Artículo de método

Caracterización de una cepa patógena de Escherichia coli derivada de granjas de Oreochromis spp.

DOI:

10.3791/64404

⸱

23 de diciembre de 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

En este artículo

Aviso de erratum

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La viabilidad de las estrategias de secuenciación del genoma completo (WGS) utilizando instrumentos de sobremesa ha simplificado la interrogación del genoma de cada microbio de relevancia para la salud pública en un entorno de laboratorio. Se describe una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano y también se presenta una tubería bioinformática para el análisis.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La acuicultura es uno de los sectores productores de alimentos de más rápido crecimiento en todo el mundo y el cultivo de tilapia (Oreochromis spp.) constituye la principal variedad de peces de agua dulce cultivada. Debido a que las prácticas acuícolas son susceptibles a la contaminación microbiana derivada de fuentes antropogénicas, se necesita un uso extensivo de antibióticos, lo que lleva a que los sistemas acuícolas se conviertan en una fuente importante de bacterias patógenas y resistentes a los antibióticos de relevancia clínica como Escherichia coli (E. coli). Aquí, la resistencia antimicrobiana, la virulencia y las características del mobiloma de una cepa patógena de E. coli , recuperada de Oreochromis spp. cultivada en el interior, se dilucidaron mediante secuenciación del genoma completo (WGS) y análisis in silico . Se realizaron pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST) y WGS. Además, el grupo filogenético, el serotipo, la tipificación de secuencias multilocus (MLST), la resistencia antimicrobiana adquirida, la virulencia, el plásmido y el contenido de profagos se determinaron utilizando diversas herramientas web disponibles. El aislado de E. coli solo exhibió susceptibilidad intermedia a la ampicilina y se caracterizó como cepa ONT: H21-B1-ST40 por tipificación basada en WGS. Aunque solo se detectó un único gen relacionado con la resistencia a los antimicrobianos [mdf(A)], se identificaron varios genes asociados a la virulencia (VAG) del patotipo enteropatógeno atípico de E. coli (aEPEC). Además, se detectó la carga de replicones plásmidos de grandes grupos plásmidos y 18 regiones asociadas a profagos. En conclusión, la caracterización WGS de un aislado aEPEC, recuperado de una piscifactoría en Sinaloa, México, permite conocer su potencial patogénico y el posible riesgo para la salud humana de consumir productos acuícolas crudos. Es necesario explotar las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) para estudiar los microorganismos ambientales y adoptar un marco de salud única para aprender cómo se originan los problemas de salud.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La acuicultura es uno de los sectores productores de alimentos de más rápido crecimiento en todo el mundo, y sus prácticas de producción están destinadas a satisfacer la creciente demanda de alimentos para el consumo humano. La producción acuícola mundial se ha triplicado de 34 millones de toneladas (Mt) en 1997 a 112 Mt en 20171. Los principales grupos de especies, que contribuyeron a casi el 75% de la producción, fueron algas, carpas, bivalvos, bagres y tilapia (Oreochromis spp.) 1. Sin embargo, la aparición de enfermedades causadas por entidades microbianas es inevitable debido a la piscicultura intensiva, lo que lleva a posibles pérdidas económicas2.

El uso de antibióticos en las prácticas de piscicultura es bien conocido por prevenir y tratar infecciones bacterianas, el principal factor limitante en la productividad 3,4. Sin embargo, los antibióticos residuales se acumulan en los sedimentos y el agua de la acuicultura, ejerciendo una presión selectiva y modificando las comunidades bacterianas asociadas a los peces y residentes 5,6,7,8. En consecuencia, el ambiente acuícola sirve como reservorio para los genes de resistencia a los antimicrobianos (ARG), y la posterior aparición y propagación de bacterias resistentes a los antibióticos (ARB) en el medio circundante9. Además de los patógenos bacterianos comúnmente observados que afectan las prácticas de piscicultura, a menudo se encuentran miembros de la familia Enterobacteriaceae, incluidas cepas de patógenos humanos de Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. y Salmonella spp.10. E. coli es el microorganismo más común aislado de la harina y el agua de pescado en la piscicultura 11,12,13,14,15.

E. coli es una bacteria gramnegativa versátil que habita en el tracto gastrointestinal de mamíferos y aves como miembro comensal de su microbiota intestinal. Sin embargo, E. coli posee una alta capacidad adaptativa para colonizar y persistir en diferentes nichos ambientales, incluyendo suelo, sedimentos, alimentos y agua16. Debido a la ganancia y pérdida de genes a través del fenómeno de transferencia horizontal de genes (HGT), E. coli ha evolucionado rápidamente hasta convertirse en un patógeno resistente a los antibióticos bien adaptado, capaz de causar un amplio espectro de enfermedades en humanos y animales17,18. Según el origen del aislamiento, las variantes patogénicas se definen como E. coli patógena intestinal (InPEC) o E. coli patógena extraintestinal (ExPEC). Además, InPEC y ExPEC se subclasifican en patotipos bien definidos de acuerdo con la manifestación de la enfermedad, los antecedentes genéticos, los rasgos fenotípicos y los factores de virulencia (FV)16,17,19.

El cultivo tradicional y las técnicas moleculares para cepas patógenas de E. coli han permitido la rápida detección e identificación de diferentes patotipos. Sin embargo, pueden llevar mucho tiempo, ser laboriosas y con frecuencia requieren una alta capacitación técnica19. Además, no se puede utilizar un método único para estudiar de manera confiable todas las variantes patogénicas de E. coli debido a la complejidad de sus antecedentes genéticos. Actualmente, estos inconvenientes se han superado con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS). Los enfoques de secuenciación del genoma completo (WGS) y las herramientas bioinformáticas han mejorado la exploración del ADN microbiano de manera asequible y a gran escala, facilitando la caracterización en profundidad de los microbios en una sola ejecución, incluidas las variantes patogénicas estrechamente relacionadas20,21,22. Dependiendo de las preguntas biológicas, se pueden utilizar varias herramientas bioinformáticas, algoritmos y bases de datos para realizar análisis de datos. Por ejemplo, si el objetivo principal es evaluar la presencia de ARG, VF y plásmidos, herramientas como ResFinder, VirulenceFinder y PlasmidFinder, junto con sus bases de datos asociadas, podrían ser un buen punto de partida. Carriço et al.22 proporcionaron una visión detallada de los diferentes programas informáticos y bases de datos relacionadas aplicadas para el análisis microbiano de WGS, desde el preprocesamiento de datos brutos hasta la inferencia filogenética.

Varios estudios han demostrado la amplia utilidad de WGS para la interrogación del genoma con respecto a los atributos de resistencia a los antimicrobianos, el potencial patogénico y el seguimiento de la aparición y las relaciones evolutivas de variantes clínicamente relevantes de E. coli procedentes de diversos orígenes23,24,25,26 . WGS ha permitido la identificación de los mecanismos moleculares subyacentes a la resistencia fenotípica a los antimicrobianos, incluidos los mecanismos de resistencia raros o complejos. Esto es a través de la detección de variantes ARG adquiridas, mutaciones novedosas en genes diana de fármacos o regiones promotoras27,28. Además, WGS ofrece el potencial de inferir perfiles de resistencia antimicrobiana sin requerir conocimientos previos sobre el fenotipo de resistencia de una cepa bacteriana29. Alternativamente, WGS ha permitido la caracterización de los elementos genéticos móviles (MGE) portadores de características de resistencia antimicrobiana y virulencia, lo que ha impulsado la evolución del genoma bacteriano de los patógenos existentes. Por ejemplo, la aplicación de WGS durante la investigación del brote alemán de E. coli en 2011 resultó en el descubrimiento de las características genómicas únicas de un patotipo de E. coli aparentemente nuevo; Curiosamente, esas cepas del brote se originaron en el grupo enteroagregativo de E. coli (EAEC), que adquirió el profago que codifica la toxina Shiga del patotipo30 enterohemorrágico de E. coli (EHEC).

Este trabajo presenta una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano utilizando un secuenciador de sobremesa. Además, se proporciona una tubería de bioinformática utilizando herramientas basadas en la web para analizar las secuencias resultantes y apoyar aún más a los investigadores con experiencia limitada o nula en bioinformática. Los métodos descritos permitieron dilucidar la resistencia antimicrobiana, la virulencia y las características del mobiloma de una cepa patógena de E. coli ACM5, aislada en 2011 de Oreochromis spp. cultivada en el interior en Sinaloa, México12.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: La cepa ACM5 de E. coli se recuperó mediante el procesamiento y cultivo de la muestra de pescado para la determinación de coliformes fecales (FC)12. Durante el muestreo de peces, los peces no mostraron signos clínicos de enfermedad, infección bacteriana o fúngica, y prevaleció una temperatura media de 22,3 °C. Después del aislamiento, el aislado de E. coli se sometió a pruebas bioquímicas y se criopreservó en caldo de infusión cerebral cardíaca (BHI) con DMSO (8% v / v) como agente crioprotector.

1. Reactivación del cultivo de E . coli ACM5 congelado

  1. De la cepa bacteriana congelada, abra el tubo y use un asa estéril, una punta de pipeta o un palillo de dientes para raspar la superficie del cultivo bacteriano congelado.
  2. Rayar las bacterias en una placa de agar Luria-Bertani (LB) e incubar a 37 ± 2 °C durante 24 h.

2. Determinación de la susceptibilidad antibacteriana

NOTA: La prueba de sensibilidad antimicrobiana descrita aquí corresponde al método de difusión en disco basado en las directrices del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. E. coli La cepa ATCC 25922 es necesaria para fines de control de calidad.

  1. Preparación de inóculo por el método de suspensión de colonias
    1. A partir de la placa LB incubada en el paso 1.2, rayar una o dos colonias en una placa de agar Mueller-Hinton (MH) e incubar a 37 ± 2 °C durante 18-24 h.
    2. Use un bucle estéril para recoger dos o tres colonias del aislado de E. coli recién subcultivado en una placa de agar MH y resuspenderlas en 3 ml de caldo MH estéril o solución salina al 0,85% (p/v), mezclando bien mediante vórtice para obtener una suspensión bacteriana uniforme.
    3. Usando un espectrofotómetro UV-visible (ver Tabla de materiales), ajuste la suspensión bacteriana a una turbidez comparable a un estándar de 0.5 MacFarland (equivalente a aproximadamente 1-2 x 108 células/ml). Si la suspensión bacteriana es demasiado ligera o demasiado pesada, agregue más colonias de E. coli o caldo MH según corresponda. Use el inóculo preparado dentro de los 15 minutos posteriores a la preparación.
  2. Inoculación de las placas de agar problema
    1. Sumerja un hisopo de algodón estéril en la suspensión bacteriana ajustada. Gire el hisopo varias veces y presiónelo firmemente en la pared interior del tubo para eliminar el exceso de líquido del hisopo.
    2. Inocular una placa de agar MH rayando el hisopo 3x sobre toda la superficie del agar, girando la placa 60° cada vez. Frote también el borde del agar para asegurar una distribución uniforme del inóculo.
    3. Deje la tapa de la placa de Petri entreabierta durante 3-5 minutos para permitir que la humedad se evapore.
  3. Aplicación del disco antimicrobiano en placas de agar inoculadas
    1. Distribuir uniformemente y presionar cada disco antimicrobiano (ver Tabla de materiales) hacia abajo sobre la superficie de las placas de agar inoculadas para asegurar un contacto completo. Invertir las placas dentro de los 15 minutos después de la aplicación del disco e incubar a 35 ± 2 °C durante 16-18 h.
      NOTA: Se debe utilizar un máximo de 12 y seis discos en placas de Petri de 150 mm y 100 mm, respectivamente.
  4. Después de la incubación, medir la zona de tamaños de inhibición utilizando un calibrador Vernier e interpretar los diámetros resultantes de acuerdo con los criterios de punto de ruptura CLSI (M100 - Tabla 2A)32.

3. Extracción y cuantificación del ADN genómico (ADNg)

  1. Extracción de ADN genómico
    1. Resuspender un bucle de colonias de E. coli recién cultivadas en 5 ml de caldo LB e incubar durante la noche en una incubadora agitadora (180 rpm) a 37 ± 2 °C.
    2. Centrifugar la suspensión bacteriana a 3.500 x g durante 5 min y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
    3. Extraiga gDNA siguiendo las pautas del kit de extracción de ADN (consulte la Tabla de materiales).
    4. Compruebe la pureza del ADNg midiendo la densidad óptica a 260/280 nm (relación: >1,8) y 260/230 nm (relación: 2,0-2,2) utilizando un espectrofotómetro UV-visible. Realice electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para verificar la integridad del ADNg.
  2. Cuantificación genómica del ADN
    NOTA: Utilice únicamente tubos de PCR transparentes de 0,5 ml de pared delgada aprobados por el fabricante del kit de ensayo de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).
    1. Configure el número requerido de tubos para muestras y estándares de ensayo. Prepare la solución de ensayo de trabajo mezclando el componente A y el componente B proporcionados en el kit, siguiendo las pautas del fabricante.
    2. Prepare los patrones de ensayo agregando 190 μL de la solución de trabajo y 10 μL de cada patrón al tubo apropiado (se requieren dos estándares).
    3. Añadir 198 μL de la solución de trabajo y 2 μL de la muestra de ADN al tubo apropiado. Mezclar vigorosamente haciendo vórtices de todos los tubos durante 5 s. Tenga cuidado de no crear burbujas.
    4. Incubar todos los tubos durante 2 min a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Mida la fluorescencia de todos los tubos según las pautas del fabricante utilizando el fluorómetro (consulte la Tabla de materiales).
    5. Ajuste adecuadamente la concentración de la muestra de ADNg para el procedimiento de secuenciación.

4. Preparación de la biblioteca de ADN

NOTA: La preparación y secuenciación de la biblioteca de ADN se realizó siguiendo las pautas y protocolos del fabricante (consulte la Tabla de materiales). La concentración inicial de ADNg es de 4,0 ng.

  1. Etiquetado, amplificación por PCR e indexación
    1. En un tubo de 0,2 ml, añadir 2,5 μL de tampón de etiquetado y 2 μL de gDNA de entrada (2,0 ng/μL). Mezclar suavemente por pipeteo.
    2. Añadir 1 μL de tampón de amplificación y mezclar suavemente con pipeteo. Girar a 280 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
    3. Coloque las muestras en un termociclador (consulte la Tabla de materiales) y ejecute el siguiente programa de PCR: 55 °C durante 5 min, luego mantenga a 10 °C. Cuando las muestras alcancen los 10 °C, proceder inmediatamente a neutralizar la reacción.
    4. Añadir 1 μL de tampón neutralizante a los tubos de muestra y mezclar suavemente mediante pipeteo. Girar a 280 x g durante 1 min e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    5. Agregue 1,7 μL de cada adaptador de índice (es decir, los índices i7 e i5) y 3 μL de mezcla maestra de PCR de indexación. Mezclar suavemente por pipeteo. Girar a 280 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
    6. Colocar las muestras en el termociclador y realizar una segunda reacción de PCR de la siguiente manera: 72 °C durante 3 min, 95 °C durante 30 s, 18 ciclos de 95 °C durante 10 s, 55 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s, 72 °C durante 5 min, y mantener a 10 °C.
  2. Limpieza amplificada de la biblioteca
    1. Mezcle mediante vórtice la solución comercial de perlas magnéticas (consulte la Tabla de materiales) según las pautas del fabricante.
    2. Transfiera la muestra de ADNg marcada/indexada a un nuevo tubo de 1,5 ml y agregue 0,6 μL de perlas magnéticas por cada μL del volumen final de la muestra de ADNg (≈13 μL). Mezclar suavemente pipeteando e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Coloque los tubos de muestra en una rejilla magnética (consulte la Tabla de materiales) durante 2 minutos hasta que el sobrenadante se haya aclarado. Retire y deseche el sobrenadante con cuidado sin alterar las cuentas.
    4. Agregue 200 μL de etanol al 80% recién preparado sin mezclar. Incubar durante 30 s hasta que el eluya aclare y retirar y desechar con cuidado el sobrenadante sin perturbar las cuentas.
    5. Realice un segundo paso de lavado. Añadir 200 μL de etanol al 80% a las perlas e incubar durante 30 s. Después de que el eluya se aclare, retire y deseche el sobrenadante y seque al aire las perlas durante 10 minutos.
    6. Añadir 15 μL de tampón tris de 10 mM (pH 8) a las perlas y mezclar suavemente con pipeteo. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Coloque los tubos de muestra de nuevo en la rejilla magnética durante 2 minutos, dejando que el sobrenadante se aclare.
    7. Transfiera cuidadosamente 14 μL del sobrenadante del tubo de muestra a un nuevo tubo de 0,2 ml. Esta es la biblioteca limpia.
      NOTA: En este punto, la biblioteca limpia se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de 7 días.
  3. Normalización de bibliotecas
    1. Proceda a cuantificar las bibliotecas limpiadas mediante ensayo de fluorescencia como se describe en el paso 3.2, excepto el paso 3.2.5.
    2. Visualice las bibliotecas limpias en una electroforesis en gel de agarosa al 1% para determinar el tamaño promedio de los fragmentos.
    3. Calcula el valor de molaridad de la biblioteca usando la siguiente ecuación:
      figure-protocol-1
    4. Usando el valor de molaridad, calcule los volúmenes adecuados de tampón de resuspensión (RSB) y bibliotecas limpias para diluir la biblioteca individual a una concentración inicial de 10 nM.

5. Agrupación de bibliotecas, desnaturalización e inicio del secuenciador

  1. Descongele el cartucho de reactivo siguiendo las instrucciones del fabricante. Extraiga la celda de flujo del refrigerador (4 °C) y llévela a temperatura ambiente antes de la secuenciación.
  2. Agrupar 5 μL de cada biblioteca normalizada (10 nM) en un tubo de 1,5 ml de unión baja. Diluir la biblioteca agrupada a 4 nM con el volumen adecuado de RSB.
  3. Agregue 5 μL de la biblioteca agrupada (4 nM) y 5 μL de NaOH 0.2 N en un nuevo tubo de 1.5 ml de bajo enlace. Mezclar brevemente por vórtice, girar hacia abajo a 280 x g durante 1 minuto e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar la biblioteca agrupada en hebras individuales.
  4. Mezclar suavemente 10 μL de biblioteca agrupada desnaturalizada y 990 μL de tampón de hibridación preenfriado mediante pipeteo y colocar en hielo hasta que se realice la dilución final para la carga del secuenciador. La concentración de la biblioteca desnaturalizada es de 20 pM.
  5. Descongele y prepare una biblioteca de control (ver Tabla de materiales) a una concentración de 4 nM mezclando 2 μL de biblioteca de control (10 nM) y 3 μL de agua libre de nucleasas.
  6. Mezclar 5 μL de la biblioteca de control (4 nM) y 5 μL de NaOH 0,2 N recién preparado. Mezclar brevemente por vórtice, girar hacia abajo a 280 x g durante 1 minuto e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar la biblioteca de control en hebras individuales.
  7. Mezclar suavemente 10 μL de biblioteca de control desnaturalizada y 990 μL de tampón de hibridación preenfriado mediante pipeteo y colocar en hielo hasta que se realice la dilución final para la carga del secuenciador. La concentración de la biblioteca de control desnaturalizada es de 20 pM.
  8. En un nuevo tubo de 1,5 ml de bajo enlace, combine 594 μL de la biblioteca agrupada desnaturalizada a 20 pM y 6 μL de la biblioteca de control desnaturalizada a 20 pM. Mezclar adecuadamente.
  9. Diluir la mezcla final de biblioteca (20 pM) hasta una concentración de carga final de 1,2 pM en un volumen de 600 μL utilizando el tampón de hibridación preenfriado.
  10. Antes de cargar la mezcla de biblioteca final en el cartucho de reactivo, realice un pretratamiento térmico adicional para lograr una carga eficiente en la celda de flujo. Incubar la mezcla final de la biblioteca durante 2 min a 96 °C. Invierta el tubo para mezclar y coloque el tubo en hielo durante 5 minutos.
  11. Cargue 500 μL de la mezcla final de biblioteca en el depósito diseñado en el cartucho de reactivo. Inicie la secuenciación siguiendo las pautas. Cargue la celda de flujo y el cartucho de reactivo y configure la ejecución de secuenciación.

6. Análisis de datos de secuencia

NOTA: Consulte el Archivo Suplementario 1 para obtener una descripción más detallada del preprocesamiento general de datos WGS, el software, la configuración de parámetros y el análisis de secuencia del genoma de E. coli.

  1. Conéctese al servidor de datos de secuenciación y descargue los archivos FASTQ.
  2. Evalúe la calidad inicial de los datos de secuencia sin procesar con software de terceros. Elimine las secuencias de adaptadores remanentes, las bases de baja calidad (el archivo complementario 1).
  3. Reúna los datos de secuenciación de calidad comprobada en nivel de contig o andamiaje utilizando software de terceros (consulte el Archivo complementario 1).
  4. Realice la anotación del genoma enviando el archivo FASTA que contiene el genoma ensamblado al servidor RAST (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Cargue el archivo FASTA en las plataformas web del Centro de Epidemiología del Genoma (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) y ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) para identificar características epidemiológicas, ARG, VAG y plásmidos (consulte el Archivo complementario 1).
  6. Cargue el archivo FASTA en el servidor PHASTER para identificar secuencias de profagos (https://phaster.ca/).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La susceptibilidad antimicrobiana se determinó mediante el método de difusión en disco y se interpretó mediante criterios de punto de corte CLSI para 12 antibióticos que abarcan seis clases antimicrobianas distintas, es decir, aminoglucósidos, β-lactámicos, fluoroquinolonas, nitrofuranos, fenicoles y antagonistas de la vía del folato. La E. coli ACM5 mostró sensibilidad a todos los antibióticos excepto a un fármaco β-lactámico. Se probaron cuatro fármacos β-lactámicos: ampicilina, carbenicilina, cefalotina y cef...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta una adaptación del flujo de trabajo bacteriano de WGS utilizando un secuenciador de sobremesa y una tubería para la caracterización genómica de una variante patógena de E. coli. Dependiendo de la plataforma de secuenciación utilizada, los tiempos de respuesta (ATT) para procedimientos de laboratorio húmedos (cultivo bacteriano, extracción de ADNg, preparación de bibliotecas y secuenciación) y análisis de secuencias podrían variar, particularmente si se estudian bacterias de crecimiento lent...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACyT) por la beca de doctorado otorgada a José Antonio Magaña-Lizárraga [No. 481143].

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Accublock Mini baño seco digitalLabnetD0100Baño seco para la incubación de tubos
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Perlas magnéticas en solución para la purificación de bibliotecas
de ADN DeNovix DS-11DeNovix Inc.Espectrofotómetro UV-Vis para comprobar la calidad del ADNg extraído
Tubos LoBindEppendorf00301084181,5 mL Tubos de PCR para la agrupación de bibliotecas de ADN
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321DBastidor de microtubos magnéticos utilizado durante la purificación de ADN basada en perlas magnéticas
Gram-negative Multibac I.D.Investigación diagnóstica (México)PT-35 Discos deantibióticos estándar comerciales para pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Kit de salida media MiniSeq (300 ciclos)IlluminaFC-420-1004Carro de reactivos para secuenciación de extremos emparejados (2x150)
MiniSeqIlluminaSY-420-1001Secuenciador de sobremesa utilizado para la secuenciación de próxima generación
CentrífugaMiniSpinEppendorf5452000816Centrífuga estándar para tubos
Nextera XT DNA Library Preparation KitIlluminaFC-131-1024Reactivos para realizar librerías de ADN para secuenciación. Incluye reactivos de Caja 1 y Caja 2 para 24 muestras
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004Conjunto de índices A, B, C, D
Control PhiX v3IlluminaFC-110-3001Control de biblioteca de ADN para secuenciación Baño de
agua de precisiónLabCare America 51221081Agitador de baño de agua utilizado para cultivo bacteriano
Qubit 1X dsDNA HS Kitde ensayoInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231Reactivos para el ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia
Qubit 2.0 FluorómetroInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866Fluorómetro utilizado para el ensayo de fluorescencia 
Tubos de ensayo QubitInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32856Tubos de PCR de 0,5 ml para ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia 
Termociclador SimpliAmpApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811Termociclador utilizado para la amplificación de bibliotecas
de ADN Espectrofotómetro Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900utilizado para suspensión bacteriana en pruebas de susceptibilidad antimicrobiana
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.Kit D4300para extracción de ADN genómico (50 preparaciones)
Instrumento de sistema

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160(2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854(2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173(2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626(2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128(2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653(2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136(2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782(2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662(2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437(2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957(2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204(2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23(2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38(2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Etiquetas

Antimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

Artículos relacionados