Se desarrolló un método simple y escalable para evaluar la importancia funcional de las variantes sin sentido en Ube3a, un gen cuya pérdida y ganancia de función están relacionadas tanto con el síndrome de Angelman como con el trastorno del espectro autista.
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Artículo de método
Un método escalable basado en células para la evaluación funcional de variantes de Ube3a
En este artículo
Resumen
Resumen
El aumento del uso de la secuenciación en medicina ha identificado millones de variantes codificantes en el genoma humano. Muchas de estas variantes ocurren en genes asociados con trastornos del neurodesarrollo, pero el significado funcional de la gran mayoría de las variantes sigue siendo desconocido. El presente protocolo describe el estudio de variantes para Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 vinculada tanto al autismo como al síndrome de Angelman. La duplicación o triplicación de Ube3a está fuertemente relacionada con el autismo, mientras que su eliminación causa el síndrome de Angelman. Por lo tanto, comprender la valencia de los cambios en la actividad de la proteína UBE3A es importante para los resultados clínicos. Aquí, se describe un método rápido basado en células que empareja variantes de Ube3a con un reportero de la vía Wnt. Este ensayo simple es escalable y se puede utilizar para determinar la valencia y magnitud de los cambios de actividad en cualquier variante de Ube3a . Además, la facilidad de este método permite la generación de una gran cantidad de información estructura-función, que se puede utilizar para obtener información profunda sobre los mecanismos enzimáticos de UBE3A.
Introducción
Los recientes avances tecnológicos han hecho que la secuenciación de exomas y genomas sea rutinaria en entornos clínicos 1,2. Esto ha llevado al descubrimiento de un gran número de variantes genéticas, incluyendo millones de variantes sin sentido que típicamente cambian un aminoácido en una proteína. Comprender el significado funcional de estas variantes sigue siendo un desafío, y solo una pequeña fracción (~2%) de las variantes sin sentido conocidas tienen una interpretación clínica 1,3.
Un ejemplo destacado de este problem....
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Protocolo
1. Clonación de mutagénesis para generar variantes de Ube3a
- Clone todas las variantes de Ube3a en el plásmido pCIG2 (Figura 1A), un vector bicistrónico que contiene un promotor de β-actina de pollo y un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para la expresión de EGFP19. Las construcciones Ube3a de longitud completa contienen una secuencia de etiquetas Myc de N-terminal y se clonan en pCIG2 usando un sitio SacI de 5' y un sitio XmaI de 3'. Además, los sitios EcoRI, EcoRV y PstI naturales dentro de la secuencia de codificación Ube3a también se utiliz....
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Resultados
El cribado funcional a gran escala de las variantes sin sentido de Ube3a identifica un amplio panorama de mutaciones de pérdida y ganancia de función
Trabajos previos con mutantes Ube3a sugirieron que la respuesta Wnt puede servir como un reportero de la actividad celular de la proteína UBE3A. Estas observaciones se ampliaron y se realizaron experimentos de validación adicionales para investigar si el ensayo BAR es adecuado para informar una gama de actividades UBE3A en la célula. Pr.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí proporciona un método eficiente y escalable para evaluar la actividad enzimática de las variantes de Ube3a. Hay varios detalles técnicos que merecen una cuidadosa consideración al usar este ensayo. Una consideración es la elección de los plásmidos reporteros Wnt utilizados en este ensayo. El protocolo descrito aquí utiliza específicamente el reportero activado por β-catenina (BAR)21, un informador que contiene un concatemer de 12 elementos de respuesta del facto.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por un Premio Puente a la Independencia de la Fundación Simons (Premio SFARI # 387972; J.J.Y.), un NARSAD Young Investigator Award de la Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), una beca de investigación de la Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), y becas de investigación de la Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), la Whitehall Foundation (J.J.Y.) y el NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.05% Tripsina-EDTA (1x), rojo fenol | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb Escalera de ADN | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 pb Escalera de ADN | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Tampón para ADN ligasa T4 con 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Tampón de reacción Phusion HF | New England BioLabs | B0518S | |
| Solución antibiótica-antimicótica | Corning | 30004CI | |
| Negro/Blanco Isoplaca-96 Marco Negro Placa de pocillo | blanco PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillina Sal disódica | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Cámara de recuento de células Countess portaobjetos | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Contador de células automatizado | life technologies | Máquina contadora | |
| de células Oligonucleótidos de ADN personalizados | Tecnologías de ADN integradas (IDT) | ||
| Desoxinucleótido (dNTP) Mezcla de soluciones | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvato | Gibco | 10569044 | Medio basal para apoyar el crecimiento de HEK293T línea celular |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Sistema de ensayo indicador de luciferasa dual | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Enzima de restricción |
| Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor | Gibco | 16140071 | Suero fetal bovino |
| Platos de cultivo de tejidos tratados en superficie de Fisherbrand | Reactivo | ||
| FuGENE 6 de Fisherbrand | Promega | E2691 | |
| Tinte de carga de gel púrpura (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T células | ATCC | CRL-3216 | |
| Células ig 10B químicamente competentes de alta eficiencia | Genómica | intacta 1011-12 | Células E. coli DH10B |
| Plásmido HiSpeed Midi Kit | Qiagen | 12643 | Preparación Midi |
| plásmido pCIG2 plásmido | |||
| pGL3 BAR | |||
| Phusion HF ADN polimerasa | ADN polimerasa | M0530L | New England BioLabs |
| ProFlex | Biosistemas aplicados por tecnologías de la vida | Termociclador | |
| pTK Renilla plásmido | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini preparación |
| QIAquick Kit de extracción de gel (250) | Qiagen | 28706 | Purificación |
| de gelKit de purificación de PCR QIAquick (250) | Qiagen | 28106 | Purificación de PCR |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Enzima de restricción |
| Synergy HTX Lector multimodo | BioTek | El lector de placas ejecuta el software Gen5 v3.08 (BioTek) | |
| T4 ADN Ligasa | New England BioLabs | M0202L | Tampón de ligasa |
| TAE, Tris-Acetato-EDTA, solución 50x, electroforesis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| placa de cultivo de tejidos 96 pocillos, fondo plano | Fisherbrand | FB012931 | |
| Solución ultrapura de bromuro de etidio | Invitrogen de Thermo Fisher Scientific | ||
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Enzima de restricción |
Referencias
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Natu....
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Reimpresiones y permisos
