La secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo describe cómo evaluar el impacto de los xenobióticos en la alfalfa a través del análisis metabolómico no dirigido.
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Artículo de método
Colección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) en la producción de metabolitos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los exudados de raíces son el principal medio de comunicación de información y transferencia de energía entre las raíces de las plantas y el entorno circundante. El cambio en la secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo tiene como objetivo introducir directrices generales para la recolección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) (DEHP) en la producción de metabolitos. Primero, las plántulas de alfalfa se cultivan bajo estrés DEHP en un experimento de cultivo hidropónico. En segundo lugar, las plantas se transfieren a tubos de centrífuga que contienen 50 ml de agua ultrapura esterilizada durante 6 h para recoger los exudados de la raíz. Las soluciones se liofilizan en un liofilizador al vacío. Las muestras congeladas se extraen y se derivatizan con el reactivo bis(trimetilsilil)) trifluoroacetamida (BSTFA). Posteriormente, los extractos derivatizados se miden utilizando un sistema de cromatógrafo de gases acoplado con un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (GC-TOF-MS). Los datos de metabolitos adquiridos se analizan en base a métodos bioinformáticos. Los metabolitos diferenciales y las vías metabólicas significativamente modificadas deben explorarse profundamente para revelar el impacto del DEHP en la alfalfa en vista de los exudados de la raíz.
Introducción
El ftalato de di (2-etilhexilo) (DEHP) es un compuesto químico sintético que se usa ampliamente en varios plásticos y polímeros como plastificante para mejorar su plasticidad y resistencia. En los últimos años, un número creciente de estudios han sugerido que el DEHP es un disruptor endocrino y tiene efectos adversos sobre los sistemas respiratorio, nervioso y reproductivo de los seres humanos y otros animales 1,2,3. Teniendo en cuenta su riesgo para la salud, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, la Unión Europea y el Centro de Monitoreo Ambiental de Chin....
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Protocolo
El objetivo de este protocolo es proporcionar una tubería general, desde un experimento de cultivo hidropónico hasta el análisis metabolómico, cuantificando el efecto del DEHP en los exudados de la raíz de alfalfa.
1. Experimento de cultivo hidropónico
NOTA: Este protocolo presenta un ejemplo de un experimento de cultivo hidropónico de alfalfa diseñado para obtener plántulas de alfalfa (Medicago sativa) bajo el estrés de diferentes concentraciones de DEHP. Se establecieron tres tratamientos: el control sin adiciones y la solución nutritiva enriquecida con 1 mg kg-1 y 10 mg kg-1 ....
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Resultados
En este experimento, los exudados de raíz de alfalfa fueron recolectados, extraídos y analizados de acuerdo con los métodos anteriores (Figura 1). Se establecieron tres grupos de tratamiento: control, baja concentración de DEHP (1 mg L-1) y alta concentración de DEHP (10 mg L-1).
Se detectaron un total de 778 picos en el cromatógrafo del control, de los cuales se pudieron identificar 314 metabolitos según los espectros de masas. Como se muest.......
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Discusión
Este protocolo proporciona orientación general sobre cómo recolectar y medir los exudados de la raíz de la alfalfa bajo estrés DEHP, así como sobre cómo analizar los datos del metaboloma. Se debe prestar mucha atención a algunos pasos críticos en este protocolo. En experimentos de cultivo hidropónico, las plántulas de alfalfa se cultivaron hidropónicamente en botellas de vidrio llenas de soluciones nutritivas con diferentes concentraciones de DEHP. Las botellas de vidrio deben protegerse de la luz cubriéndolas con papel .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contradictorias conocidos que podrían haber parecido influir en el trabajo reportado en este documento.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado conjuntamente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41877139), los Grandes Proyectos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41991335), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2016YFD0800204), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (No. BK20161616), el Plan "135" y el Programa de Fronteras de la Academia China de Ciencias (ISSASIP1615).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Adonitol | SIGMA | ≥ 99% | |
| Semillas de alfalfa | Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangsu (Nanjing, China) | ||
| Balanza analítica | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | con 1% TMCS, v/v | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Columna cromatográfica | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μ m × 0,25 μ m) | |
| Ftalato de di(2-etilhexilo) | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Cromatografía de gases (GC) | Agilent | 7890A | |
| Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | ||
| Espectrómetro de masas(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Metanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Clorhidrato de metoxiaminatio | TCI | AR | |
| Tubo de microcentrífuga | Eppendorf | Eppendorf Calidad | 1,5 mL |
| Horno | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Piridina | Adamas | HPLC | |
| R software | software de análisis estadístico (enriquecimiento de vías, topología) | ||
| SIMCA16.0.2 | software de análisis estadístico (OPLS-DA, etc.) | ||
| Congelador de temperatura ultra baja | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasonido | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Secador al vacío | Taicang Huamei fábrica de instrumentos bioquímicos | LNG-T98 |
Referencias
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053(2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A.
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Reimpresiones y permisos
