Un método escalable basado en células para la evaluación funcional de variantes de Ube3a

Summary

Se desarrolló un método simple y escalable para evaluar la importancia funcional de las variantes sin sentido en Ube3a, un gen cuya pérdida y ganancia de función están relacionadas tanto con el síndrome de Angelman como con el trastorno del espectro autista.

Abstract

El aumento del uso de la secuenciación en medicina ha identificado millones de variantes codificantes en el genoma humano. Muchas de estas variantes ocurren en genes asociados con trastornos del neurodesarrollo, pero el significado funcional de la gran mayoría de las variantes sigue siendo desconocido. El presente protocolo describe el estudio de variantes para Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 vinculada tanto al autismo como al síndrome de Angelman. La duplicación o triplicación de Ube3a está fuertemente relacionada con el autismo, mientras que su eliminación causa el síndrome de Angelman. Por lo tanto, comprender la valencia de los cambios en la actividad de la proteína UBE3A es importante para los resultados clínicos. Aquí, se describe un método rápido basado en células que empareja variantes de Ube3a con un reportero de la vía Wnt. Este ensayo simple es escalable y se puede utilizar para determinar la valencia y magnitud de los cambios de actividad en cualquier variante de Ube3a . Además, la facilidad de este método permite la generación de una gran cantidad de información estructura-función, que se puede utilizar para obtener información profunda sobre los mecanismos enzimáticos de UBE3A.

Introduction

Los recientes avances tecnológicos han hecho que la secuenciación de exomas y genomas sea rutinaria en entornos clínicos ^1,2. Esto ha llevado al descubrimiento de un gran número de variantes genéticas, incluyendo millones de variantes sin sentido que típicamente cambian un aminoácido en una proteína. Comprender el significado funcional de estas variantes sigue siendo un desafío, y solo una pequeña fracción (~2%) de las variantes sin sentido conocidas tienen una interpretación clínica ^1,3.

Un ejemplo destacado de este problem....

Protocol

1. Clonación de mutagénesis para generar variantes de Ube3a

1. Clone todas las variantes de Ube3a en el plásmido pCIG2 (Figura 1A), un vector bicistrónico que contiene un promotor de β-actina de pollo y un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para la expresión de EGFP¹⁹. Las construcciones Ube3a de longitud completa contienen una secuencia de etiquetas Myc de N-terminal y se clonan en pCIG2 usando un sitio SacI de 5' y un sitio XmaI de 3'. Además, los sitios EcoRI, EcoRV y PstI naturales dentro de la secuencia de codificación Ube3a también se utiliz....

Results

El cribado funcional a gran escala de las variantes sin sentido de Ube3a identifica un amplio panorama de mutaciones de pérdida y ganancia de función
Trabajos previos con mutantes Ube3a sugirieron que la respuesta Wnt puede servir como un reportero de la actividad celular de la proteína UBE3A. Estas observaciones se ampliaron y se realizaron experimentos de validación adicionales para investigar si el ensayo BAR es adecuado para informar una gama de actividades UBE3A en la célula. Pr.......

Discussion

El protocolo descrito aquí proporciona un método eficiente y escalable para evaluar la actividad enzimática de las variantes de Ube3a. Hay varios detalles técnicos que merecen una cuidadosa consideración al usar este ensayo. Una consideración es la elección de los plásmidos reporteros Wnt utilizados en este ensayo. El protocolo descrito aquí utiliza específicamente el reportero activado por β-catenina (BAR)²¹, un informador que contiene un concatemer de 12 elementos de respuesta del facto.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Tripsina-EDTA (1x), rojo fenol	Gibco	25300-054
1 Kb Escalera de ADN	Lambda Biotech	M108-S
100 pb Escalera de ADN	Lambda Biotech	M107
10x Tampón para ADN ligasa T4 con 10 mM ATP	New England BioLabs	B0202A
5x Tampón de reacción Phusion HF	New England BioLabs	B0518S
Solución antibiótica-antimicótica	Corning	30004CI
Negro/Blanco Isoplaca-96 Marco Negro Placa de pocillo	blanco PerkinElmer	6005030
Carbenicillina Sal disódica	Midwest Scientific	KCC46000-5
Cámara de recuento de células Countess  portaobjetos	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C10283
Countess II Contador de células automatizado	life technologies		Máquina contadora
de células Oligonucleótidos de ADN personalizados	Tecnologías de ADN integradas (IDT)
Desoxinucleótido (dNTP) Mezcla de soluciones	New England BioLabs	N0447S
DMEM, alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvato	Gibco	10569044	Medio basal para apoyar el crecimiento de HEK293T línea celular
DPBS (1x)	Gibco	14190-136
Sistema de ensayo indicador de luciferasa dual	Promega	E1910
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Enzima de restricción
Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor	Gibco	16140071	Suero fetal bovino
Platos de cultivo de tejidos tratados en superficie de Fisherbrand	Reactivo
FuGENE 6 de Fisherbrand	Promega	E2691
Tinte de carga de gel púrpura (6x)	New England BioLabs	B7024A
HEK293T células	ATCC	CRL-3216
Células ig 10B químicamente competentes de alta eficiencia	Genómica	intacta 1011-12	Células E. coli DH10B
Plásmido HiSpeed Midi Kit	Qiagen	12643	Preparación Midi
plásmido pCIG2 plásmido
pGL3 BAR
Phusion HF ADN polimerasa	ADN polimerasa	M0530L	New England BioLabs
ProFlex	Biosistemas aplicados por tecnologías de la vida		Termociclador
pTK Renilla plásmido
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	Mini preparación
QIAquick Kit de extracción de gel (250)	Qiagen	28706	Purificación
de gelKit de purificación de PCR QIAquick (250)	Qiagen	28106	Purificación de PCR
rCutSmart Buffer	New England BioLabs	B6004S
SacI-HF	New England BioLabs	R3156S	Enzima de restricción
Synergy HTX Lector multimodo	BioTek		El lector de placas ejecuta el software Gen5 v3.08 (BioTek)
T4 ADN Ligasa	New England BioLabs	M0202L	Tampón de ligasa
TAE, Tris-Acetato-EDTA, solución 50x, electroforesis	Fisher Scientific	BP13324
placa de cultivo de tejidos 96 pocillos, fondo plano	Fisherbrand	FB012931
Solución ultrapura de bromuro de etidio	Invitrogen de Thermo Fisher Scientific
XmaI	New England BioLabs	R0180S	Enzima de restricción