Un protocolo de limpieza eficiente para el estudio del desarrollo de semillas en tomate (Solanum lycopersicum L.)

Resumen

La semilla de tomate es un modelo importante para estudiar la genética y la biología del desarrollo durante la reproducción de las plantas. Este protocolo es útil para limpiar las semillas de tomate en diferentes etapas de desarrollo para observar la estructura embrionaria más fina.

Resumen

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es uno de los principales cultivos comerciales en todo el mundo. La semilla de tomate es un modelo importante para estudiar la genética y la biología del desarrollo durante la reproducción de las plantas. La visualización de la estructura embrionaria más fina dentro de una semilla de tomate a menudo se ve obstaculizada por el mucílago de la capa de semillas, el tegumento de capas múltiples y un endospermo de paredes gruesas, que debe resolverse mediante una laboriosa sección de incrustación. Una alternativa más simple es emplear técnicas de limpieza de tejidos que hacen que la semilla sea casi transparente utilizando agentes químicos. Aunque los procedimientos convencionales de limpieza permiten una visión profunda de las semillas más pequeñas con una capa de semilla más delgada, la limpieza de las semillas de tomate sigue siendo un desafío técnico, especialmente en las últimas etapas de desarrollo.

Aquí se presenta un protocolo de limpieza rápido y que ahorra mano de obra para observar el desarrollo de las semillas de tomate de 3 a 23 días después de la floración, cuando la morfología embrionaria está casi completa. Este método combina la solución de limpieza a base de hidrato de cloral ampliamente utilizada en Arabidopsis con otras modificaciones, incluida la omisión de la fijación de formalina-aceto-alcohol (FAA), la adición del tratamiento con hipoclorito de sodio de las semillas, la eliminación del mucílago de la cubierta de semilla ablandada y el lavado y el tratamiento al vacío. Este método se puede aplicar para la limpieza eficiente de semillas de tomate en diferentes etapas de desarrollo y es útil en el monitoreo completo del proceso de desarrollo de semillas mutantes con buena resolución espacial. Este protocolo de limpieza también se puede aplicar a imágenes profundas de otras especies comercialmente importantes en las solanáceas.

Introducción

El tomate (S. lycopersicum L.) es uno de los cultivos hortícolas más importantes del mundo, con una producción de 186,8 millones de toneladas de frutos carnosos de 5,1 millones de hectáreas en 2020¹. Pertenece a la gran familia Solanaceae con alrededor de 2.716 especies², incluyendo muchos cultivos comercialmente importantes como berenjenas, pimientos, patatas y tabaco. El tomate cultivado es una especie diploide (2n = 2x = 24) con un tamaño de genoma de aproximadamente 900 Mb³. Durante mucho tiempo, se ha hecho un gran esfuerzo hacia la domesticación y reproducción del tomate mediante la....

Protocolo

1. Preparación de soluciones

1. Prepare el fijador FAA agregando 2.5 ml de formaldehído al 37%, 2.5 ml de ácido acético glacial y 45 ml de etanol al 70% en un tubo de centrífuga de 50 ml. Vortex y almacénelo a 4 °C. Prepare el fijador FAA justo antes de usar.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído al 37% es corrosivo y potencialmente cancerígeno si se expone o inhala. El fijador debe realizarse en una campana extractora mientras se usa el equipo de protección personal adecuado.
2. Prepare la solución de limpieza agregando 5 ml de 100% de glicerol, 40 g de hidrato de cloral y 10 ml de agua destilada en una botella de vidrio de 100 ml envuelta co....

Resultados

Cuando las semillas de tomate se eliminaron utilizando un método convencional como en Arabidopsis, las células densas del endospermo bloquearon la visualización de embriones de tomate tempranos a 3 DAF y 6 DAF (Figura 3A, B). A medida que aumentaba el volumen total del embrión, un embrión globular apenas se distinguía a 9 DAF (Figura 3C). Sin embargo, a medida que el tamaño de la semilla continuó aumentando, su permeabilidad disminuyó, .......

Discusión

En comparación con la sección mecánica, la tecnología de limpieza es más ventajosa para la obtención de imágenes tridimensionales, ya que conserva la integridad de los tejidos u órganos vegetales¹⁶. Los protocolos de limpieza convencionales a menudo se limitan a muestras pequeñas debido a la penetración más fácil de las soluciones químicas. La semilla de tomate es una muestra problemática para la limpieza de tejidos porque es aproximadamente 70 veces más grande que una semilla de Arabidopsis

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1.000 y micro; L pipeta	GILSON FA10006M
1.000 µ L puntas de pipeta	Corning	T-1000-B
2 ml tubo de centrífuga	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehído	DAMAO	685-2013
5.000 µ L pipeta	Eppendorf 3120000275
5.000 µ L puntas de pipeta	biosharp	BS-5000-TL
Tubo de centrífuga de 50 ml	Corning	430829
Etanol absoluto	BOYUAN	678-2002
Botella de vidrio	Fisher	FB800-100
Hidrato de cloral	Meryer	M13315-100G
Cubreobjetos	Leica	384200
Microscopio DIC	Zeiss	Axio Imager A1 Aumento	10x, 20x y 40x
Desinfectante	QIKELONGAN	17-9185
Aguja de disección	Bioroyee	17-9140
Tierra nutritiva para flores	Pinza FANGJIE
HAIOU		4-94
Ácido Acético Glacial	BOYUAN	676-2007
Glicerol	Solarbio	G8190
Agitador magnético	IKA	RET básico
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Agitador orbital	QILINBEIER	QB-206
Sustrato de siembra	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Cribado:0-10 mm
Portaobjetos cóncavo simple	HUABODEYI
Portaobjetos	Leica	3800381
Microscopio estereoscópico	Leica	S8 APO	Aumento de 1x a 4x
Papel de aluminio	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Bomba de vacío	SHIDING	SHB-III
Medidor de vórtice	Silogex	MX-S

de HBDY1895