Informamos una cámara ambiental flexible en la parte superior de la etapa para obtener imágenes de lapso de tiempo de células vivas utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada vertical con detección de señal transmitida. Se obtuvieron imágenes de gotitas lipídicas en células SKOV3 tratadas con ácido oleico durante un máximo de 24 h con un intervalo de tiempo de 3 minutos.
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Artículo de método
Una cámara flexible para imágenes de células vivas de lapso de tiempo con microscopía de dispersión Raman estimulada
En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imágenes químicas sin etiquetas. Las imágenes de células vivas con SRS se han demostrado para muchas aplicaciones biológicas y biomédicas. Sin embargo, las imágenes SRS de lapso de tiempo a largo plazo de células vivas no se han adoptado ampliamente. La microscopía SRS a menudo utiliza un objetivo de inmersión en agua de alta apertura numérica (NA) y un condensador de inmersión en aceite de alta NA para lograr imágenes de alta resolución. En este caso, el espacio entre el objetivo y el condensador es de solo unos pocos milímetros. Por lo tanto, la mayoría de las cámaras ambientales comerciales de etapa superior no se pueden usar para imágenes SRS debido a su gran grosor con una cubierta de vidrio rígido. Este documento describe el diseño y la fabricación de una cámara flexible que se puede utilizar para imágenes de células vivas de lapso de tiempo con detección de señal SRS transmitida en un marco de microscopio vertical. La flexibilidad de la cámara se logra mediante el uso de un material blando: una película delgada de caucho natural. El nuevo diseño de la carcasa y la cámara se puede agregar fácilmente a una configuración de imágenes SRS existente. Las pruebas y los resultados preliminares demuestran que el sistema de cámara flexible permite obtener imágenes SRS estables, a largo plazo y de lapso de tiempo de células vivas, que se pueden utilizar para diversas aplicaciones de bioimagen en el futuro.
Introducción
La microscopía óptica se utiliza para observar las microestructuras de las muestras. La imagen óptica es rápida, menos invasiva y menos destructiva que otras tecnologías1. La obtención de imágenes de células vivas con microscopía óptica se desarrolla para capturar la dinámica de células vivas cultivadas durante un largo período2. Los diferentes tipos de contrastes ópticos proporcionan información distinta sobre las muestras biológicas. Por ejemplo, la microscopía óptica de fase muestra la sutil diferencia en los índices de refracción en la muestra3. La microscopía de fluorescencia se usa ampliamen....
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Protocolo
1. Construir el recinto ambiental del microscopio
NOTA: Esta gran carcasa ambiental de microscopio se utiliza para controlar la temperatura del cuerpo del microscopio y el entorno de imágenes que se estabilizará a 37 °C (Figura 1A).
- Marque las ubicaciones de los pies del marco del microscopio SRS y la etapa motorizada con un rotulador en la mesa óptica. Monte dos diafragmas de iris frente al escáner galvanómetro del microscopio y ajuste para que la bomba y los rayos láser de Stokes pasen por el centro de los diafragmas de iris.
- Retire el marco del microscopio y la plataforma de la mesa óptic....
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Resultados
Fabricamos y ensamblamos el sistema de cámara flexible para imágenes SRS de lapso de tiempo (Figura 1 y Figura 2), y luego evaluamos el rendimiento del sistema. La temperatura dentro del recinto ambiental del microscopio alcanzó los 37 °C esperados en 1 h, lo que no afectó significativamente la temperatura ambiente (Figura 3A). La temperatura en la cámara flexible alcanzó los 37 °C en 1,5 h, y se mantuvo estable a 37 °C durante al m.......
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Discusión
La microscopía SRS de células vivas de lapso de tiempo es una técnica de imagen alternativa para el seguimiento de moléculas sin etiquetas. En comparación con el etiquetado de fluorescencia, las imágenes SRS están libres de fotoblanqueo, lo que permite el monitoreo a largo plazo de las moléculas. Sin embargo, hasta la fecha, el sistema de imágenes de células vivas en una microscopía SRS vertical no está disponible comercialmente. En este trabajo, se desarrolló un sistema de imágenes de células vivas con una caja de gabin.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Queremos agradecer al Equipo de Diseño Senior de Pregrado 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza y James Walsh) de la Universidad de Binghamton por el diseño, fabricación y prueba de la caja de la carcasa del microscopio. Agradecemos a Scott Hancock, Olga Petrova y Fabiola Moreno Olivas de la Universidad de Binghamton por sus útiles discusiones. Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R15GM140444.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio SRS > construcción en laboratorio | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz Amplificador de bloqueo | HF2LI | Zurich Instruments | |
| Diafragma de iris | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Montaje de espejo cinemático | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Marco de microscopio | Nikon Inc | FN-1 | |
| Etapa de microscopía motorizada | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Condensador de inmersión en aceite (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Objetivo de inmersión en agua (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materiales y piezas para la carcasa del microscopio (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Módulo calefactor Airtherm | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Controlador calefactor Airtherm, monitor de CO2 y humedad | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Módulo mezclador Air/CO2 | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Manguera de conducto flexible (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| Cerámica de vidrio-mica de alta temperatura, fácil de mecanizar (6'' x 6'', 1/4'' de espesor) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Láminas de policarbonato (espesor 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Láminas de caucho de silicona (36'' x 36'', espesor 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materiales y piezas para la Cámara flexible | |||
| pulgadas) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Sierra de corona (diámetro de corte 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| Tubo de caucho de silicona de alta temperatura, suave, 2 mm de diámetro interior, 5 mm de diámetro exterior | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Filtro en línea (1/4 NPT, 40 micras) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Tubo redondo de aluminio (1/8'' de espesor de pared, 4' ' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Tubo redondo de aluminio 6061 multipropósito (3/4'' de espesor de pared, 3-3/4'' de diámetro exterior) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Barra de aluminio 6061 multipropósito (12'' x 12'', espesor 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Barra de aluminio 6061 multipropósito (8'' x 8'', espesor 3/8' ') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Revólver objetivo (sencillo) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Portamuestras (modificado) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Película de caucho natural ultrafina (espesor 0,01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Tarro de vidrio sellable al vacío | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cubierta de vidrio con fondo de placas de cultivo estériles (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Microscopía electrónica Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM medio de cultivo celular ThermoFisher | Scientific | 11965092 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor colorante fluorescente DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Ácido oleico | MilliporeSigma | 364525 | |
| Línea celular SKOV3 | ATCC | HTB-77 |
Referencias
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
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Reimpresiones y permisos
