Un método para estudiar la toxicidad y agregación de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizado

Summary

Se requiere un modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína para estudiar y comprender la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Describimos un método para monitorear la citotoxicidad y la formación agregada de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizada.

Abstract

La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurodegenerativo más común y se caracteriza por la muerte celular progresiva causada por la formación de cuerpos de Lewy que contienen α-sinucleína mal plegada y agregada. La α-sinucleína es una proteína presináptica abundante que regula el tráfico de vesículas sinápticas, pero la acumulación de sus inclusiones proteicas resulta en neurotoxicidad. Estudios recientes han revelado que varios factores genéticos, incluidas las chaperonas bacterianas, podrían reducir la formación de agregados de α-sinucleína in vitro. Sin embargo, también es importante controlar el efecto antiagregación en la célula para aplicar esto como un tratamiento potencial para los pacientes. Sería ideal usar células neuronales, pero estas células son difíciles de manejar y tardan mucho tiempo en exhibir el fenotipo antiagregación. Por lo tanto, se requiere una herramienta in vivo rápida y eficaz para la evaluación adicional de la actividad antiagregación in vivo. El método descrito aquí se utilizó para monitorear y analizar el fenotipo antiagregación en la levadura humanizada Saccharomyces cerevisiae, que expresaba α-sinucleína humana. Este protocolo demuestra herramientas in vivo que podrían usarse para monitorear la toxicidad celular inducida por α-sinucleína, así como la formación de agregados de α-sinucleína en las células.

Introduction

La enfermedad de Parkinson (EP) es un problema grave para las sociedades que envejecen en todo el mundo. La agregación de α-sinucleína está estrechamente asociada con la EP, y los agregados proteicos de α-sinucleína son ampliamente utilizados como biomarcador molecular para el diagnóstico de la enfermedad¹. α-sinucleína es una pequeña proteína ácida (140 aminoácidos de longitud) con tres dominios, a saber, la α-hélice de unión a lípidos N-terminal, el dominio central de unión a amiloide (NAC) y la cola ácida C-terminal². El plegamiento incorrecto de la α-sinucleína puede ocurrir espontáneamente y ev....

Protocol

1. Preparación de medios y soluciones

1. Preparación de los medios
   1. Para preparar YPD medio, disolver 50 g de YPD polvo en_dH2Opara hacer un volumen final de 1 L. Autoclave para esterilización. Conservar a temperatura ambiente (RT).
   2. Para hacer medio de agar YPD, disolver 50 g de polvo YPD y 20 g de agar en 1 L de dH₂O. Autoclave para esterilización. Después de enfriar, vierta sobre placas de Petri. Conservar a 4 °C.
   3. Para hacer SC con rafinosa (SRd)-Ura media, disolver 6,7 g de levadura nitrógeno base con sulfato de amonio y sin aminoácidos en 795 mL de_dH2O. Autoclave para esterilizació....

Results

Se sabe que la alta expresión de α-sinucleína está relacionada con la muerte celular neuronal y la EP en sistemas modelo de EP. Este estudio describe tres métodos para monitorear la citotoxicidad de la α-sinucleína y la formación de focos de α-sinucleína agregada en la levadura. Aquí, la α-sinucleína se sobreexpresó en levaduras, y se examinaron los fenotipos de α-sinucleína de tipo salvaje y tres variantes de α-sinucleína conocidas como mutantes familiares de la EP (Figura 1 y la Ta.......

Discussion

Dada la complejidad de varios sistemas celulares en humanos, es ventajoso utilizar la levadura como modelo para estudiar las enfermedades neurodegenerativas humanas. Aunque es casi imposible investigar las complejas interacciones celulares del cerebro humano utilizando levadura, desde una perspectiva unicelular, las células de levadura tienen un alto nivel de similitud con las células humanas en términos de homología de secuencia genómica y procesos celulares eucariotas fundamentales ^8,13

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de 96 pocillos	SPL	30096
Agarosa	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	biotech diversificado	BEM-1	Membrana de sellado permeable al gas para placas de microtitulación
cubreobjetos	Marienfeld		24 x 60 mm
Tubo de cultivo	SPL	40014
Cubeta	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactosa	sigma	G0625
D-(+)-Glucosa	sigma	G8270
D-(+)-Rafinosa pentahidratada	Daejung	6638-4105
Incubadora (agitación)	Modelo Labtron		: SHI1
Incubadora (estática)	Visión científica		modelo: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Lector de microplacas	Tecan	30050303 01	Modelo: Infinite 200 pro
pipeta multicanal 20-200 µ L	gilson	FA10011
pipeta multicanal 2-20 µ L	gilson	FA10009
Microscopio Olympus Olympus		IX-53
PEG	sigma	P4338	promedio mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Vectores lanzadera de levadura multifuncional de alto número de copias. Gen. 110 1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promotor &alfa;-sinucleína A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Las células de levadura proporcionan información sobre la biología y la patobiología de la alfa-sinucleína. Ciencia. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor &alfa;-sinucleína A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Las células de levadura proporcionan información sobre la biología y la patobiología de la alfa-sinucleína. Ciencia. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor &alfa;-sinucleína E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Las células de levadura proporcionan información sobre la biología y la patobiología de la alfa-sinucleína. Ciencia. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor &alfa;-sinucleína WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Las células de levadura proporcionan información sobre la biología y la patobiología de la alfa-sinucleína. Ciencia. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Embalse	SPL	23050
Espectrofotómetro	eppendorf	6131 05560
W303a	Presente de James Bardwell Base nitrogenada
levadura sin aminoácidos	Difco	291940
Suplementos de medio de abandono sintético de levadura sin uracilo	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00