Artículo de método

Etiquetado de proximidad basado en AirID para la interacción proteína-proteína en plantas

DOI:

10.3791/64428

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16 de septiembre de 2022

 ,  ,  ,  , 
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para realizar el experimento de marcaje de proximidad (PL) en pepino (Cucumis sativus L.) utilizando la proteína AT4G18020 (APRR2)-AirID como modelo. El método describe la construcción de un vector, la transformación de un constructo a través de la agroinfiltración, la infiltración de biotina, la extracción de proteínas y la purificación de proteínas marcadas con biotina a través de la técnica de purificación por afinidad.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En células y plantas de mamíferos, los enfoques de marcaje de proximidad (PL) que utilizan ascorbato peroxidasa modificada (APEX) o la biotina ligasa BirA de Escherichia coli (conocida como BioID) han demostrado ser exitosos en la identificación de interacciones proteína-proteína (IBP). APEX, BioID y TurboID, una versión revisada de BioID, tienen algunas restricciones además de ser tecnologías valiosas. El recientemente desarrollado AirID, una versión novedosa de BioID para la identificación de proximidad en interacciones proteína-proteína, superó estas restricciones. Anteriormente, AirID se ha utilizado en modelos animales, mientras que el estudio actual demuestra el uso de AirID en plantas, y los resultados confirmaron que AirID funciona mejor en sistemas vegetales en comparación con otras enzimas PL como BioID y TurboID para el etiquetado de proteínas que son proximales a las proteínas objetivo. A continuación, se muestra un protocolo paso a paso para identificar a los socios de interacción de proteínas utilizando la proteína AT4G18020 (APRR2) como modelo. Los métodos describen la construcción del vector, la transformación del constructo a través de la agroinfiltración, la transformación de la biotina, la extracción de proteínas y el enriquecimiento de proteínas marcadas con biotina a través de la técnica de purificación por afinidad. Los resultados concluyen que AirID es una enzima novedosa e ideal para analizar los IBP en plantas. El método se puede aplicar para estudiar otras proteínas en plantas.

Introducción

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Varias proteínas celulares trabajan bajo el sistema biológicamente regulador, y las interacciones proteína-proteína (IBP) son parte de este sistema y la base de muchos procesos celulares. Además de los IBP, la función de las proteínas naturales se promueve postraduccionalmente a través de diversas modificaciones, como la formación de complejos, la ubiquitinación y la fosforilación. Por lo tanto, el estudio de los IBP es importante para comprender la posible función de las proteínas diana. Los IBP se han llevado a cabo utilizando diversas tecnologías, como el análisis por espectrometría de masas después de la inmunoprecipitación (análisis IP-MS)1, el sistema de dos híbridos de levadura (Y2H)2, también matrices basadas en célulaslibres 3. Estos métodos exploraron varios hallazgos vitales en el campo de la investigación. Sin embargo, estos métodos tienen algunos inconvenientes; por ejemplo, Y2H es una estrategia costosa y que requiere mucho tiempo y requiere la creación de la biblioteca Y2H de la especie objetivo.

Además, la técnica Y2H utiliza levadura, un organismo eucariota unicelular heterólogo, que no podía reflejar con precisión el estado celular de las células eucariotas superiores. El IP-MS no es adecuado para proteínas de alta hidrofobicidad y muestra una baja eficiencia en la captura de IBP débiles. Varias proteínas esenciales en las plantas, como el dominio de unión a nucleótidos y las proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina (NLR) y las quinasas similares a receptores (RLK) se expresan a un nivel bajo y en su mayoría interactúan con otras proteínas de forma transitoria; Por lo tanto, el uso de estos métodos es insuficiente para comprender los mecanismos que subyacen a la regulación de estas proteínas3.

Una nueva técnica llamada biotinilación de proximidad (PB, por sus siglas en inglés) ayuda a los investigadores a identificar los IBP. El PB depende de las enzimas PL, que se unen a la proteína de interés (POI), y cuando la proteína asociada se acerca al POI, el PL adhiere una etiqueta química de biotina a la proteína asociada. Además, la proteína marcada se puede identificar y se puede saber rápidamente qué proteína asociada se une a la proteína objetivo5. Estudios previos demostraron que BioID y TurboID son herramientas exitosas para los IBP, especialmente en plantas, pero tienen ciertas limitaciones4. BioID necesita un alto nivel de biotina para etiquetar las proteínas asociadas, lo que lleva más de 16 h. En comparación con BioID, el TurboID es más beneficioso, ya que etiqueta la proteína en 10 minutos y puede etiquetar la proteína asociada a temperatura ambiente (RT). También es tóxico para las células en ciertas condiciones y marca aquellas proteínas que no muestran interacción con la proteína de interés.

Para superar estos problemas, AirID, desarrollado por Kido et al., es más eficiente que el resto de las enzimas de marcado, aunque la similitud de secuencia es del 82% entre BioID y AirID5. Para comprobar la eficiencia de AirID, realizamos un experimento utilizando un punto de interés con asociados conocidos. Este experimento confirmó que, sin duda, AirID podía etiquetar proteínas asociadas en células vegetales. AirID es una enzima valiosa para analizar los IBP in vitro y en células. Crea menos toxicidad y es menos erróneo en los procesos de tiempo que TurboID para etiquetar a los no socios, lo que lleva a la muerte de la célula. Demuestra que AirID es más competitivo que otras enzimas de marcaje para la biotinilación de proximidad. Es más preciso, tiene más potencial en procesos que requieren tiempo y es menos tóxico in vitro y en células vivas. El protocolo actual describe la identificación de proteínas interactuantes de APRR2 utilizando AirID como enzima PL; además, el método se puede aplicar a otras proteínas para investigar los IBP en especies vegetales.

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Protocolo

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1. Preparación del material vegetal

  1. Cucumis sativus (Pepino) se emplea para el análisis experimental. Poner las semillas en agua, incubar a 50 °C durante 20 min, y luego colocar las semillas en papel de filtro en una placa de Petri durante 12-16 h.
  2. Después, transfiera las semillas a macetas que contengan tierra (compradas comercialmente) y cultive en una cámara climática a 23 °C de temperatura y 16 h de fotoperiodo de luz y 8 h de oscuridad.
  3. Mantenga las plantas en la cámara climática durante 3-4 semanas hasta que las plantas alcancen las etapas de 3 o 4 hojas para una agroinfiltración exitosa.

2. Hacer que AirID construya

  1. Utilice APRR2 como proteína diana y construya APRR2-AirID bajo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (p35S: APRR2-AirID). Introdúzcalo en el vector binario compatible con Gateway pEarleyGate1006 (proporcionado por la Dra. Kathrin Schrick, Universidad Estatal de Kansas) y sintetice la enzima PL directamente de acuerdo con la secuencia proporcionada en el Archivo Suplementario 1.

3. Preparación de células competentes

  1. Preparación de células competentes para DH5α
    1. Inocular los 2 mL de LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl; pH = 7,0.) con células de E.Coli DH5α (directamente del caldo congelado sin descongelar) y cultivar durante la noche (O/N) a 37 °C.
    2. Inocular recién el inóculo al 0,1%-0,5% del cultivo O/N en 100 mL de medio LB y cultivar las células hasta que OD600 alcance entre 0,4-0,6, y luego incubar el cultivo a 4 °C durante 30 min.
    3. Llevar el cultivo a dos tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugar a 2500 x g durante 5 min a 4 °C.
    4. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 10 mL de CaCl2 helado 0,1 M y colóquelo en hielo durante 15 min. Granular las células con un centrifugado de 2500 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Resuspender las células en 1 mL de CaCl2 + 20% de glicerol 0,1 M frío como hielo, alícuota 100 μL en cada tubo de 1,5 mL, y almacenarlas inmediatamente a -80 °C.
  2. Preparación de células competentes GV3101
    1. Inocular 2 mL de LB (que contiene 50 μg/mL de gentamicina y 25 μg/mL de rifampicina) con una sola colonia GV3101. Incubar el cultivo O/N a 28 °C agitando a 250 rpm.
    2. Inocular 200 mL de LB con 1 mL de un cultivo saturado durante la noche. Agitar el cultivo a 250 rpm mientras se incuba a 28 °C hasta que el diámetro exterior600 sea igual a 0,5.
    3. Transfiera el cultivo a cuatro tubos de centrífuga estériles de 50 ml preenfriados y colóquelos en hielo durante 30 minutos.
    4. Granular las células a 2500 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y coloque los gránulos en hielo.
    5. Resuspender las células en 10 mL de solución helada de CaCl2 0,1 M. Agrupe las celdas en un tubo Oakridge de 50 ml preenfriado.
    6. Gellet las células a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 ml de solución helada de CaCl2 . Poner en hielo durante 30 min.
    7. Gellet las células a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 ml de solución helada de CaCl2 0,1 M.
    8. Dispensar las células en una alícuota de 50 μL en tubos de polipropileno estériles preenfriados. Almacenar las celdas a -80 °C.

4. Agroinfiltración

  1. Primero, transfiera el plásmido a agrobacterium
    1. Transferir 2,5 μL del plásmido generado en el paso 2.1 a las células competentes de la cepa agrobacterium tumefaciens GV3101 e incubar en hielo durante 30 min.
    2. Transfiera el tubo que contiene el plásmido y las células competentes a nitrógeno líquido durante 3 min.
    3. Realice un choque térmico a 37 °C durante 5 minutos en una incubadora y, a continuación, coloque el tubo en hielo durante 2 minutos.
    4. Añadir 1.000 μL de medio LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl; pH = 7,0) a la agrobacteria e incubar a 30 °C y 118 rpm durante 1 h.
    5. Centrifugar a 3.000 x g durante 2 min a 4 °C.
    6. Deseche los 800 μL superiores de la solución y mezcle la solución restante. A continuación, aplíquelo en LB (como se menciona en el paso 4.1.4 añadido con agar y 50 μg/ml de kanamicina para el plásmido y 50 μg/ml de gentamicina y 25 μg/ml de rifampicina para las células competentes GV3010). Incubar las placas a 30 °C durante 48 h.
      NOTA: Es mejor elegir algunas colonias y realizar PCR para confirmar el gen de interés7.
  2. Recoja algunas colonias bacterianas de las placas y colóquelas en medios LB más los antibióticos apropiados (ver paso 4.1.6). Incubar a 30 °C y 218 rpm durante 36-48 h.
  3. Centrifugar las células a 3.000 x g durante 2 minat 4 °C. Resuspender las células a DO600 = 1,0 en tampón de agroinfiltración (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM de acetosiringa).
  4. Infiltrar el inóculo (generado a partir del paso 4.3) en la epidermis (abaxial) con una jeringa sin aguja de 1 mL.
    NOTA: Es mejor infiltrarse en toda la hoja y optar por replicar. Para 4-5 plantas, use una construcción. Por cada hoja, 1,5 mL de agrobacterias resuspendidas es suficiente.
  5. Mantener las plantas durante 36 h en la cámara climática con una luz de 16 h (aproximadamente 75 μmol·m-2·s-1) y un fotoperiodo oscuro de 8 h a 23 °C.
  6. Después de 36 h de infiltración del constructo, infiltrar 1 mL de 5 μM de biotina (en solución de 10 mM de MgCl2 ) en las hojas ya filtradas del constructo.
  7. Mantenga las plantas tratadas durante 4-12 h adicionales antes de cosechar el tejido de las hojas.
    NOTA: De acuerdo con el estudio anterior, la proteína diana alcanza su punto máximo a las 36 h, por lo que se deben elegir infiltraciones de biotina de 36 hpi 4,6. La duración de la incubación de la biotina depende del estudio objetivo, pero según el experimento actual, un período de incubación de 8 h es más adecuado para marcar proteínas.

5. Recogida de muestras

NOTA: Todos los materiales para la recolección de muestras deben ser estériles para evitar la contaminación por queratina, y todos los pasos del protocolo deben realizarse en un ambiente libre de contaminación.

  1. Corta las hojas infiltradas y transfiérelas rápidamente a nitrógeno líquido para evitar la degradación de las proteínas.
  2. Realizar la predetección de proteínas a través de análisis de inmunotransferencia6; esto es muy recomendable antes de la coinmunoprecipitación (Co-IP).

6. Extracción total de proteínas de la hoja

  1. Muele las hojas con un mortero, agrega rápidamente 2 ml de 1x PBS-BSA PH 7.4 y muele lentamente.
  2. Tome un tubo cónico de 15 ml, coloque un filtro de material de filtración rápida en la parte superior del tubo cónico, transfiera la mezcla de muestra al tubo a través del filtro de material de filtración rápida y manténgalo en hielo.
  3. Transfiera las muestras a un tubo de 2 ml y agregue un cóctel inhibidor de proteínas al 1%.
  4. Mezclar el contenido girando hacia arriba y hacia abajo 7-8 veces y centrifugar a 1.000 x g durante 2 min a 4 °C.
  5. Transfiera el disolvente superior de las muestras a tubos nuevos de 2 ml, agregue 10% de β-D-maltósido (β-D.M) y colóquelo en hielo durante 5 min. Centrifugar a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.

7. Equilibrar la columna de desalinización

  1. Centrifugar la columna a 1.000 x g durante 1 min a 4 °C.
    NOTA: Marque un lado de la columna y asegúrese de que el lado marcado mire hacia afuera durante todos los procesos de centrifugación.
  2. Retire la cubierta superior e inferior de la columna y centrifugue a 1.000 x g durante 2 min a 4 °C.
  3. Deseche la solución líquida del tubo de recolección de la columna y agregue 5 ml de 1x tampón PBS para lavar.
  4. Centrifugar la columna a 1.000 x g durante 2 min a 4 °C.
  5. Repita los pasos 7.3 y 7.4 al menos cinco veces.

8. Lavado de perlas magnéticas

  1. Tome un tubo de 1,5 ml y agregue 50 μl de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1.
  2. Agregue 1 ml de 1x PBS-BSA para lavar, mezcle bien y colóquelo en el soporte magnético durante 3 minutos. Deseche el sobrenadante.
  3. Repita el paso 8.2 al menos tres veces.
  4. Después de cada lavado, coloque el tubo en la rejilla magnética para adsorber las perlas hacia un lado del tubo para eliminar el tampón de lavado.

9. Enriquecimiento de proteínas biotiniladas

  1. Añadir 2 mL de las muestras a la columna y centrifugar a 1.000 x g durante 8 min a 4 °C.
  2. Añadir 1 ml del extracto proteico desalado a 50 μl de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1 para equilibrarlas.
  3. Coloque el tubo en el rotador a velocidad normal para que la solución se mezcle completamente e incube a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos.
  4. Coloque las cuentas en la rejilla magnética durante 3 minutos en RT, o hasta que se junten en un lado del tubo, para eliminar suavemente el sobrenadante.
  5. Añadir 1 ml de tampón de lavado I (2% de SDS en agua), girar a RT durante 2 min en un rotador y repetir el paso 9.4.
  6. Coloque el tubo en el rotador a RT durante 2 min después de agregar 1 mL de tampón de lavado II (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% de ácido desoxicólico [p/v] y 1% de Triton X-100). Repita el paso 9.4.
  7. Añadir 1 mL de tampón de lavado III (10 mM de Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM de LiCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de ácido desoxicólico [p/v], 1% de NP40 [v/v]), y girar con un agitador durante 2 min a RT. A continuación, repita el paso 9.4.
  8. Para eliminar el detergente, añadir 1,7 ml de 50 mM de Tris-HCl (pH = 7,5) y repetir el paso 9,4. Repita este paso una vez más.
  9. Lave las perlas seis veces durante 2 minutos cada una en 1 ml de tampón de bicarbonato de amonio de 50 mM a RT y repita el paso 9.4.
  10. Añadir 50 μL del extracto proteico que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 12% (p/v) de sacarosa (Suc), 2% (p/v) de lauril sulfato de litio y 1,5% (p/v) de ditiotreitol a las perlas, choque térmico en la incubadora a 100 °C durante 5 min y seguir el paso 9.4. Almacenar el sobrenadante a -80 °C para el análisis LC-MS/MS.

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Resultados

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Según investigaciones previas, el gen del pepino APRR2 es el gen candidato que controla el color blanco de la fruta inmadura8. Aquí, se desarrolló un protocolo utilizando AirID como enzima de marcaje de proximidad para encontrar la proteína asociada que interactúa con APRR2 en el pepino. El constructo se transfirió a las hojas de pepino y, después de 36 h después de la infiltración, se transfirió biotina. Después de 48 h se tomaron las muestras para el análisis de Western blot pa...

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Discusión

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En el experimento actual, se utilizó AirID para el etiquetado de proximidad, que Kido et al. desarrollaron a través de un algoritmo de reconstrucción de enzimas ancestrales utilizando un gran conjunto de datos del genoma y cinco enzimas BirA convencionales5. Las mutaciones aleatorias se utilizaron en la ingeniería evolutiva tradicional de proteínas para mejorar la actividad 9,10, ya que las mutaciones aleatorias no pueden producir cambios ...

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Divulgaciones

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Los autores declararon no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nº 32000197 a X.H.), la Subvención Financiera Especial de la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (Subvención Nº 2019T120467 a X.H.)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcetossiringaBeijing solaribo ciencia y tecnología Co.LtdS1519
Solución acrílica/Bis al 30%Sangon Biotech (Shanghái) Co.Ltd1510KA4528
AgarBioFroxx GmbHD64683
Agarosatsingke (Shanghái) Co.LtdTSJ001
Bicarbonato de amonioSangon Biotech (Shanghái) Co.Ltd
BiotinaBBI Ciencias de la vidaG908BA0012
CaCl2BBI Ciencias de la vida
Células competentes GV3101Hecho en el experimento
Columna de desalinizaciónThermo scientific WC321753
Ácido desoxicólicoSangon Biotech (Shanghái) Co.Ltd
DH5 y alfa; células competentesHecho en el experimentoE.coli DH5 y alfa;
β-D-maltosideBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS818
EDTASangon Biotech (Shanghai) Co.LtdE104BA0029
GlycineSangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd161BA0031
HEPESBeijing solaribo ciencia y tecnologíaCo.Ltd H8090
LiClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdH209BA0003
MESBeijing solaribo ciencia y tecnología Co.LtdM8019
MiraClothEMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay3429963Filtro de material de filtración rápida
MgCl2Beijing solaribo ciencia y tecnología Co.Ltd20200819
NaClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdH324BA0003
NP40Sangon Biotech (Shanghái) Co.LtdN8030
Cóctel inhibidor de proteínasBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS3450
PVDFBIO-RAD
SDS BeijingScolario Science and Tech Co.LtdS1015
SilwetSangon Biotech (Shanghái) Co.LtdS9430
Perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1Biotecnología enriquecedora7E511E1Perlas magnéticas
TEMEDServicebioG2056
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghái)Co.Ltd GB03BA007
Tris-HClSangon Biotech (Shanghái) Co.LtdF828BA0020
TriptonaTermo científicoLP0042
G313BA0018 E209BA0008 actualG818BA0029 actual 5820172

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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