Micromuestreo en análisis de proteínas basado en espectrometría de masas dirigida de proteínas de baja abundancia

Resumen

Se presenta un protocolo para la determinación de biomarcadores de baja abundancia a partir de muestras de suero seco ejemplificado con el péptido liberador de progastrina biomarcador (ProGRP). Las perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos se utilizan para la limpieza selectiva y el enriquecimiento de un péptido ProGRP proteotípico. El péptido capturado se analiza posteriormente mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem.

Resumen

Este documento presenta un protocolo con descripciones detalladas para la limpieza eficiente de muestras de proteínas de baja abundancia de muestras secas. Esto se realiza utilizando proteólisis basada en perlas antes de la captura de afinidad peptídica proteotípica y la determinación de la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS / MS). El procedimiento se puede aplicar tanto a muestras secas convencionales utilizando tarjetas de papel (por ejemplo, manchas de sangre seca [DBS] y manchas de suero seco [DSS]), como a muestras recolectadas con métodos de muestreo más nuevos, como el micromuestreo volumétrico de absorción (VAMS). Además de describir este procedimiento, la preparación de perlas de tripsina y perlas recubiertas de anticuerpos se presenta paso a paso en este trabajo. Las ventajas del procedimiento presentado son la proteólisis eficiente en el tiempo utilizando perlas y la limpieza robusta selectiva utilizando la captura de afinidad peptídica. El procedimiento actual describe la determinación del biomarcador de cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) de baja abundancia, péptido liberador de progastrina (ProGRP), en suero seco (tanto DSS como VAMS). Los procedimientos detallados para la preparación de cuentas facilitan la implementación del flujo de trabajo en nuevas aplicaciones u otros laboratorios. Se demuestra que los resultados pueden depender del material de muestreo; para el presente proyecto, se observaron intensidades de señal más altas para las muestras recolectadas utilizando VAMS en comparación con los DSS.

Introducción

El micromuestreo ha existido durante más de 100 años desde que Ivar Bang describió el monitoreo de glucosa de DBS en 1913¹. Después de que Guthrie y Susi introdujeron DBS en 1963 para la determinación de fenilalanina en recién nacidos², la técnica se ha extendido cada vez más. Los primeros informes de DBS para el muestreo y almacenamiento de proteínas se realizaron a principios de la década de 1970^3,4, y una década más tarde, en la década de 1980^, encontramos el primer informe de espectrometría de masas (MS) para la determinación de proteínas de DBS⁵. A pesar de esta introducción temprana, no fue hasta después del cambio de siglo que la determinación de MS de proteínas de DBS y otras técnicas de micromuestreo se generalizaron.

En un contexto clínico, es de interés determinar proteínas en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades, así como para fines de monitoreo del tratamiento y dopaje. Esta determinación específica de analitos de proteínas por MS a partir de pequeñas cantidades de muestras secas sigue siendo un desafío y, a menudo, requiere una preparación extensa de la muestra antes del análisis.

La determinación cuantitativa dirigida de proteínas por EM se realiza comúnmente aplicando el enfoque ascendente, digiriendo las proteínas a péptidos antes del análisis. Este procedimiento produce una gran cantidad de péptidos, lo que dificulta el análisis directo de la muestra biológica digerida. Una forma de evitar esto es aplicar un paso de limpieza de afinidad selectiva por adelantado del análisis de EM, ya sea antes o después de la digestión ^6,7,8. De esta manera, la proteína de interés (o su péptido proteotípico, si el paso de captura de afinidad se realiza después de la digestión) se aísla selectivamente de la matriz de la muestra antes del análisis, proporcionando límites de detección más bajos⁹.

El micromuestreo con tarjetas DBS tiene ciertas ventajas en comparación con las muestras de sangre convencionales, incluido un bajo volumen de muestra, un muestreo menos invasivo y una mayor estabilidad de almacenamiento. Sin embargo, la matriz muestral es diferente y puede introducir otros desafíos en el análisis (p. ej., matriz de muestra seca vs. líquida y sangre capilar vs. suero o plasma)^10,11. Otro desafío que se observa con las ECP es el llamado efecto hematocrito, donde el hematocrito en sangre afecta el volumen de la muestra procesada posteriormente para el análisis, y por lo tanto introduce variabilidad interindividual en el análisis¹². Las unidades de micromuestreo más nuevas, como VAMS introducidas en 2014¹³, abordan este problema recolectando un volumen fijo de sangre en lugar de una gota de sangre.

Este protocolo describe una configuración para el análisis de biomarcadores de baja abundancia a partir de micromuestras secas. Después de la elución, la muestra seca se digiere y, posteriormente, el péptido proteotípico se aísla mediante captura de afinidad peptídica. El analito modelo es el biomarcador SCLC ProGRP. Como el ProGRP no se puede determinar de manera confiable a partir de sangre total, se utilizó suero como matriz de muestra. Se muestran resultados representativos tanto de DSS como de muestras de suero recolectadas mediante VAMS.

Protocolo

Se utilizó suero de donantes de sangre sanos para la preparación de soluciones estándar. El uso de suero de donantes de sangre sanos se realizó en estricta conformidad con la legislación noruega. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos. Las muestras de suero se analizaron utilizando métodos de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. El protocolo descrito es una versión modificada del método descrito en el trabajo anterior¹⁴. Una descripción general de la composición de tampones y soluciones y cómo prepararlos se puede encontrar en la Tabla Suplementaria S1, mientras que la Tabla de materiales contiene materiales, equipos y reactivos utilizados en este protocolo.

1. Preparación de perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos

1. Calcule la cantidad de anticuerpos necesaria para preparar el número deseado de perlas. Use 1 mg de anticuerpo por cada 50 mg de perlas magnéticas.
   NOTA: Normalmente, se utilizan 20 μL de una suspensión de perlas de 20 mg/ml por muestra en experimentos posteriores (ver paso 5.1).
2. Calcule el volumen de anticuerpos necesario para preparar el número deseado de perlas.
   NOTA: El volumen de anticuerpos depende de la concentración de anticuerpos y debe calcularse para cada anticuerpo.
3. Transfiera el volumen deseado de solución de anticuerpos a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 5 ml. Como ejemplo, si la solución de anticuerpos contiene 1 mg/ml de anticuerpo, use 0,4 ml para preparar 1,0 ml de suspensión de perlas (20 mg de perlas/ml con 1 mg de anticuerpo/50 mg de perlas).
   NOTA: Los anticuerpos deben estar en un tampón libre de aminas. Utilice tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas para todas las soluciones que contengan proteínas para evitar la pérdida de analito debido a la adsorción.
4. Agregue una pequeña barra de agitación magnética a la solución de anticuerpos y ajuste el pH a 2.5 bajo agitación continua. Use un medidor de pH con un microelectrodo para medir el pH y ajustar el pH mediante la adición gradual de volúmenes definidos de HCl de 1.0 M (comience agregando porciones de 10 μL de HCl de 1.0 M y reduzca el volumen a medida que el pH se acerca a 2.5). Registre el volumen total de 1,0 M HCl necesario para ajustar el pH a 2,5.
5. Retire el microelectrodo e incube el anticuerpo acidificado en hielo en un agitador magnético durante 1 h.
   NOTA: El tratamiento ácido del anticuerpo se realiza para promover la orientación correcta de los anticuerpos en la perla. La concentración de HCl puede reducirse a 0,5 M o 0,2 M HCl, dependiendo de la concentración tampón en la solución de anticuerpos.
6. Neutralizar la solución de anticuerpos. Use un medidor de pH con un microelectrodo para medir el pH y ajustar el pH a 7 mediante la adición gradual de volúmenes definidos de NaOH de 1.0 M (comience con una porción de 10 μL y reduzca el volumen a medida que el pH se acerca a 7). Registre el volumen total de 1.0 M NaOH agregado.
   NOTA: La concentración de NaOH debe ser la misma que la concentración de HCl utilizada en el paso 1.4. El NaOH es altamente corrosivo; Use equipo de protección, incluidos guantes y protección ocular adecuada.
7. Calcule el volumen deseado de perlas magnéticas activadas por tosil que se utilizarán.
   NOTA: Por lo general, se recomienda utilizar perlas de 20 mg / ml cuando se realiza un acoplamiento a pequeña escala. Se debe usar un mínimo de 5 mg de perlas.
8. Mezcle bien la suspensión de perlas magnéticas en un mezclador de vórtice y retire un volumen que contenga la cantidad deseada de suspensión de perlas. Como ejemplo, para preparar 1 ml de suspensión de perlas, retire un volumen que contenga 20 mg de perlas (667 μL si la concentración de perlas es de 30 mg / ml).
9. Coloque la suspensión del talón en una rejilla magnética durante 1 minuto y retire el sobrenadante. Lave las perlas 2 veces con el mismo volumen de Tipo 1_H2O(667 μL si se usa una solución de perlas de 30 mg/ml para preparar 1 ml de perlas recubiertas de anticuerpos de 20 mg/ml). Mezclar con un mezclador de vórtice después de cada adición de solución de lavado y colocar en la rejilla magnética durante 1 minuto antes de retirar el sobrenadante.
10. Agregue lo siguiente a las perlas magnéticas: anticuerpo tratado con ácido, tampón de borato 0.5 M (pH 9.5) (1/5 del volumen total ya que la concentración final debe ser de 0.1 M; esto equivale a 0.2 ml para preparar 1 ml de suspensión de perlas) y tampón de acoplamiento para el acoplamiento de anticuerpos (para preparar 1 ml de perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos, el volumen del tampón de acoplamiento debe ser igual a 1 ml - volumen de anticuerpo tratado con ácido - 0.2 ml de tampón borato). Mezclar con un mezclador de vórtice.
    NOTA: El volumen de anticuerpos tratados con ácido es igual al volumen de solución de anticuerpos (0,4 ml en preparación de 1 ml de suspensión de perlas utilizando una solución de anticuerpos de 1 mg/ml) + el volumen de HCl 1,0 M utilizado para ajustar el pH a 2,5 + el volumen de NaOH de 1,0 M utilizado para ajustar el pH a 7).
    NOTA: La composición del tampón de borato 0,5 M (pH 9,5) y el tampón de acoplamiento para el acoplamiento de anticuerpos se puede encontrar en la Tabla Suplementaria S1.
11. Gire a temperatura ambiente durante la noche utilizando un mezclador de muestras de extremo a extremo, preferiblemente con rotación y vibración recíprocas.
12. Centrifugar durante 10 min a 239 × g. Coloque el tubo en el imán durante 2 minutos y retire el sobrenadante.
13. Lave las perlas 2 x 2 h y una vez durante la noche girando en el tampón de almacenamiento para las perlas de anticuerpos a temperatura ambiente utilizando un mezclador de muestras de extremo a extremo. Utilice el mismo volumen que el volumen total en el paso 1.10. Coloque el tubo en el imán durante 1 minuto y retire el sobrenadante entre cada lavado.
    NOTA: La composición del tampón de almacenamiento para las perlas de anticuerpos se puede encontrar en la Tabla Suplementaria S1.
14. Almacenar en el tampón deseado (p. ej., el mismo tampón que en el paso 1.13) utilizando la concentración de perlas madre deseada (normalmente 20 mg/ml). Conservar en la nevera.

2. Preparación de 2 mL de perlas inmovilizadas de tripsina (perlas de 20 mg/ml)

1. Agregue 20 ml de 1 mM HCl a 2 ml de perlas de agarosa activadas por NHS para lavar las perlas.
2. Mezclar y centrifugar a 2.655 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante.
3. Añadir 20 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,8). Mezclar con un mezclador de vórtice y centrifugar a 2.655 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante.
   NOTA: La composición del tampón fosfato 0.1 M (pH 7.8) se puede encontrar en la Tabla Suplementaria S1.
4. Añadir 2 ml de tripsina de 20 mg/ml (disuelta en tampón de acoplamiento frío para el acoplamiento de tripsina).
   NOTA: La composición del tampón de acoplamiento para el acoplamiento de tripsina se puede encontrar en la Tabla Suplementaria S1. Guarde el tampón en el refrigerador.
5. Incubar durante 25 min a 22 °C y 1.100 rpm utilizando un mezclador de temperatura controlada. Centrifugar a 2.655 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante.
6. Añadir 2 ml de tampón de modificación para la preparación de perlas de tripsina e incubar durante 20 min a 22 °C y 1.100 rpm utilizando un mezclador de temperatura controlada. Centrifugar a 2.655 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante.
   NOTA: La composición del tampón de modificación para la preparación de perlas de tripsina se puede encontrar en la Tabla Suplementaria S1. Guarde el tampón en el refrigerador.
7. Añadir 10 ml de tampón de bloqueo para la preparación de perlas de tripsina e incubar durante 10 min a 22 °C y 1.100 rpm utilizando un mezclador de temperatura controlada. Centrifugar a 2.655 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante.
   NOTA: La composición del tampón de bloqueo para la preparación de perlas de tripsina se puede encontrar en la Tabla Suplementaria S1. Guarde el tampón en el refrigerador.
8. Agregue 2 ml de tampón de almacenamiento, mezcle con un mezclador de vórtice y guárdelo en el refrigerador hasta que lo use.
   NOTA: La composición del tampón de almacenamiento para las perlas de tripsina se puede encontrar en la Tabla Suplementaria S1. Guarde el tampón en el refrigerador.

3. Muestreo DSS/VAMS y posterior extracción de suero seco

1. Prepare los estándares aumentando el suero con ProGRP (o la proteína de interés) en el nivel apropiado. Mantenga el volumen de pico ≤ 1% del volumen total.
   NOTA: En este caso, se utilizó una solución madre de 295 μg/ml de ProGRP en agua para la preparación de patrones de suero con púas.
2. Mezcle los estándares en un mezclador de vórtice.
3. Aplique 10 μL de suero (estándares con púas) en tarjetas DBS o permita que VAMS (10 μL) recoja 10 μL de suero siguiendo las pautas del fabricante. Para DSS, asegúrese de que el punto esté dentro del círculo punteado.
4. Dejar secar al aire a temperatura ambiente durante al menos 2 h.
5. Corte todo el punto y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 2 ml o retire el VAMS del soporte y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 2 ml.
6. Añadir 1.000 μL de solución de bicarbonato de amonio (ABC) de 100 mM. Extraiga el suero seco del spot/VAMS durante 1 h a 22 °C utilizando un mezclador con temperatura controlada a 1.000 rpm.
7. Transfiera el extracto a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 ml para la proteólisis tríptica.

4. Digestión de extractos DSS/VAMS

1. Utilizar 30 μL de perlas de tripsina (tal como se preparan en la sección 2) por muestra. Transfiera un volumen que contenga perlas de tripsina para todas las muestras a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 ml, centrifugar a 2.655 × g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
2. Lave las perlas de tripsina 2 veces con 1 ml de 50 mM ABC frío, antes de volver a suspender en el mismo volumen que se pipeteó. Centrifugar a 2.655 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante entre pasos.
3. Agregue 30 μL de perlas de tripsina lavadas a cada extracto de DSS / VAMS para iniciar la digestión.
4. Incubar durante 2 h a 37 °C y 1.000 rpm utilizando un mezclador de temperatura controlada o similar. Centrifugar a 2.655 × g durante 5 min y transferir el sobrenadante (no las perlas) a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 2,0 ml.
5. Añadir 25 μL de solución patrón interna (IS) de 14 ng/ml que contenga el péptido marcado con isótopos estables (SIL) ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂] en una solución ABC de 100 mM.

5. Captura del péptido ProGRP proteotípico utilizando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos

1. Utilizar 20 μL de perlas recubiertas de anticuerpos (20 mg/ml según lo preparado en la sección 1) por extracción. Transfiera todas las perlas recubiertas de anticuerpos a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 ml, colóquelas en el imán durante 1 minuto y retire el tampón de almacenamiento.
2. Lave las perlas recubiertas de anticuerpos magnéticos con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4, que contiene 0.05% de polisorbato 20 y 2 x 1 ml de PBS antes de volver a suspender en el mismo volumen que se pipeteó. Mezclar en un mezclador de vórtice y colocar en el imán durante 1 minuto entre intercambios de tampón.
   NOTA: PBS contiene 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 y 1.8 mM KH₂PO₄. Se recomienda preparar la solución a una concentración de 10x para una mayor estabilidad. Para la composición de 100 ml de PBS 10x, véase la Tabla Suplementaria S1. La dilución del 10x PBS 10x alcanzará un pH de ~7.4.
3. Agregue 20 μL de suspensión de perlas magnéticas lavadas a cada tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas que contenga un extracto de DSS/VAMS digerido e IS. Realizar inmunoextracción durante 1 h utilizando un mezclador de muestras de extremo a extremo a temperatura ambiente.
4. Lave las perlas magnéticas con las siguientes soluciones: 500 μL de PBS con polisorbato al 0,05% (v/v) 20, 400 μL de PBS, 300 μL de Tris HCl de 10 mM (pH 7,4) y 300 μL de 100 mM ABC.
   1. Después de la adición de cada solución de lavado, retire el tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas con perlas y solución de lavado de la rejilla del imán e invierta cuidadosamente hasta que sea homogéneo. Luego, coloque el tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas en el imán durante 30 s, invierta durante 30 s y colóquelo en el imán durante 1 minuto. Retire la solución de lavado.
   2. Haga girar la suspensión restante con una microcentrífuga. Colocar sobre el imán durante 1 min y retirar la solución de lavado restante.
5. Añadir 15 μL de ácido fórmico al 2% (v/v) en Tipo 1 H2O a cada muestra e incubar durante 5 min a₂₂°C y 1.000 rpm utilizando un mezclador de temperatura controlada, o similar, para eluyir los péptidos capturados. Colóquelo en el imán durante 1 minuto y transfiera el eluido a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 ml. Repita una vez y transfiera el segundo eluido al mismo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas que el primer eluido.
6. Añadir 20 μL de 100 mM ABC a cada eluido (volumen total de 50 μL).
7. Centrifugar (microcentrífuga) y transferir 40 μL del eluido a microinsertos para viales de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

6. Análisis por LC-MS/MS

1. Utilice un micro LC triple cuadrupolo MS con ionización por electrospray para una alta robustez.
2. Preparar el sistema LC-MS/MS para el análisis purgando las bombas con fase móvil A (20 mM FA en H2O y MeCN, 95:5 v/v) y B (20 mM FA en_H2Oy MeCN, 5:95 v/v).
3. Inserte la columna analítica (C18, diámetro interior [ID] de 50 mm x 1 mm, partículas de 3 μm).
4. Continuar preparando el instrumento para el análisis siguiendo los procedimientos de puesta en marcha para el instrumento específico.
5. En el software del instrumento, ajuste la temperatura del horno de columna a 25 °C y el caudal a 50 μL/min (fase A 100% móvil).
6. Equilibre la columna con la fase móvil A durante al menos 15 minutos.
7. Coloque las muestras en el muestreador automático.
8. Preparar el método del instrumento para el análisis del péptido tríptico específico del ProGRP ALGNQQPSWDSEDSSNFK y su IS.
   NOTA: Varios parámetros del método son específicos del instrumento y deben optimizarse en el instrumento específico utilizado. Los detalles de los parámetros del método utilizados aquí se describen en los pasos 6.9 a 6.11.
9. Para el programa de gradiente en LC, utilice los siguientes ajustes: caudal: 50 μL/min; del tiempo 0.0 al 3.0 min: fase A 100% móvil; de tiempo 3.0 a 18.0 min: ejecutar un gradiente lineal de 0% a 50% fase móvil B; del tiempo 18.0 a 18.1 min: aumentar la fase B móvil del 50% al 100%; del tiempo 18.1 al 20.0 min: 100% móvil fase B; del tiempo 20.0 a 20.1 min: disminuir la fase móvil B del 100% al 0%; de tiempo 20.1 a 30 min: fase A 100% móvil para reequilibrar la columna (use al menos 10 volúmenes de columna).
10. Para la configuración de MS/MS, ejecute MS/MS en modo positivo utilizando la configuración del instrumento que garantice una ionización eficiente. Para seguir este protocolo, use un voltaje de pulverización de +4,000 V, una temperatura capilar calentada de 270 ° C, nitrógeno como gas lámina (5 unidades arbitrarias) y argón (2 mTorr) para la fragmentación de disociación inducida por colisión (CID). Si el instrumento lo permite, dirija el flujo LC para desperdiciar los primeros 2 minutos (0-2 minutos) y el último 1 minuto (29-30 minutos) de la carrera, en lugar de hacia el MS.
11. Utilice transiciones de monitoreo de reacciones seleccionadas (SRM) para (A) el péptido de firma (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1,005.45→913.3, 1,005.45→1,028.3 y 1,005.45→1,398.5, y (B) el péptido IS SIL (ALGNQQPSWDSEDSSNF[^K_13C₆_¹⁵N₂]): 1,009.45→921.3, 1,009.45→1,036.3 y 1,009.45→1,406.5. Utilice energía de colisión optimizada (35 V en este protocolo) para todas las transiciones monitoreadas.
12. Prepare una secuencia que contenga las muestras que se ejecutarán utilizando el software disponible para su sistema LC-MS/MS. Ajuste el volumen de inyección a 10 μL.
    NOTA: Asegúrese de agregar muestras en blanco y muestras de control de calidad según sea necesario.
13. Pulse "Run sequence" (Ejecutar secuencia) en el software del instrumento para iniciar la secuencia.
14. Monitoree el área pico del péptido tríptico ALGNQQPSWDSEDSSNFK capturado por afinidad, específico de ProGRP, y su péptido IS SIL.
    NOTA: La selección y confirmación del péptido de firma, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, se describe en otra parte¹⁴.

Resultados

En la figura 1 se muestra una descripción general del flujo de trabajo analítico utilizando el muestreo DSS y VAMS. Excepto por las diferencias en el método de muestreo, los procedimientos son idénticos. Las imágenes del suero muestreado utilizando los dos métodos de muestreo se pueden ver en la Figura 2.

Ambas formas de muestreo (VAMS y DSS) son adecuadas para el muestreo de suero que contiene ProGRP. Esto se puede ver en la Figura 3 donde se muestran los cromatogramas MS del péptido proteotípico y el péptido IS SIL del muestreo DSS y VAMS. Además, se incluye el cromatograma MS después del análisis de una muestra de control compuesta por 10 μL de muestra de suero líquido con púas procesada de la misma manera que las muestras secas. Este último se diluyó en el mismo volumen que el volumen de la solución de extracción DSS / VAMS, se sometió a digestión con perlas de tripsina y se limpió mediante captura de afinidad peptídica.

Comparando el muestreo VAMS y DSS (Figura 4), VAMS proporciona una relación de área péptido/IS proteotípico más alta que DSS. Esto indica que podría haber una pérdida de la proteína diana ProGRP en el papel utilizado para DSS (celulosa pura). Cuando se compara con una muestra de control, donde el suero no se seca antes de su posterior procesamiento y análisis (Figura 4), se muestra que VAMS proporciona relaciones de área similares a las de la muestra de control (prueba t de dos colas, p≤ 0.65), lo que indica que no hay pérdida en el material de muestreo, mientras que DSS proporciona una relación de área significativamente menor (prueba t de dos colas, p≤ 0,005), indicando la pérdida del material de muestreo.

Se realizó una breve evaluación mediante VAMS. Se demostró linealidad de 10 a 1.000 ng/mL (R² = 0,9996), con un límite de detección (LOD, S/N = 3) de 6,7 ng/mL. El LOD se considera satisfactorio ya que el análisis se realizó en un cuadrupolo triple bastante antiguo (2008) con una columna ID de 1 mm. La repetibilidad de todos los niveles con un S/N > 10 también se consideró satisfactoria con una DSR entre 7% y 17% (n = 3), utilizando corrección IS.

La captura de afinidad se puede realizar tanto antes como después del paso de digestión, ya sea capturando la proteína de interés o su péptido proteotípico. El procedimiento actual describe la captura de afinidad peptídica. Una ventaja de este enfoque en comparación con la captura de proteínas es que solo se captura el péptido de interés, y se logra una limpieza de muestras aún más eficiente. Esto se ilustra en la Figura 5, que muestra un cromatograma de barrido completo más complejo con más ruido después de la captura de proteínas en comparación con la captura de péptidos. Las muestras analizadas en la Figura 5 no se muestrean utilizando el muestreo DSS o VAMS; Sin embargo, el suero también es la matriz de la muestra, y la captura de afinidad se realiza utilizando el mismo anticuerpo utilizado para la captura de péptidos en el procedimiento descrito.

Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo analítico utilizando el muestreo DSS y VAMS. Abreviaturas: DSS = punto de suero seco; VAMS = micromuestreo volumétrico de absorción; LC-MS/MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes de suero muestreadas utilizando diferentes métodos . (A) tarjeta de celulosa DBS y (B) VAMS. Abreviaturas: DBS = mancha de sangre seca; VAMS = micromuestreo volumétrico de absorción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cromatogramas MS representativos del péptido proteotípico y del péptido IS SIL después del muestreo DSS y VAMS, así como para una muestra de suero con púas añadida directamente a la solución de extracción. Los cromatogramas MS muestran muestras de suero de 10 μL enriquecidas con 1,5 μg/ml de ProGRP y aplicadas a (A) VAMS, (B) la tarjeta de muestreo de celulosa (para DSS), o (C) directamente al tampón de extracción (muestra de control). Veinticinco microlitros de 14 ng/mL son péptidos SIL añadidos a todas las muestras antes de la captura de afinidad peptídica. Abreviaturas: DSS = punto de suero seco; VAMS = micromuestreo volumétrico de absorción; MS = espectrometría de masas; ProGRP = péptido liberador de progastrina; IS = estándar interno; SIL = isótopo estable marcado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resultados representativos de la relación de área ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS para muestras de suero enriquecidas con ProGRP y aplicadas (10 μL) a VAMS, DSS o directamente a la solución de extracción (muestra de control). La concentración de ProGRP es de 1,5 μg/ml, n = 4 para cada condición; Se añaden 25 μL de péptido SIL de 14 ng/mL a todas las muestras antes de la captura de afinidad peptídica. *indica que la relación de área es significativamente diferente de las muestras aplicadas a VAMS (prueba t de dos colas, p≤ 0,005). Las barras de error son ± desviación estándar. Abreviaturas: DSS = punto de suero seco; VAMS = micromuestreo volumétrico de absorción; ProGRP = péptido liberador de progastrina; IS = estándar interno; SIL = isótopo estable marcado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Comparación de cromatogramas de pico base (análisis Orbitrap de escaneo completo) después de la extracción de proteínas intactas (azul) y la extracción del péptido epítopo proteotípico (rojo). Los cromatogramas iónicos extraídos del péptido epítopo proteotípico (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45) se muestran a la derecha. Se utilizó como muestra suero enriquecido con 150 ng mL⁻¹ ProGRP. Esta figura se reproduce de Levernæs et ^al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria S1: Una visión general de la composición de tampones y soluciones y cómo prepararlos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo descrito contiene información sobre cómo llevar a cabo varios pasos importantes en el análisis de biomarcadores de baja abundancia a partir de micromuestras secas (DSS y VAMS), incluida la preparación de perlas de tripsina y perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Basándonos en la experiencia previa, siempre tratamos el anticuerpo con ácido antes de la inmovilización del cordón para mejorar la orientación de los anticuerpos¹⁵.

Uno de los pasos críticos en este procedimiento es la selección del formato de micromuestreo más adecuado. Primero, se debe considerar si el analito en cuestión se puede determinar a partir de sangre total, o si la concentración está influenciada por las células sanguíneas y debe determinarse en suero o plasma (como para el analito modelo, ProGRP).

Tanto los enfoques basados en papel como en polímeros tienen ventajas y limitaciones; para ProGRP, VAMS proporciona una clara ventaja con respecto a la recuperación del analito después de la extracción del muestreador. Sin embargo, esto probablemente se puede optimizar utilizando una solución de extracción diferente para las muestras DSS. No obstante, es importante tener en cuenta esta posible interacción entre el analito y el material de muestreo, ya que podría dar lugar a una mayor variación analítica y a límites de detección más elevados. Como el IS utilizado es un péptido SIL y se agrega por primera vez después de la digestión, IS corrige los pasos posteriores a la digestión (por ejemplo, extracción de afinidad y análisis LC-MS / MS). La corrección del IS no es posible para la extracción de DSS/VAMS y la etapa de digestión.

En el procedimiento se utilizan dos tipos de perlas: perlas de tripsina para la digestión después de la extracción de la muestra de suero del muestreador y perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos para la captura del péptido proteotípico después de la digestión. Una razón importante para usar perlas de tripsina, además de acelerar la digestión, es minimizar la actividad residual de tripsina en la muestra durante la captura de afinidad. Esto es importante para evitar la proteólisis tríptica del mAb durante la captura de afinidad.

Las perlas de agarosa se utilizaron para la preparación de las perlas de tripsina, mientras que las perlas magnéticas se utilizaron para la preparación de las perlas recubiertas de anticuerpos. Las perlas de agarosa son menos costosas que las perlas magnéticas, pero tienen la limitación de que la separación de las perlas de la solución requiere centrifugación. Esto hace que la separación de perlas y sobrenadante sea menos eficiente que cuando se usan perlas magnéticas. Además, la automatización del flujo de trabajo es difícil utilizando perlas de agarosa. Sin embargo, las perlas magnéticas activadas por NHS están disponibles y se pueden utilizar para un flujo de trabajo de preparación de muestras más ágil y automatizable.

El micromuestreo es una tendencia importante en el bioanálisis tanto de fármacos como de biomarcadores. Un desafío con el enfoque actual es la cantidad limitada de volumen de muestra (10 μL), que puede ser de particular importancia en la determinación de analitos de muy baja abundancia como ProGRP (nivel de pg / ml bajo ng / ml). Sin embargo, este desafío puede evitarse utilizando equipos analíticos de última generación. Para estos analitos de baja abundancia, la elección de la preparación de la muestra es crucial, y la limpieza selectiva de la muestra a través de la captura de afinidad basada en anticuerpos es la más a menudo necesaria. Como se ha demostrado que la captura de péptidos proporciona extractos más limpios y límites de detección más bajos que la captura de proteínas (utilizando el mismo anticuerpo)¹⁴, el presente método se centra en este enfoque en combinación con el micromuestreo. Otra ventaja del enfoque de captura de péptidos es que el péptido IS SIL también corrige el paso de captura de afinidad.

En este trabajo, se utilizó un anticuerpo dirigido a una proteína para la captura de péptidos. Esta es una ventaja ya que la disponibilidad de anticuerpos listos para usar dirigidos a proteínas es mayor que la de anticuerpos estándar dirigidos a péptidos proteotípicos. Sin embargo, para que un anticuerpo antiproteico capture eficientemente un péptido proteotípico, el epítopo debe estar intacto después de la digestión de proteínas. Además, para muchos anticuerpos, el epítopo exacto no se conoce, lo que hace que la búsqueda de un anticuerpo antiproteico sea tediosa. Esto limita el número de anticuerpos antiproteicos disponibles aplicables para la captura de péptidos. El procedimiento descrito se demuestra utilizando suero como matriz y ProGRP como analito objetivo. El procedimiento está destinado a ser aplicable a otras matrices y otros analitos objetivo. En lugar de utilizar un anticuerpo antiproteico disponible comercialmente para la captura de afinidad del péptido proteotípico, también es posible utilizar anticuerpos antipéptidos hechos a medida. La eficiencia de limpieza de la captura de péptidos en comparación con la captura de proteínas se ilustra en la Figura 5. Al intercambiar las perlas de agarosa utilizadas para la preparación de perlas de tripsina por perlas magnéticas, el procedimiento también debe ser compatible con las estaciones de trabajo de preparación robótica de muestras del mercado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido acético N-hidroxisuccinimida éster	Carbosynt (Staad, Suiza)	FA33719	Almacenar en el congelador por debajo de -20 & grados; C
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%)	Innovagen (Lund, Suecia)	No aplicable	Almacenar en congelador por debajo de -20 ° C
Bicarbonato de amonio BioUltra (≥ 99.5% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	09830-500G
Aquasil C18 columna, 3 µ m, 50 mm x 1 mm	Thermo scientific (Waltham, MA, EE. UU.)	77503-051030	Columna analítica compatible con la fase móvil 100% acuosa
Benzamidina (≥ 95.0%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	12072	Almacenar en el refrigerador a 2-6 & grados; C
Cloruro de calcio dihidratado  (≥ 99% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU	.) 223506-500G
Centrífuga 5804	Eppendorf (Hamburgo, Tyskland)	5804000010
Isoforma clonada de ProGRP 1	Hospital de radio, Hospital Universitario de Oslo (Oslo, Noruega)	No aplicable	Almacenar en congelador por debajo de -20 ° C
Hidrogenofosfato disódico dihidratado (pro análisis)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU	.) 30435-500 G
Hidrogenofosfato disódico dodecahidrato (análisis profesional)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06579.0500
Dynabeads M-280 tosilactivado 10 mL	Invitrogen (Carlsbad, EE. UU.)	14204	Almacenar en la nevera a 2-6 & grados; C
DynaMag-2	Invitrogen (Carlsbad, EE. UU.)	123-21D
Etanolamina (análisis profesional, ≥ 99%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	#02400
Ácido fórmico (≥ 99%) para LC-MS	VWR International (Radnor, PA, EE. UU.)	84865.260
Tarjeta de celulosa FTA DMPK-C	Whatman (Kent, Reino Unido)	WB129243	Tarjeta
DBSViales de HPLC, vidrio transparente, 1,5 mL, 32 x 11,6 mm, Clean Pack	Nerliens Meszansky (Oslo, Norge)	LPP 11 09 0519
Mezclador de muestras Hulamixer	Invitrogen (Carlsbad, EE. UU.)	101561503016	Mezclador de muestras con mezcla de extremo a extremo y rotación y vibración recíprocas
Suero humano de donantes de sangre sanos Banco de	Sangre, Ullevå l, Hospital Universitario de Oslo (Oslo, Noruega)	No aplicable	Almacene en el congelador por debajo de -20 ° C
Ácido clorhídrico humeante 37% (Enclave para análisis)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.00317.1000
Sistema LC-MS/MS: Sistema Ultimate 3000 (Muestreador automático, WPS-3000TRS; Microbomba, LPG-3400M; Gestor de caudal, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) y acceso TSQ Quantum. Controlado por Xcalibur 2.2 SP1.48	Thermo scientific (Waltham, MA, USA)	No aplicable
LiChrosolv Acetonitrilo hypergrade para LC-MS	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.00029.2500
LL Biotrode, Electrodo de vidrio combinado	Metrohm (Herisau, Sveits)	6.0224.100
Agitador magnético, Tipo M10	Franz Morat KG (Eisenbach, Alemania)	10236
Microinsertos, vidrio (31 x 6 mm, 0,1 mL)	VWR International (Radnor, PA, EE. UU.)	548-0006
MilliQ integral 3 con Q-POD	Merck Millipore (Molsheim, Francia)	ZRXQ003T0	Para la producción de
anticuerpo monoclonal de agua de tipo 1 M18	Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Noruega)	No aplicable	Almacenar en la nevera a 2-6 ° C
Micromuestreador Neoteryx Mitra (10 μ L) 4 muestreadores	Clamshell Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)	NC1382947
perlas de sefarosa activadas por el NHS 4	Sigma Aldrich de flujo rápido (St. Louis, MO, EE. UU.)	GE17-0906-01	Perlas de agarosa, almacene en el refrigerador a 2-6 & deg; C
Optifit, Puntas de pipeta de recarga, 10 mL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	613-2911
Optifit, Puntas de pipeta de recarga, 10 μ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	790012
Optifit, Puntas de pipeta de recambio, 1.000 μ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	791002
Optifit, Puntas de pipeta de recambio, 200 μ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	790202
Electrodo de vidrio de pH	Metrohm (Herisau, Sveits)	6.0233.100
Medidor de pH 744	Metrohm (Herisau, Sveits)	8.744.1003
Pipeta 10 mL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725090
Pipeta m10 & L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725020
Pipeta m100 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725050
Pipeta m1.000 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725070
Pipeta m20 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725030
Cloruro de potasio (KCl ≥ 99,9%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.)	P-3911
Dihidrogenofosfato de potasio (pro análisis)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.04873.0250
Proteína LoBind Eppendorf tubo 0,5 mL	Eppendorf (Hamburgo, Tyskland)	525-0133 (0030 108.094)
Proteína LoBind Eppendorf tubo 1,5 mL	Eppendorf (Hamburgo, Tyskland)	525-0132 (0030 108.116)
Proteína LoBind tubo Eppendorf 2,0 mL	Eppendorf (Hamburgo, Tyskland)	525-0134 (0030 108.450)
Proteína LoBind tubo Eppendorf 5,0 mL	Eppendorf (Hamburgo, Tyskland)	525-0792 (0030108.302)
Tijeras	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, Estados Unidos)	Z186716-1EA
Azida de sodio (BioUltra; ≥ 99.5%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	71289-5G
Cloruro de sodio (para análisis)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06404.1000
Dihidrogenofosfato de sodio monohidratado (pro análisis)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06346.0500
Hidróxido de sodio (AnalaR NORMAPUR)	VWR International (Radnor, PA, EE. UU.)	28244.295
Tetraborato de sodio decahidratado (≥ 99. %)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	S9640-500G
Spectrafuge Mini Centrífuga	LABNET International (Edison, NJ, EE. UU.)	C1301
Imán agitador, 25 mm x 6 mm Ø, circular	Leybold (Colonia, Alemania)	666  851
Estuardo  Scientific Mezclador de vórtice SA8	Stuart (Staffordshire, Reino Unido)	Z648531-1EA
Tubos de centrífuga SuperClear (15 mL)	VWR International (Radnor, PA, EE. UU.	)525-0150
Tubos de centrífuga SuperClear (50 mL)	VWR International (Radnor, PA, EE. UU.)	525-0155
Thermomixer comfort 1,5 mL	Eppendorf (Hamburgo, Tyskland)	53,55,27,831	Mezclador de temperatura controlada
Base de Trizma (grado de reactivo, ≥ 99.0 %)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	T6066	Tris(hidroximetil)aminometan (tris)
Trizma HCl (grado de reactivo, ≥ 99.0%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	T3253-100G	Tris(hidroximetil)aminometán HCl (tris HCl)
Tripsina (tratado con TCPK de páncreas bovino, 10,000-15,000 unidades BAEE/mg de proteína)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	T8802	Almacene en el congelador por debajo de -20 & grados; C
Tween 20	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	P7949-500ML	polisorbato 20
Pinzas	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	TEM-78511-27
Tapas de viales, blancas, 9 mm	Nerliens Meszansky (Oslo, Norge)	LPP 09 15 0981
Micromuestreador Mitra con tecnología VAMS (Micromuestreo volumétrico de adsorción), 10 µ L, concha de 4 muestras	Neoteryx (Torrance, CA, EE. UU.)