Avanzar en el estudio de la foliculogénesis preantral requiere métodos eficientes de aislamiento de folículos de ovarios individuales. Aquí se presenta un protocolo mecánico simplificado para el aislamiento de folículos de ovarios bovinos utilizando un cortador de tejido y homogeneizador. Este método permite la recolección de un gran número de folículos preantrales viables de un solo ovario.
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Artículo de método
Aislamiento de pequeños folículos preantrales del ovario bovino mediante una combinación de fragmentación, homogeneización y filtración en serie
En este artículo
Resumen
Resumen
Comprender el proceso completo de la foliculogénesis de mamíferos es crucial para mejorar las tecnologías de reproducción asistida en ganado, humanos y especies en peligro de extinción. La investigación se ha limitado principalmente a los folículos preantrales y preantrales grandes debido a la dificultad en el aislamiento de folículos preantrales más pequeños, especialmente en mamíferos grandes como las especies bovinas. Este trabajo presenta un enfoque eficiente para recuperar un gran número de pequeños folículos preantrales de un solo ovario bovino. La corteza de los ovarios bovinos individuales se cortó en cubos de 500 μm usando un picador de tejido y se homogeneizó durante 6 minutos a 9,000-11,000 rpm usando una sonda de 10 mm. Los residuos grandes se separaron del homogeneizado con un paño de queso, seguido de una filtración en serie a través de filtros celulares de 300 μm y 40 μm. El contenido retenido en el colador de 40 μm se enjuagó en una placa de búsqueda, donde se identificaron los folículos y se recogieron en una gota de medio. La viabilidad de los folículos recolectados se probó mediante tinción de azul de tripano. Este método permite el aislamiento de un gran número de pequeños folículos preantrales viables de un solo ovario bovino en aproximadamente 90 minutos. Es importante destacar que este método es completamente mecánico y evita el uso de enzimas para disociar el tejido, lo que puede dañar los folículos. Los folículos obtenidos utilizando este protocolo se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, como el aislamiento de ARN para RT-qPCR, la inmunolocalización de proteínas específicas y el cultivo in vitro .
Introducción
Los folículos ováricos son las unidades funcionales del ovario, responsables de la producción del gameto (ovocito), así como de las hormonas críticas para la función reproductiva y la salud en general. Los folículos primordiales se forman en el ovario durante el desarrollo fetal o en el período neonatal dependiendo de la especie1, y constituyen la reserva ovárica de una hembra. El crecimiento folicular comienza con la activación de los folículos primordiales que salen de la piscina de descanso y entran en la fase de crecimiento. La foliculogénesis preantral, que abarca todas las etapas del folículo antes del desarrollo del antro, es un proceso ....
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Protocolo
Los ovarios bovinos (Bos taurus) se obtuvieron de un matadero local y se transportaron al laboratorio dentro de las 6 h posteriores a la recolección. Debido a la gran cantidad de animales procesados en la instalación, se desconoce la edad, la raza y la etapa del ciclo estral de los animales. Debido a que no se utilizaron animales vivos en estos experimentos, no se requirió un protocolo aprobado de cuidado y uso de animales.
1. Preparación de equipos y reactivos
- Cubra una sección de 2 pies de ancho de un banco de laboratorio con papel de banco.
- Obtener un mango de bisturí, una hoja de bisturí est....
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Resultados
Descripción general y pasos críticos
Usando este protocolo, los folículos preantrales bovinos pequeños pueden aislarse de manera confiable de ovarios individuales en números experimentalmente relevantes. De un total de 30 réplicas, se obtuvo un promedio de 41 folículos por réplica, con un rango de 11 a 135 folículos (Figura 4A). En 14 réplicas, los folículos se caracterizaron para la etapa de desarrollo como se describió anteriormente26 midiendo el.......
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Discusión
El presente protocolo detalla un método reproducible para recuperar folículos preantrales en etapa temprana, específicamente en etapas primarias y secundarias tempranas, del ovario bovino. Este protocolo se basa en informes anteriores 20,25,30,34,35,36 y proporciona optimizaciones que resultan en el aislamiento de un número significativo de folículos de un ovario individual.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue parcialmente financiado por el proyecto multiestatal W4112 del USDA y el premio Jastro Shields de UC Davis a SM.
Los autores desean extender su agradecimiento a Central Valley Meat, Inc. por proporcionar los ovarios bovinos utilizados en todos los experimentos. Los autores también agradecen a Olivia Silvera por su ayuda con el procesamiento de los ovarios y el aislamiento del folículo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5-3/4" Soda Cal Vidrio Desechable Pipeta Pasteur | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pipeta Pasteur que se puede utilizar para desalojar folículos de los residuos mientras se busca dentro de la placa de Petri |
| 16% Paraformaldehído | Electrónica Microscopy Sciences | 15710 | diluido al 4%; fijación de folículos para inmunotinción |
| 20 mL Jeringa Luer-lock | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Jeringa utilizada con la aguja de 18 G para desalojar los folículos de la aguja 40 μ m colador de células |
| #21 Hoja de bisturí estéril | Fisher Scientific | 50-365-023 | Se utiliza para cortar los ovarios y extraer la médula |
| 40 μ m Filtro de células | Fisher Scientific | 22-363-547 | Se utiliza para filtrar el filtrado del 300 μ m colador de células |
| 104 mm Embudo de plástico | Fisher Scientific | 10-348C | El tamaño puede variar, pero asegúrese de que la gasa esté cortada correctamente y que el homogeneizado ovárico no se derrame más de |
| 300 μ m Filtro de celdas | pluriSelect | 43-50300-03 | Se utiliza para filtrar el filtrado de la gasa |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Embudo y matraz utilizados para recoger el filtrado de la gasa |
| Agujas estériles Air-Tite 18 g | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 g ofrece suficiente presión para desalojar los folículos de los 40 μ colador de células m |
| Air-Tite Agujas estériles 27 g 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Agujas que se pueden utilizar para manipular cualquier residuo en el que se peguen folículos |
| BD Hoechst 33342 Solución Fisher Scientific | BDB561908 | Tinción de ADN fluorescente | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Componente de los medios de lavado de folículos |
| Estopilla de queso | Microscopía Electrónica Sciences | 71748-00 | Primer paso de filtrado del homogeneizado ovárico destinado a eliminar los restos de tejido grandes |
| Hojas de afeitar de seguridad clásicas de doble filo | Wilkinson Sword | N/A | Hojas de afeitar que se ajustan mejor en el McIlwain Tissue Chopper y no se desafilan rápidamente |
| Anticuerpo secundario Donkey-Anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Anticuerpo secundario para inmunotinción |
| Eisco Látex Bulbos de pipeta | Fisher Scientific | S29388 | Bombilla de goma para usar con pipetas |
| Pasteur Tampón HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Componente de los medios de lavado de folículos |
| Homogeneizador | VWR | 10032-336 | Homogeneizar el tejido ovárico para liberar folículos |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software utilizado para el análisis de fluorescencia-inmunolocalización |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Se utiliza para cortar tejido ovárico lo suficientemente pequeño como para homogeneizarlo |
| Microscopio - Estereoscopio | Olympus | SZX2-ILLT | Microscopio de disección utilizado para buscar y recolectar folículos del |
| filtrado Microscopio - Nikon invertido | Diaphot 300 | Microscopio invertido utilizado para la visualización de campo claro de folículos aislados con gran aumento | |
| Microscopio - ECHO Revolve | R4 | invertido para la visualización de campo claro y epifluorescencia de folículos aislados con gran aumento | |
| Aceite mineral | Sigma-Aldrich | M8410-1L Aceite | para cubrir las gotas de folículo Medio de lavado para evitar la evaporación durante la búsqueda |
| Aminoácidos no esenciales (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Componente del medio de lavado de folículos |
| Suero de burro normal | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reactivo para tampón bloqueante de inmunotinción |
| Nunc Placas de 4 pocillos para FIV | Thermo Fisher Scientific | 144444 | Placas de 4 pocillos para el aislamiento y lavado de folículos |
| Solución de penicilina-estreptomicina 100x | Gibco | 15-140-122 | Componente del medio de lavado de folículos Placa de |
| Petri 60 mm OD x 13,7 mm | Ted Pella | 10184-04 Placa de | Petri que se adapta mejor en el McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Tampón de lavado para ovarios y folículos |
| Tabla de cortar de plástico | Fisher Scientific | 09-002-24A | Tabla de cortar de tamaño suficiente para cortar de forma segura ovarios |
| Polivinilpirrolidona (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | La adición de PVP (0,1% p/v) al PBS evita que los folículos se peguen a la placa o entre sí... |
| ProLong Gold Mountant Antidecoloración | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Medio de montaje para células o tejidos marcados con fluorescencia |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Kit de limpieza de columna de ARN |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Software de análisis estadístico |
| Anticuerpo policlonal Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Anticuerpo primario | Abcam | ab181701 | Cx37 para inmunotinción |
| RevertAid RT kit de transcripción inversa | Thermo Fisher Scientific | K1691 | kit de síntesis de ADNc |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Software de análisis estadístico |
| Solución de hidróxido de sodio (1N/Certificado) | Fisher Scientific | SS266-1 | Se utiliza para aumentar el pH del medio a 7,6-7,8 |
| Piruvato de sodio (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Componente de lavado de folículos medio |
| Placa de Petri cuadrada 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | permiten una identificación más eficiente de los folículos |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix para la reacción de PCR |
| Filtro de tapa de botella roscada Steritop | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE Se utiliza para esterilizar el medio de lavado de folículos | |
| Tinción de gel de ADN segura para SYBR | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Tinción para productos de PCR visual en gel de agarosa |
| TCM199 con Hank' s Sales | Gibco | 12-350-039 | Componente del medio de lavado de folículos |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergente para inmunotinción tampón de permeabilización |
| Reactivo de Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | reactivo de aislamiento de ARN |
| Solución de azul de tripano, 0,4% | Gibco | 15-250-061 | Se utiliza para probar la viabilidad de folículos aislados |
| Tween 20 | Detergente para tampón de lavado inmunotinción | ||
| Placa calentadora Universal | WTA | 20931 | Placa caliente para mantener los folículos a 38,5 °C; C mientras se busca bajo el microscopio |
| Micropipetas calibradas Wiretrol II Drummond | 50002-005 | Micropipetas de vidrio para manipular folículos |
Referencias
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M.
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Reimpresiones y permisos
