente cuatro microplacas multipocillos de cultivo celular.

Como prueba de concepto, estudiamos el efecto citotóxico de la verteporfina fotosensibilizadora (PS) contra la línea celular HeLa en cultivo bidimensional (2D). Las células HeLa fueron tratadas con concentraciones crecientes de verteporfina durante 24 h. Se descartó el medio sobrenadante que contenía fármaco, las células adherentes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se agregó un medio libre de fármaco. En este estudio, el efecto de la verteporfina en las células se examinó sin exposición a la luz o después de la exposición durante 1 h a la luz utilizando valores rojo-verde-azul (RGB) de 255, 255 y 255 (fluencia promedio de 49.1 ± 0.6 J / cm²). Después de 24 h, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT).

Los resultados experimentales mostraron que la exposición de las células tratadas con verteporfina a la luz del dispositivo mejora el efecto citotóxico del fármaco a través de un mecanismo mediado por especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, el uso del prototipo descrito en este trabajo se validó comparando los resultados con un dispositivo PDT comercial. Por lo tanto, este prototipo de terapia fotodinámica basada en LED representa una buena alternativa para los estudios in vitro de TFD.

Introducción

Entre las enfermedades no transmisibles más letales, el cáncer representa una de las principales causas mundiales de muerte prematura. Representó casi 10 millones de muertes en 2020, lo que representa aproximadamente una de cada seis muertes en todo el mundo¹. Además, el fenómeno de la resistencia a múltiples fármacos (MDR) representa una tremenda amenaza para la salud pública, ya que los protocolos quimioterapéuticos aprobados no alcanzan las etapas de remisión para esta condición clínica². Las células cancerosas pueden desarrollar resistencia a la quimioterapia a través de varios mecanismos; sin embargo, la sobreexpresión de algunos transportadores de casetes de unión a ATP (ABC) - bombas de eflujo dependientes de ATP - se considera la principal causa del desarrollo de MDR dentro de un microambiente tumoral³. Además de la MDR, otras complicaciones del cáncer, como la recurrencia y la metástasis, refuerzan la demanda urgente de desarrollar y mejorar los enfoques terapéuticos para superar este desafío oncológico.

La utilización curativa de la luz se ha practicado durante siglos⁴, y la terapia fotodinámica (TFD) representa un enfoque terapéutico clínicamente aprobado para tumores sólidos. La TFD combina la administración de un fotosensibilizador (PS) seguido de irradiación lumínica para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) para ejercer citotoxicidad selectiva en las células tumorales. Este enfoque terapéutico es superior a los métodos convencionales, incluyendo cirugía, radiación y quimioterapia⁵; Es una técnica mínimamente invasiva que muestra menor citotoxicidad en los tejidos conectivos⁶. La aplicación ligera y la acumulación de PS directamente en el tumor o su microambiente aseguran una focalización precisa y, en consecuencia, efectos secundarios sistémicos menores e indeseables⁷ y la posibilidad de repetir el tratamiento en el mismo sitio. Además, el costo es menor que el de otros enfoques. Debido a sus características prometedoras, la TFD puede ser considerada una opción apropiada tanto para el tratamiento del cáncer único, especialmente en el caso de tumores inoperables, como para el tratamiento adyuvante^{del cáncer 7}, y representa una alternativa para la MDR relacionada a la quimioterapia ^8,9.

El primer informe que muestra una alta tasa de respuesta objetiva utilizando PDT se describió en 1975 en un modelo de ratón y rata¹⁰. Desde entonces, se han realizado estudios con TFD con resultados positivos⁷ tanto in vivo como in vitro con líneas celulares tumorales humanas en cultivo celular 2D^11,12. Teniendo en cuenta la amplia aplicabilidad de la PS clínicamente aprobada, independientemente de sus vías de acumulación específicas y rangos de longitud de onda de los picos de absorción, el proceso general es el siguiente: (i) captación de PS, (ii) pico de concentración de PS en el tumor o su microambiente, (iii) aplicación de luz, (iv) interacción PS-luz, (v) transferencia de energía en estado excitado PS a cualquier sustrato tisular o moléculas de oxígeno circundantes, (vi) producción de ROS que involucra oxígeno singlete o anión superóxido, (vii) muerte de células tumorales a través de, esencialmente, necrosis o apoptosis (muerte directa), autofagia (mecanismo citoprotector), isquemia tisular (daño vascular), modulación inmune o una superposición de estos mecanismos⁷. En esta etapa final, la activación de una vía específica de muerte celular depende de muchos factores, como las características celulares, el diseño experimental y, lo más importante, la localización intracelular de PS y el daño dirigido relacionado con PDT¹³.

La verteporfina es un PS de segunda generación, aprobado por las agencias reguladoras para uso clínico en Noruega y China para tratar la degeneración macular relacionada con la edad⁷. Después de la administración de la dosis, se informó que este profármaco se acumuló parcialmente en las mitocondrias¹⁴ e indujo la fosforilación de la proteína tirosina celular y la fragmentación del ADN, lo que llevó a la apoptosis de las células tumorales^15,16. Después de 24 h de incubación para la internalización de verteporfina, se recomienda un protocolo PDT utilizando una configuración de longitud de onda de 690 nm para lograr niveles efectivos de transferencia de radiación electromagnética a moléculas adyacentes ^7,17.

En cuanto a la fuente de luz para PDT, los sistemas láser de diodo clásicos suelen ser caros, técnicamente complicados, de gran tamaño y, por lo tanto, inportátiles^18,19. Como consecuencia de su perfil de longitud de onda única, que también se puede observar en equipos PDT basados en LED, la demanda de unidades independientes para cada aplicación de fotosensibilizador hace que la utilización de sistemas láser de diodo sea aún más compleja y económicamente inviable^20,21. Por lo tanto, la utilización de maquinaria LED se considera la alternativa más prometedora para resolver no solo los costos²² y los problemas de mantenimiento, sino también para proporcionar una alta potencia de salida y menos dañina 23 y una capacidad de iluminación más amplia 24,25,26,27.

A pesar de la contribución potencial que los equipos basados en LED pueden ofrecer a los experimentos PDT²⁸, la mayoría de las opciones comerciales aún poseen inconvenientes como la falta de portabilidad, el alto costo y los complejos proyectos de construcción y operación²⁹. El objetivo principal de este trabajo fue ofrecer una herramienta simple y confiable para ensayos de TFD in vitro . Este documento describe PhotoACT, un dispositivo PDT basado en LED construido internamente, que es económico, fácil de usar y portátil. Como prueba de concepto, se ha demostrado que este dispositivo mejora la citotoxicidad de la verteporfina en un modelo de cultivo celular 2D y, por lo tanto, puede usarse como herramienta de investigación en experimentos PDT.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y software utilizados en este protocolo.

1. Construcción del dispositivo

1. Sierra de 3 mm de espesor de tableros de fibra de densidad media (MDF) para obtener piezas con las dimensiones mostradas en la Figura 1A.
   NOTA: Utilice el archivo vectorial (archivo complementario 1) para el corte de control numérico computarizado (CNC).
2. Construya dos cajas con las siguientes dimensiones (largo x ancho x alto): 330 mm x 235 mm x 225 mm para las cajas más grandes, y 300 mm x 220 mm x 150 m para las cajas más pequeñas (Figura 1B).
3. Perfore la parte posterior de la caja más grande para instalar un conector de gato de barril. Perfore la parte superior de la caja más grande y la parte superior e inferior de la caja más pequeña para proporcionar un pasaje para los cables eléctricos (Figura 1C).
4. Pinte todas las superficies internas con tinta negra para promover una incidencia homogénea de la luz (Figura 1D).
5. Coloque, en paralelo, tres cintas LED con 10 LED cada una en la superficie interior superior de la caja más pequeña (Figura 1E).
6. Instale un sensor de brillo en el centro de la superficie interior inferior de la caja más pequeña (Figura 1F).
7. Imprima la estructura de la unidad de control (Figura 1G) utilizando el archivo de impresión 3D (Archivo complementario 2).
8. Instale todos los componentes (botón de encendido, potenciómetros, panel táctil de tiempo/inicio, LED, sensor de brillo, LCD, zumbador y fuente de alimentación) en los puertos de una placa de control ESP32 montada en el interior de la unidad de control (Figura 2).
9. Cargue el código de programación (Archivo complementario 3, Archivo complementario 4 y Archivo complementario 5) y ejecute una prueba para comprobar que todas las conexiones funcionan (Figura 1H).
10. Ensamble las cajas y fíjelas juntas para evitar huecos y, en consecuencia, interferencias de luz externas y pérdida de luz emitida. Fije la unidad de control montada al área perforada en la parte superior del prototipo (Figura 1I).
11. Fije una puerta frontal del mismo material y dimensiones de 330 mm x 225 mm (largo x ancho) en la caja más grande con dos bisagras pequeñas. Además, coloque las cintas de velcro lateralmente en la caja más grande para reforzar el cierre del prototipo (Figura 1J). Instale una manija para manipular la puerta frontal del equipo.
12. Coloque cuatro almohadillas de goma para los pies en la parte inferior del prototipo para garantizar una mayor estabilidad durante las operaciones (Figura 1K).

2. Líneas celulares: cultivo, siembra y tratamiento

1. Productos químicos
   1. Disuelva la porfirina en dimetilsulfóxido (DMSO) para alcanzar una concentración de 100 mM.
      PRECAUCIÓN: El DMSO debe manipularse con cuidado (manipularse con el uso de equipo de protección personal y en un área ventilada). Manipule cuidadosamente tanto las soluciones madre como las diluidas para evitar una exposición excesiva a la luz.
2. Líneas celulares
   1. Cultivar la línea celular HeLa en el medio bajo en glucosa Modified Eagle's Medium (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de gentamicina.
   2. Conservar los matraces de cultivo en una incubadora de cultivo celular de_CO2 al 5% a 37 °C.
   3. Administrar e inspeccionar las células hasta que alcancen el 80% -90% de confluencia.
3. Proceso de siembra
   1. Retirar el medio de cultivo del matraz.
   2. Lave la monocapa celular con PBS.
   3. Separar el cultivo celular confluente con tripsina-EDTA (0,5%) 1x durante 5 min a 37 °C. Detener la acción de la tripsina resuspendiendo las células con medio de cultivo suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de gentamicina.
   4. Contar las células resuspendidas con un hemocitómetro y sembrarlas en una placa de 96 pocillos a 2,0 × 10⁴ células/pocillo.
   5. Prepare dos platos para condiciones de oscuridad y luz.
   6. Incubar las placas durante 24 h para la fijación celular.
4. Proceso de tratamiento
   1. Retire el medio de ambas placas de 96 pocillos.
   2. Tratar las células con 100 μL de concentraciones crecientes de verteporfina (0,045 a 24 μM, dilución seriada).
   3. Incubar las células con tratamiento farmacológico durante 24 h para permitir la internalización de verteporfina.
   4. Después de 24 h, deseche el medio que contiene el medicamento, lave la monocapa de células con PBS (100 μL) y agregue un medio libre de medicamento (100 μL).
   5. Cubra una microplaca con papel de aluminio para protegerla de la exposición a la luz e incube durante 24 h. Esta placa proporcionará datos de control para los resultados de PDT (condición oscura). La otra microplaca se utilizará en la condición de exposición a la luz en el dispositivo.

3. Funcionamiento del dispositivo

1. Enchufe el dispositivo PDT a la toma de corriente y enciéndalo pulsando el botón de encendido .
2. Coloque la otra microplaca (condición de luz) en el dispositivo PDT y cierre el equipo sujetando la puerta delantera con las cintas de velcro.
3. Use los potenciómetros para ajustar la configuración RGB (un experimento RGB 255, 255, 255 aquí) y establezca el color de la emisión de luz.
   NOTA: Cada combinación RGB tiene un espectro de emisión específico, que debe ajustarse para experimentos con diferentes fotosensibilizadores y, en consecuencia, diferentes curvas de absorbancia.
4. Pulse el panel táctil (+)/(- ) para ajustar la configuración de tiempo (un experimento de 60 minutos aquí) y establecer la duración del ensayo.
   NOTA: La configuración del tiempo, en asociación con el valor de irradiancia, determinará la fluencia del proceso: la dosis de luz aplicada en el ensayo.
5. Compruebe la información de configuración en la pantalla.
6. Presione el botón Inicio para iniciar el ensayo. Asegúrese de que se escuche un pitido al comienzo del ensayo.
7. En el transcurso del experimento, observe información en tiempo real en la pantalla, como la irradiancia y el tiempo restante.
8. No abra la puerta principal ni cambie ninguna configuración durante el ensayo PDT.
9. Al final del ensayo, espere a que aparezca un zumbador de cuatro pitidos y a que el sistema electrónico apague todos los LED. Observe un mensaje terminado y la cantidad final de energía gastada -fluencia- durante el experimento en la pantalla.
   NOTA: El valor final de fluencia se calcula utilizando la ecuación (1):
   (1)
   Donde F es igual a J/cm 2 e I es igual a mW/cm 2 o mJ/s·cm ². El valor de irradiancia considera la potencia de los LED (fuente emisora) y el área uniformemente irradiada de la cámara oscura (660 cm 2) (ecuación [²]):
   (2)
   El valor teórico de irradiancia se muestra en la pantalla del dispositivo a lo largo de todo el ensayo PDT. Al final de la operación, use la ecuación (3) para calcular la fluencia:
   Fluencia (F) = irradiancia (I, valor constante) × tiempo (s) de operación (s ) (3)

4. Ensayo de viabilidad celular

1. Después del ensayo PDT, cubra la microplaca que se expuso a la luz e incube durante 24 h.
2. Después del período de incubación, retire el medio de cultivo de ambas placas, lave la monocapa de células con PBS (100 μL) y agregue solución MTT (0,5 mg / ml, 100 μL). Incubar ambas placas, en condiciones oscuras y claras, durante 4 h para permitir la formación de cristales de formazan.
3. Retire la solución MTT con cuidado y disuelva los cristales púrpuras con una solución de DMSO/etanol (1:1).
4. Después de la disolución completa de los cristales, realice la medición de absorbancia utilizando un lector de microplacas a 595 nm.
   NOTA: El dispositivo puede ser utilizado en otros experimentos importantes como la muerte celular mediada por ROS desencadenada por fotosensibilizadores después de la exposición a la luz por citometría de flujo³⁰.

Resultados

El dispositivo PDT final, llamado PhotoACT, incluía una cámara oscura para asignar hasta cuatro microplacas multipocil, con su superficie interior superior equipada con un conjunto de 30 LED dispersos programados para emitir distintos espectros de luz visible (Figura 3 y Archivo Suplementario 6). El dispositivo se construyó utilizando dos cajas asociadas: una caja interna diseñada como una cámara oscura para los ensayos PDT, y una caja externa para cubrir la cámara interna y...

Discusión

El dispositivo PhotoACT final fue conveniente de construir con componentes de bajo costo disponibles comercialmente a un costo total de menos de $ 50. Las ventajas adicionales incluyen bajas demandas de mantenimiento, la capacidad de irradiar múltiples tipos de placas de cultivo, el uso simultáneo de hasta cuatro unidades por ensayo, bajo peso (2 kg) / tamaño (44 cm³) que permite la portabilidad, irradiación precisa y reproducible (datos no mostrados) y una interfaz de configuración fácil de usar y simple que ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5% Tripsina-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Reactivo de disociación de cultivo de células de mamíferos
Impresora 3D	Flashforge		Finder modelo
Placas de 96 pocillos Placas			de superficie no estériles, de poliestireno y de alta adherencia con pocillos de fondo plano utilizadas para el cultivo celular 2D
Arduino
Sensor		de brillo	Modelo TSL2561 con niveles de detección de 0,1-40.000+ lux e interfaz I2C
Botones
Zumbador
Matraces			Matraz de fondo rectangular estéril de poliestireno con superficie tratada con cultivo de tejidos (TC), cuello inclinado y tapón de ventilación (tamaños)
Tubos de			centrífugaTubos estériles de polipropileno con una capacidad de 15/50 mL utilizados para la dilución de cultivos celulares en la etapa de siembra del ensayo
CO2 Placa
	ESP32
			DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) es un medio basal ampliamente utilizado para apoyar el crecimiento de muchas células de mamíferos diferentes.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimetilsulfóxido, ≥ 99,5% (GC), apto para el cultivo de células vegetales
Suero fetal bovino	Gibco	12657029	FBS proporciona el mejor valor al brindar consistencia de crecimiento celular a lo largo del tiempo y los pasajes.
Gentamicina (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Medicamento antibiótico soluble en agua originalmente purificado del hongo  Micromonospora purpurea. La gentamicina actúa previniendo la contaminación de los cultivos celulares
Hemocitómetro			Cámara con patrón de Neubauer utilizada para el recuento de células en la etapa de siembra del ensayo
Microscopio de laboratorio invertido	Leica		DM Il Cabina
		campana de flujo laminar	LED diseñada para proteger el entorno de trabajo de los contaminantes al mantener un flujo constante y unidireccional de aire filtrado por HEPA sobre el trabajo área. Se utiliza en varios pasos de los procedimientos de cultivo y tratamiento de células
Pantalla
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD modelo con procesador incorporado. Cinta con 30 LEDs, 1 metro de longitud y 9 vatios Tableros
		fibra MDF	3mm de espesor Tableros de fibra de densidad media
Tubos de microcentrífuga Estériles			, tubos de polipropileno con tapa de seguridad y capacidad de 1.5/2.0 mL. Herramientas convenientes para manipular pequeños volúmenes en la etapa de tratamiento del ensayo Lector de
microplacas	ThermoFischer		Multiskan FC diseñado para detectar un amplio rango de longitud de onda de absorbancia (340-850 nm). El equipo se utilizó para evaluar la viabilidad celular después de la incubación de MTT.
Reactivo MTT	Invitrogen	M6494	bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. Se utiliza para ensayos de viabilidad de celdas
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			No electrónico, monocanal, 1-10 μ Micropipeta
		P1000	No electrónica, monocanal, 10-1000 μ Micropipeta
		P200	No electrónica, monocanal, 20-200 μ Capacidad L
Equipo PDT	LumaCare		Modelo LC-122
Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4	Gibco	10010031	Formulación de sal equilibrada utilizada para lavar células durante los procedimientos de cultivo y ensayo
Puntas
			L volúmenes máximos
Verteporfina	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfina, ≥ 94% (HPLC)