aLa rabia es una encefalitis viral aguda y progresiva. El agente etiológico en forma de bala pertenece al género Lyssavirus, al menos 17 de los cuales causan rabia en todo el mundo (excepto en la Antártida). El virus de la rabia es el miembro más importante de estos diversos virus de ARN. Todos los mamíferos son susceptibles, siendo los murciélagos y los mesocarnívoros reservorios importantes. La transmisión ocurre principalmente después de una mordedura. Como agentes neurotrópicos por excelencia, los viriones progresan centrípetamente después de la deposición a través de axones desde la periferia hasta el sistema nervioso central (SNC) para su replicación, luego a las glándulas salivales, y se excretan en la saliva. A nivel mundial, los perros son responsables del mayor número de muertes humanas por rabia, causando decenas de miles de muertes al año. Teniendo en cuenta las dimensiones zoonóticas, los métodos de laboratorio son esenciales para la investigación aplicada y la notificación, prevención y control de enfermedades en humanos, animales domésticos y vida silvestre. El objetivo detrás de esta colección de nueve artículos interrelacionados es presentar métodos que proporcionen introspección a la aparición, detección, patobiología, epidemiología, manejo y mejora de la rabia en productos biológicos.
¿Cómo se evalúa la rabia? La rabia debe ser una enfermedad de declaración obligatoria, con la recopilación, el análisis y la interpretación epidemiológica adecuados de los datos. Hoy en día, la mayoría de los casos se informan a partir de la vigilancia pasiva, basada en animales que exponen a las personas. Si bien puede parecer razonablemente sencillo imaginar la captura, restricción, sedación y eutanasia seguras de un sospechoso clínico (es decir, un perro mordedor para el diagnóstico de rabia), esto no es tan fácil para algunos animales salvajes. Por ejemplo, Taiwán era un área considerada "libre" de rabia, originalmente basada en una amplia vigilancia de animales domésticos. Sin embargo, reconociendo la importancia de otros reservorios de animales, los investigadores de la isla dirigieron su atención a la vida silvestre. Como describen Hsu et al., la recolección selectiva de murciélagos moribundos y muertos brinda una oportunidad para la detección de especies únicas de lyssavirus en Taiwán1. Tales esfuerzos ampliaron la amplitud taxonómica de este género viral y proporcionaron un esquema razonable para otras evaluaciones en Asia.
¿Qué tejidos se necesitan para el diagnóstico de lyssavirus? Además de la derivación de métodos de vigilancia relevantes y la identificación correcta de especies, la selección segura y apropiada de tejidos es primordial para el diagnóstico sensible y específico de la rabia. Desdeel siglo XIX , el sistema nervioso central (SNC) fue apreciado como tejido primario. Los animales fueron sacrificados, sus cadáveres fueron enviados al laboratorio, se abrieron cráneos, se extrajeron cerebros y se examinaron partes microscópicamente en busca de inclusiones virales. Sin embargo, el envío de animales enteros no es práctico, particularmente con mamíferos de cuerpo grande como el ganado. Además, no todas las áreas del cerebro son igualmente útiles para el diagnóstico. Jarvis et al. describen métodos de necropsia seguros y prácticos para mamíferos pequeños y grandes que minimizan el riesgo de exposición y reducen los tiempos de procesamiento2. La aplicación de estas recomendaciones de bioseguridad y la concentración en el tronco encefálico y el cerebelo mejorarán las prácticas de vigilancia moderna de la rabia animal en laboratorio.
¿Qué opciones se utilizan para la detección de antígenos virales? Para el diagnóstico rutinario de lyssavirus, se ha utilizado una prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) para la observación de inclusiones virales en el tejido del SNC desde mediadosdel siglo XX . Si bien es altamente sensible y específica, la prueba DFA requiere un microscopio fluorescente y utiliza acetona como fijador de tejidos. Patrick et al. informan el uso de una prueba inmunohistoquímica rápida y directa (drit) que se basa en la recolección del tronco encefálico, la fijación con formalina de las impresiones tisulares, el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales conjugados con biotina y la detección de inclusiones virales por microscopía óptica, en menos de 1 hora3. El drit tiene una sensibilidad y especificidad similares a las de la prueba DFA, y es adecuado para la vigilancia descentralizada y mejorada en laboratorio en condiciones de campo. Para entornos de recursos limitados, un ensayo de flujo lineal (LFA) es otro método para el diagnóstico rápido que requiere una experiencia técnica mínima, según lo informado por Mauti et al. Las tiras reactivas positivas del campo se pueden enviar a un laboratorio central para su confirmación4.
Además de la detección de antígenos, ¿son adecuados otros métodos para el diagnóstico de lisavirus? Las pruebas DFA, drit y LFA son útiles para la detección de antígenos virales en tejidos del SNC postmortem. Sin embargo, los tejidos cerebrales pueden estar descompuestos. Además, en casos sospechosos de humanos, las pruebas antemortem son más deseables y pueden incluir muestras clínicas alternativas como el LCR. Como tal, los ensayos moleculares son muy útiles para detectar pequeñas cantidades de ácidos nucleicos virales. Marston et al. y Wang et al. describen una técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real y anidada, respectivamente, respectivamente, que es rápida, sensible y específica 5,6. Esta cuidadosa atención a los detalles para minimizar la contaminación de la muestra y el diseño adecuado del cebador permiten el diagnóstico primario en todo el espectro de lisavirus divergentes.
Una vez diagnosticada, ¿es adecuada la microscopía convencional para los conocimientos modernos sobre la patobiología del lissavirus? El uso de métodos microscópicos bidimensionales por sí solo puede dar lugar a la falta de elementos críticos in vivo en el contexto y la complejidad. Sin embargo, utilizando objetivos de larga distancia de trabajo libre, los tejidos infectados por virus pueden ser visualizados por microscopía de barrido láser confocal convencional a altas resoluciones, como se detalla en Zaeck et al., para visualizar la distribución de patógenos y apreciar mejor los detalles finos sobre la patogénesis viral, la propagación, el tropismo y la neuroinvasión7.
¿Existen alternativas para medir la potencia de la vacuna contra la rabia? Los métodos actuales para medir la potencia de la vacuna contra la rabia requieren un gran número de roedores de laboratorio. Sin embargo, los costos, los intervalos de confianza y los problemas de bienestar requieren una alternativa. La glicoproteína del virus de la rabia provoca anticuerpos neutralizantes del virus después de la vacunación. Tal y como comunican Jallet y Tordo, se puede utilizar un ensayo ELISA in vitro en lugar de animales para medir el contenido relativo de las vacunas contra el virus de la rabia, utilizando anticuerpos monoclonales altamente específicos8.
¿Se puede lograr la inferencia sobre el consumo oral de cebo de vacunas por parte de la vida silvestre utilizando biomarcadores? Aparte de la vacunación parenteral de humanos y animales domésticos, la vacunación oral de mesocarnívoros silvestres ha estado operativa desde la década de 1970. Además de medir la inmunogenicidad de la vacuna o la eficacia resultante entre poblaciones de zorros, mapaches, zorrillos, etc. mediante la detección de casos, los biomarcadores se pueden usar para inferir el contacto y el consumo de cebos cargados de vacunas. Históricamente, la detección de tetraciclina incorporada a partir de cebos se realizaba en los huesos o dientes de los animales. Una alternativa a la recolección de tales tejidos duros es la medición serológica de un biomarcador diferente, como el ácido iofenoxico. Berentsen et al. informan sobre los análisis de dichos derivados en los sueros de mangosta, un importante reservorio natural en Asia, que fue introducido en la región del Caribe9. Después del consumo de cebo que contenía este biomarcador por parte de mangostas cautivas, extrajeron ácidos iofenoxicos en acetonitrilo y analizaron sueros animales mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas. Se detectó un marcado adecuado durante varias semanas después del consumo de cebo y dichos derivados podrían ser adecuados para la evaluación de campo de la absorción de cebo cargada de vacunas en animales criados en libertad.
Debido en parte a la pandemia de COVID-19 en curso, se anticipan métodos virológicos mejorados para mejorar la vigilancia del lisavirus, el descubrimiento de patógenos, el diagnóstico confirmatorio y la caracterización de variantes. Leer sobre diferentes técnicas en la literatura revisada por pares suele ser el primer paso para una persona interesada. Sin embargo, observar directamente una secuencia de pasos y escuchar el contexto de un operador experimentado, elimina los matices y las malas interpretaciones. Los protocolos de laboratorio y de campo actuales y futuros relacionados con la rabia, según lo recomendado por la OIE y la OMS, podrían beneficiarse de la recopilación de métodos visuales adicionales para ayudar a los nuevos investigadores, especialmente en los países en desarrollo.