Artículo de método

Extracción, etiquetado y purificación de células específicas del linaje de folículos antrales humanos

DOI:

10.3791/64402

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30 de noviembre de 2022

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1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos protocolos para la identificación y purificación de células ováricas de folículos antrales. Elaboramos métodos para procesar ovarios enteros para la criopreservación de tiras corticales mientras también cosechamos folículos antrales intactos que se tratan enzimáticamente para liberar múltiples tipos de células residentes del folículo, incluidas las células granulosa, teca, endotelial, hematopoyética y estromales.

Resumen

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La activación, el crecimiento, el desarrollo y la maduración de los ovocitos es un proceso complejo que se coordina no solo entre múltiples tipos de células del ovario, sino también a través de múltiples puntos de control dentro del circuito hipotalámico / pituitario / ovárico. Dentro del ovario, múltiples tipos de células especializadas crecen en estrecha asociación con el ovocito dentro de los folículos ováricos. La biología de estas células ha sido bien descrita en etapas posteriores, cuando se recuperan fácilmente como subproductos de los tratamientos de reproducción asistida. Sin embargo, el análisis en profundidad de pequeños folículos antrales aislados directamente del ovario no se lleva a cabo comúnmente debido a la escasez de tejido ovárico humano y el acceso limitado al ovario en pacientes sometidas a tratamientos de reproducción asistida.

Estos métodos para procesar ovarios enteros para la criopreservación de tiras corticales con la identificación / aislamiento concurrente de células residentes del ovario permiten el análisis de alta resolución de las primeras etapas del desarrollo del folículo antral. Demostramos protocolos para aislar tipos de células discretas mediante el tratamiento enzimático de los folículos antrales y la separación de las células granulosa, teca, endotelial, hematopoyética y estromal. El aislamiento de células de los folículos antrales en varios tamaños y etapas de desarrollo permite el análisis exhaustivo de los mecanismos celulares y moleculares que impulsan el crecimiento del folículo y la fisiología ovárica y proporciona una fuente de células viables que pueden cultivarse in vitro para recapitular el microambiente del folículo.

Introducción

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Los elementos funcionales primarios del ovario humano son los folículos, que gobiernan el crecimiento y desarrollo de los ovocitos. Los protocolos para el aislamiento de células foliculares han sido bien establecidos en el contexto de la fertilización in vitro , pero estos son apropiados solo para la recolección de células de folículos luteinizados en el punto de recuperación de ovocitos1. Hemos desarrollado un protocolo que permite el aislamiento de poblaciones de células discretas de folículos antrales en diferentes etapas de desarrollo que surgen de ovarios nativos o tejido ovárico xenotrasplantado2. Aunque e....

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Protocolo

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Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Weill Cornell Medicine. Todos los experimentos de xenotrasplante con tejido ovárico se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Ambos ovarios se aislaron de un donante de órganos con muerte cerebral de 14 años sin antecedentes de radio/quimioterapia y sin antecedentes documentados de afecciones endocrinas o reproductivas. El Comité de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de Weill Cornell Medicine aprobó la recolección de tejido, y la aprobación de la familia del donante de órganos se obtuvo después del consentimient....

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Resultados

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Aislamos folículos de la superficie del ovario y los tratamos enzimáticamente para aislar los GC, así como las células de teca y estroma que rodean la cavidad antral. Las células fueron recolectadas, y las fracciones celulares fueron clasificadas de los folículos antrales (diámetros que oscilan entre 0,5 mm y 4 mm) por FACS a >95% de pureza (Figura 1).

Para etiquetar y purificar fracciones celulares únicas dentro de los folículos antrales humanos, combinamos la.......

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Discusión

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Una mejor resolución de la diversidad celular dentro de los folículos ováricos es clínicamente importante por varias razones. Al aplicar el protocolo anterior al aislamiento de los subtipos fenotípicos únicos que residen dentro de los folículos en etapa antral, se deben considerar varios factores. En primer lugar, la salud y la viabilidad del tejido ovárico del que se deriva el folículo antral es fundamental para determinar la calidad de las células y el éxito de las aplicaciones posteriores. Esto se puede optimizar mini.......

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Divulgaciones

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Todos los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Los autores reconocen el apoyo del Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) y el Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G cuenta con el apoyo de la beca de capacitación postdoctoral NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Químicos, reactivos
Antibiótico-Antimicótico 100xThermo Fisher Scientific15240062Anti-Anti
Anti Decoloración Solución de montajeThermo Fisher Scientific  P36930ProLong
Gold Colagenasa de  Clostridium histolyticumMillipore SigmaC 2674
DAPIThermo Fisher ScientificD1306
Dispasa II, polvoThermo Fisher Scientific17105041
DMSOMillipore SigmaD 2650Dimethyl sulfóxido
DPBS, sin calcio, sin magnesioThermo Fisher Scientific14190144
Medio de desprendimiento de células enzimáticas Thermo Fisher Scientific00-4555-56
Suero fetal bovino Accutase, Thermo Fisher Scientific inactivado por calor10438026
Hanks′ Solución salina equilibradaThermo Fisher Scientific14175079sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol
Leibovitz' s L-15 medio Thermo Fisher Scientific11415064
Calidad salina normalbiológica114-055-101
SacarosaMillipore SigmaS 1888
medio de congelación (100 mL, filtrado a través de un filtro de 0,2 micras)
- 69,64 mL de L-15
- 17,66 mL de feto bovino suero
- 3,42 g de sacarosa
- 10,65 mL de DMSO-
1 mL de antibiótico-antimicótico<
fuerte>Plástico y suministros de laboratorio
6 pocillos Fondo plano claro no tratado Corning351146Falcon
Cell Strainer 100 µ mFisher scientific352360Corning, Falcon
CryovialsThermo Fisher Scientific377267CryoTube 1,8 mL
Placa de Petri, D x H 150 mm x 25 mm Millipore SigmaCLS43059960EA
Tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón a presión de filtro de celdas, 5mL Fisher scientific352235Corning,
sistema de filtro de vacío/botella de almacenamiento Falcon, 0.22 y micro; mCorning431154<
fuerte>Anticuerpos
ANPEPBioLegend301703
CD34 R& D SystemsFAB7227A
CD45BioLegend304019
CD55BioLegend311306
CD 99BioLegend371308
PVRL BioLegend340404
Herramientas quirúrgicas
~150 mm de longitud)Fisherbrand12-000-128Pinza mediana Fisher Scientific
(~110 mm de longitud)Fisherbrand12-000-157bisturí
Fisher Scientific número 21Andwin Scientific EF7281Hbisturí Fisher Scientific
número 11Andwin Scientific  FH/CX7281AFisher Scientific
tijeras afiladas y curvas finasRoboz SurgicalRS-5881
Instruments
activado por fluorescenciaBD
LSM 710 META Microscopio confocalZeiss
de Leibovitz longitud (FACSJazz Clasificador celular

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250(2015).
  2. Man, L., et al.

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Etiquetas

Antral Follicle CellsOvarian Follicle IsolationCell Lineage LabelingGranulosa CellsTheca CellsStromal CellsEnzymatic DigestionFACS SortingOvarian Cortex CryopreservationCell Surface Markers

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